Введение к работе
Актуальносгь темы. Среди продовольственных культур капуста занимает 25-е место в міфе, объем мировых посевных площадей составляет более 3 млн. га. Особенно широко возделывают её в странах с умеренным климатом. В России капусту выращивают повсеместно (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006). Капуста белокочанная является ценным пищевым и диетическим продуктом питания. Она обладает богатым химическим составом. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ, и, в частности, холестерина (Петрушко Ю.Н., 2003). Получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного овощеводства. Однако многочисленные заболевания, которым подвержена капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции.
Гриб Plasmodiophora brassicae Wor. (возбудитель килы крестоцветных) — один из самых распространенных патогенов капусты. В России встречается в большинстве областей страны. Болезнь приводит к снижению урожая на 10-60% и более. В годы сильного проявления болезни недобор урожая капусты на зараженных килой участках составляет 400-500 центнеров с гектара (Мазин В.В., Проценко Е.П., 1976; Ахатов А.К. и др., 2006).
Фу'ЗарИОЗ (ИЛИ фуЗарПОЗНОС уВЯДаНИС;, ВЫЗЫБабМОе ГрїіОаШТ рОДй jUSlI-
rium — заболевание капусты, поражающее корневую и сосудистую систему растений. Гибель растений от фузариоза в некоторые годы может достигать 20-25% (Ахатов А.К. и др., 2006). Болезнь наиболее вредоносна в районах с высокой температурой почвы.
Получение устойчивых к киле и фузариозу сортов и гибридов капусты белокочанной является приоритетной задачей отечественной селекции. Генетическая инженерия обладает широкими возможностями в защите растений, поскольку её методы позволяют включать чужеродные гены в геном растений. Этот процесс называют «генетической трансформацией». Трансформацию растений осуществляют различными способами, однако наиболее распространен ным, эффективным и апробированным на разнообразных видах растений является метод агробактериальной трансформации с помощью модифицированных штаммов Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes.
Методом генетической трансформации уже получены растения, устойчивые к вирусным, бактериальным и грибным патогенам, насекомым-вредителям; абиотическим факторам, имеющие измененное время созревания плодов; пищевую ценность, улучшенный внешний вид плодов и вкус и т.д. (ГликБ., Пастернак Дж.,2002). В связи с этим, получение трзнсгенных форм капусты белокочанной, устойчивых к фнтопатогенам (PL brassicae Wor., Fusarium asp. и др.), является актуальной и своевременной задачей селекции.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось получение трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wo г., Fusarium ssp.).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Оценить морфогенетический потенциал различных линий и сортов капусты белокочанной;
Подобрать оптимальное сочетание регуляторов роста в питательной среде для повышения регенерационной активности капусты белокочанной;
Подобрать оптимальные условия для трансформации капусты белокочанной с помощью Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой ген т/3 (кодирует МРЗ-белок, гомологичный пептидил-пролил-г/г<сУот/рд//с-изомеразам FKBP-типа) и маркерный ген npt //(кодирует неомицинфосфотраксферазу II);
Провести агробактериальную трансформацию капусты белокочанной и получить растения-регенеранты;
Оценить полученные траисгенные растения поколения Т0 с помощью молекулярно-биологического анализа (ПЦР);
Провести реципрокнык скрещивания трансгенных растений поколения Т0 и установить характер наследования трансгена в семенном потомстве (поколение Т();
Оценить устойчивость полученных трансгенных растений поколения Т| к киле и фузариозу на селективных фонах.
Объект исследований - технология получения трансгенных растений капусты белокочанной со встроенным геном mfj, придающим устойчивость к фитопатогенам (PL brassicae Wor., Fusarium ssp.).
Предмет исследований - семядоли и гипокотильные сегменты проростков 2 линии (33, 34) и 4 сортов (Подарок, Касатка, Малайка, Горлица), растения-регенеранты и трансформанты капусты белокочанной.
Научная новизна.
Дана характеристика морфогенетического потенциала 6 селекционных образцов среднепоздней капусты белокочанной и подобрано оптимальное сочетание и концентрация регуляторов роста для их регенерации в культуре in vitro. Впервые с помощью векторной конструкции с геном т/3 проведена агробактериальная трансформация капусты белокочанной и получены транс-генные формы, которые характеризуются повышенной устойчивостью к киле (PL brassicae Wor.) и фузариозу (Fusarium ssp.) и могут быть использованы как исходный материал в дальнейшей селекционной работе. Определен характер наследования трансгена в поколении Ть а также устойчивость транс-
генных растений капусты белокочанной к киле (PL brassicae War.) и фуза-риозу (Fusarium ssp.).
Практическая ценность.
Оптимизированы условия регенерации и агробактериальной трансформации капусты белокочанной (сочетание и концентрация регуляторов роста, плотность суспензии агробактерий, способ поранения эксплантов, длительность икокулирования и сокультивирования эксплантов с агробакте-рией, оптимальный возраст экспланта и длительность его прекультивирова-ния), которые могут быть использованы при размножении этой культуры в условиях in vitro и для создания генетически модифицированных растений капусты белокочанной с определенными хозяйственно-ценными признаками. Получено 12 трансгенных форм сорта Малайка со встроенным геном т/3, которые характеризуются повышенной на 23-44% устойчивостью к киле (PL brassicae Wor.) и на 9-23% — к фузариозу (Fusarium ssp.) по сравнению с исходным (нетрансгенным) образцом, которые могут быть использованы в селекции капусты белокочанной.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на II Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биооезопасносги» (Москва, 2007), IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Москва, 2008), IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти Г.С. Муромцева (Москва, 2009); на Международной научно-практической конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009), V Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии а инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2009)
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
оптимизированные условия регенерации капусты белокочанной в условиях in vitro на основе гипокотильных сегментов и семядолей;
оптимизированные условия генетической трансформации капусты белокочанной с использованием Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+1 ЗК, несущим маркерный (npt ІГ) и целевой (inf3) ген, кодирующий МРЗ-белок;
трансгенные растения капусты белокочанной поколений То и Ть несущие целевой ген т/3 и маркерный ген npt II и отличающиеся повышенной устойчивостью к киле (PL brassicae Wor.) и фузариозу (Fusarium asp.).
Объем и структура диссертации
