Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Использование молекулярно-генетических маркеров для изучения генетического разнообразия растений 9
1.2 Микросателлитные маркеры 22
Глава 2. Материалы и методы 34
Глава 3. Экспериментальные результаты 42
3.1 Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои 42
3.2 Полиморфизм сортов сои по микросателлитным локусам 51
3.3 Анализ генетического разнообразия коллекции генотипов сои на основе полиморфизма микросателлитных локусов 58
3.3.1. Анализ генетического разнообразия сортов сои селекции ВНИИМК 58
3.3.2 Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров 66
3.3.3. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК дикорастущей сои 71
3.3.4. Анализ исходных сортов и их полиплоидных и
реплоидных форм по микросателлитным локусам 73
3.3.5 Анализ дискриминационного потенциала маркерной системы для коллекции генотипов сои 75
3.4. Анализ наследования микросателлитных локусов 79
Выводы 85
Рекомендации для селекционной практики 86
Список литературы 87
- Использование молекулярно-генетических маркеров для изучения генетического разнообразия растений
- Микросателлитные маркеры
- Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои
- Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров
Введение к работе
Актуальность темы. Соя - это культурное растение, по последней классификации, относящееся к семейству Бобовые (Leguminosae (Fabaceae)), подсемейству Мотыльковые (Papilionaceae), трибе Фасолевые (Phaseoleae), подтрибе Глициниевые (Glycininae Benth.), роду Соя (Glycine), подроду Soja, виду G.max, подвиду^р.) manshurica. (Зеленцов, Кочегура,2006).
В мировом производстве белка соя является ведущей зернобобовой культурой. Среди всех сельскохозяйственных культур ей нет равных по богатству и разнообразию содержащихся в зерне полезных химических веществ. Это самая высокобелковая культура из всех зернобобовых. Содержание его в зерне достигает 45%. Причем соевый белок наиболее близок по аминокислотному составу к животному и в то же время дешевле в 10-12 раз (Баранов, 2002; Петибская и др, 2001). В нем имеются все незаменимые аминокислоты в количестве достаточном, для того, чтобы заменить значительную часть белка животного происхождения. Это особенно актуально в связи с растущим населением планеты.
Вторым ценным компонентом соевого зерна является масло, содержание которого, в среднем, составляет 21,5 %. Из всех растительных масел соевое является самым биологически активным, так как содержит около 55% линолевой, 25%) олеиновой и 8% линоленовой кислоты. Кроме этого, важно не только высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот, но и оптимальное их соотношение (Петибская и др., 2001).
Благодаря своему уникальному составу, а так же экономичности, небольшой энергоемкости производства, универсальности применения, эта культура имеет значительный вес в национальных продовольственных программах ряда стран. В Краснодарском крае распространены сорта сои селекции ВНИИМК и возделывается на больших площадях. Ежегодно регистрируются новые улучшенные сорта. На современном этапе в успешной реали-
зации селекционных программ большое значение имеет идентификация генотипов, поэтому актуальной задачей является паспортизация сортов, гибридов и исходных форм в соответствии с международными нормами.
Для сои характерно большое разнообразие морфологических признаков. С их помощью в настоящее время оценивают генофонд популяций, уровень изменчивости, генетическое разнообразие и др. Но иногда их бывает недостаточно для того, чтобы идентифицировать селекционный материал. Проявление морфологических признаков часто существенно зависит от условий выращивания. При этом фенотипическое выражение признака уже может не соответствовать нужному генотипу, что приводит к некорректным выводам. В результате, заключение о принадлежности данной партии семян или посева к тому или иному сорту можно сделать лишь с определенной долей вероятности. К тому же это требует дополнительных затрат времени и средств. Еще одним существенным недостатком морфологических маркеров является то, что многие из них полигенны по своей природе.
Наиболее удобными для описания генотипов являются молекулярно-генетические маркеры, то есть запасные белки, изоферменты и полиморфные фрагменты ДНК. Они в меньшей мере подвержены фенотипической изменчивости и, в большинстве случаев, имеют кодоминантный тип наследования. На их основе проводится биохимическая паспортизация сортов и гибридов многих сельскохозяйственных культур. Данные биохимической паспортизации можно использовать при регистрации сортов и гибридов, а так же для защиты прав селекционеров.
Кроме этого, для селекционеров большое значение имеет информация о степени генетического родства исходного материала, того разнообразия селекционных форм различного происхождения, которые используются в селекционном процессе. Молекулярно генетические маркеры — самый современный инструмент получения информации такого рода. Они позволяют
классифицировать сорта, линии и селекционные формы в зависимости от их генетических взаимоотношений.
Еще одной задачей, которая успешно решается с использованием молекулярно генетических маркеров — это маркирование отдельных генов, контролирующих качественные признаки, и групп генов, контролирующих количественные признаки.
Соя во многом уникальная культура. Уникальна она и в том, что из всех типов молекулярно-генетических маркеров высокий уровень полиморфизма удалось выявить только по микросателлитным л оку сам (Глазко и др. 1999).
Микросателлиты представляют собой простые, наиболее доступные, удобные и относительно недорогие маркеры, пригодные, прежде всего, для идентификации генотипов. Их ко доминантный тип наследования позволяет отличать гомо- и гетерозиготные растения. Это имеет большое значение для раннего распознавания ложных гибридов сои, что позволяет существенно экономить время, при создании новых селекционно-значимых форм.
Сорта сои в настоящее время проходят регистрацию только на основании морфологических данных. Такую ситуацию нельзя признать удовлетворительной, так как существуют сорта неотличимые по морфологическим признакам. Микросателлитные маркеры позволяют дифференцировать биотипы, отличающиеся от исходных сортов или линий небольшим количеством генов, что не всегда заметно фенотипически.
Поэтому целью наших исследований является изучение молекулярно-генетического полиморфизма микросателлитных локусов сои и создание на этой основе системы маркеров пригодной для идентификации и паспортизации генотипов.
В задачи исследований входило:
Оптимизировать условия проведения ПЦР-анализа ДНК для образцов сои.
Апробировать праймеры на микросателлитные последовательности ДНК сои.
Оценить степень полиморфизма микросателлитных локусов ДНК сои и создать систему маркеров для дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК.
Составить на основе созданной системы микросателлитных маркеров генетические формулы сортов сои селекции ВНИИМК
Определить тип наследования выявленных полиморфных локусов ДНК и выделить пригодные для идентификации гибридов сои.
Научная новизна исследований:
установлен уровень полиморфного информационного содержания 10 микросателлитных локусов ДНК у 58 генотипов сои разного происхождения. Показана степень генетического родства этих генотипов на основе полиморфных локусов;
выделены 9 микросателлитных локусов ДНК с уровнем полиморфизма, пригодным для молекулярно-генетической дифференциации изученной группы генотипов, в том числе 26 сортов сои селекции ВНИИМК;
впервые создана система маркеров и составлены молекулярно-генетические формулы 26 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК;
установлен тип наследования 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои Fj;
выделены три микросателлитных локуса ДНК с кодоминантным типом наследования, пригодные в качестве маркеров для идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК.
Основные положения выносимые на защиту:
Впервые создана система маркеров и составлены молекулярно-генетические формулы 26 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК;
Установлен тип наследования 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои первого поколения: шесть имеют доминантный тип, три - кодоминантный.
Предложен способ определения гибридности у гибридов сои на основе трех полиморфных микросателлитных локусов с кодоминантным типом наследования.
Практическая значимость работы. Предлагаемая маркерная система на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет надежно дифференцировать генотипы сои, выявлять генетическую однородность сортов. Показана перспективность этой системы для идентификации, паспортизации и сертификации сортов сои. Предложен способ идентификации гибридов сои. Разработаны молекулярно-генетические формулы культурных сортов сои, которые можно использовать для их паспортизации и сертификации.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе в реферируемых изданиях, утвержденных ВАК - одна.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика B.C. Пустовойта (ВНИИМК, Краснодар, 19-22 июля, 2006); 8-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 7-8 декабря, 2006), 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», посвященной 95-летию со дня осно-
вания ВНИИМК (Краснодар, 27-29 марта, 2007), 7-й молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 4 апреля, 2007), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им Н.И. Вавилова (Алушта, Украина, 24-28 сентября, 2007), II Вавиловской международной конференции (Санкт-Петербург, 26-30 ноября, 2007).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, содержит 16 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 176 наименований, в том числе, 85 иностранных авторов.
Использование молекулярно-генетических маркеров для изучения генетического разнообразия растений
В практике селекционной работы при создании сортов и гибридов различных сельскохозяйственных культур наличие у генотипов четких отличительных признаков способно значительно облегчить труд селекционеров. Помимо морфологических признаков в настоящее время широко применяются молекулярно-генетические маркеры. Успехи генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров.
До недавнего времени изучение изменчивости и наследственности велось только при помощи анализа внешних, то есть морфологических признаков, которые использовались в качестве генетических маркеров. С использованием маркеров этого типа, были открыты фундаментальные менделевские законы, а впоследствии, созданы первые генетические карты. Но количество информативных морфологических маркеров весьма ограничено. Кроме того, селекция в большинстве случаев ведется на такие количественные признаки, как урожайность, скороспелость, содержание белка или масла и др. Эти признаки контролируются, как правило, большим количеством генов, и их фено-типическое выражение существенно изменяется в зависимости от условий окружающей среды. Более удобными и достаточно универсальными являются молекулярно-генетические маркеры.
Это новый тип маркеров, позволяющих анализировать генетический полиморфизм на уровне генов. Требования, предъявляемые к ним достаточно велики. Молекулярные маркеры должны иметь высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, достаточный уровень частоты встречаемости и равномерное распределение в геноме, селективно-нейтральное поведение, высокую воспроизводимость результатов, возможность легкого обмена данными между лабораториями и т.д.
Поиск молекулярных маркеров, отвечающим всем этим требованиям, начался в 60-х годах прошлого столетия. Вначале исследователи обратили внимание на белки, как источник генетического полиморфизма. В 70-х годах XX века были разработаны методики, основанные на электрофоретическом разделении запасных белков, с последующим их окрашиванием специфическими красителями (Остерман, 1981). Использование запасных белков семян позволило оценить уровень полиморфизма почти всех основных сельскохозяйственных культур (Конарев, 1983; Созинов, 1987; Конарев и др., 2000). И в 1980 году на 19-ом конгрессе ISTA (International Seed Testing Association) был рекомендован к использованию метод сортовой идентификации и регистрации по электрофоретической подвижности запасных белков семян. В 1983 году этот метод был принят, как стандартный для идентификации сортов пшеницы и ячменя, а затем биохимическая идентификация сортов пшеницы, райграса, ячменя, гороха, кукурузы и овса была включена в Международные правила семенного контроля (Конарев, 2002).
Запасные белки, благодаря относительной простоте выделения и фракционирования, открыли путь к усовершенствованию селекционного процесса. При их помощи стало возможным не только дифференцировать селекционный материал, но и маркировать некоторые сцепленные с ними хозяйственно-ценные признаки для таких культур как пшеница (Конарев, 1980; Ал-патьева, 2002), рожь (Пенева и др., 2002), овес (Зеленская и др., 2004), подсолнечник (Попереля и др, 1994, 2000; Anisimova et al., 1994; Анисимова, 2002), кукуруза (Сидорова и др., 2004), кормовые травы (Конарев и др., 2002) и другие. В ВИРе для многих злаковых культур составлены электронные каталоги белковых формул, которые используются для сохранения и поддержания образцов коллекций, сортов, биотипов, линий (Конарев, 1998). С помощью запасных белков был картирован ген Rrsl4, контролирующий устойчивость ячменя к патогену Rhynchosporium secalis (Garvin,2000). А так же с использованием белковых маркеров построена генетическая карта Pinus pinaster (Plomion, 1995).
Однако, белковые маркеры имеют ряд существенных ограничений. Не все группы сцепления могут быть охвачены этими маркерами, так как не весь геном, а всего лишь его треть, кодирует и экспрессирует какие-либо белки. И это приводит к тому, что изменения в некодирующей части генома или регу-ляторных районах генов не могут быть обнаружены белковыми маркерами (Чесноков, 2005; Сингер, Берг, 1998). Возможности белковых маркеров ограничены еще и низким уровнем полиморфизма в популяциях культурных растений, и ограничениями в выборе биологического материала и времени его сбора (Сулимова, 2007). Тем не менее, этот метод используется в идентификации сортов в качестве дешевого и простого экспресс-анализа больших количеств семян (преимущественно злаковых) (Алпатьева, 2002; Конарев, 2002,6).
Изучались белковые маркеры и у сои. Основной компонент белка семян культурной сои Glycine max (L.) Merr. - глицинии, или 11 S-белок представляет собой комплекс шести субъединиц, каждая из которых в свою очередь состоит из двух полипептидов - кислой и основной субъединицы (Stas-wick et al., 1981). Глицинии, а также другой преобладающий белок соевых семян - конглицинин, явились в 80-е годы объектами интенсивных исследований (Goldberg et al.,1981; Staswick et al., 1982). И в результате авторами был сделан вывод, что у культурной сои аминокислотный и субъединичный состав глицинина оказался весьма консервативным. То есть различия наблюдаются только между видами сои (Алексеенко и др., 1985). Интересно, что постоянен субъединичный состав глицинина еще только у одного дикорастущего вида сои G. ussuriensis. Неясно, какой генетический фактор мог обеспечить такую консервативность.
Микросателлитные маркеры
ДНК-технологии в настоящее время позволяют на новом уровне решать ряд практических вопросов селекции и семеноводства. Во-первых, необходима точная и надежная оценка генетического разнообразия исходного селекционного материала, характеристика существующего генофонда, определение степени родства сортов. Во-вторых, для повышения эффективности гибридной селекции сельскохозяйственных культур, помимо необходимости оценки генетического разнообразия исходного материала, нужна так же оценка генетической однородности линий и контроль уровня гибридности семян Fj.
Исследование молекулярно-генетического полиморфизма микросател-литных локусов позволяет не только выявлять генетическую вариабельность культуры, но и создать систему маркеров для идентификации генотипов.
Микросателлиты или в английском варианте SSRs (simple sequence repeats) или STRs (short tandem repeats) — это особый класс ДНК-маркеров. Они представляют собой фрагменты ДНК состоящие из коротких тандемно-повторяющихся идентичных «мотивов» обычно называемых «повторами». Число нуклеотидов в таком повторе может варьировать от 2-х до 6, а длина повтора, как правило, 100-200 п.н. В зависимости от длины повтора микросателлиты классифицируют на локусы с ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклео-тидными повторами (Сиволап, 1998; Животовский, 2006).
Такие последовательности встречаются во всех эукариотических, про-кариотических и эубактериальных геномах (Сиволап, 1998; Сингер М., Берг П., 1998; Животовский, 2006; Сулимова, 2007). Число микросателлитных локусов варьирует от двух до нескольких миллионов. Причем, в эукариотах в большей степени, на долю повторяющихся последовательностей приходится 50 и даже более процентов всего генома, то есть предполагается, что один микросателлит встречается через каждые 100 kb последовательности ДНК. В настоящее время пока не известны их функции. Известно лишь, что наиболее простые повторы, содержащие 5 -САСА... (или GTGT...) повторяются многократно в большинстве геномов. Возможно, они ответственны за образование Z-формы ДНК (Сингер М., Берг П., 1998). Для создания праймеров к микросателлитным локусам необходимо знание нуклеотидной последовательности участков ДНК фланкирующих микросателлитный повтор. Причем, необходимо, чтобы эти участки были высокоспецифичны, то есть отсутствовали в других участках генома исследуемого организма. Для обеспечения надежной амплификации микросателлитные праймеры должны быть достаточной длины (20-30 п.н.), их 3 -концы не должны быть комплементарными друг другу. Кроме того, они должны быть сбалансированы по содержанию нуклеотидов для равенства температур плавления ДНК (Животовский, 2006). Микросателлитные локусы высокополиморфны с десятками аллелей в каждом локусе и высокими темпами мутирования. Полиморфизм, в основном, обнаруживается за счет различия в количестве тандемных повторов, лежащих между консервативными последовательностями каждого локуса (рис.1) (Сиволап, 1998; Чесноков, 2005; Сулимова, 2007).
Подавляющее большинство мутаций в микросателлитных локусах возникает за счет специфической ошибки репликации ДНК в районе микросателлита — проскальзывания (англ. slippage) ДНК-полимеразы вдоль гомо-полимерной последовательности на число нуклеотидов, кратное длине повтора (Животовский, 2006). Темпы возникновения таких мутаций гораздо выше, чем частота точковых мутаций у эукариот, порядка от 10" до 10" на локус. Причем частота мутаций в локусах с динуклеотидными повторами выше, чем с тринуклеотидными повторами (Schlotterer, 2000).
Небольшие размеры микросателлитных локусов позволяют применить метод полимеразной цепной реакции в целях генотипирования и обеспечить высокую воспроизводимость результатов в различных лабораториях. Для генотипирования с использованием микросателлитов, требуется небольшое количество ДІЖ, которое можно экстрагировать на любой стадии развития организма, и даже из сильно деградированного биологического материала. В связи с тем, что микросателлиты встречаются в большом количестве у всех организмов их широко используют для изучения, как природных популяций, так и популяций сельскохозяйственных растений, животных и человека (Жи-вотовский, 2006). Этот метод весьма привлекателен для идентификации и паспортизации сортов линий и гибридов растений еще и в связи с преимущественно кодоминантным типом наследования и селективной нейтральностью. Потому, что в основном для генотипирования выбираются микросателлиты расположенные вне кодирующих участков генома и следовательно, не подверженных ни естественному, ни искусственному отборам.
В России и в мире в последнее время проводится много работ по идентификации практически всех хозяйственно-ценных культур с помощью мик-росателлитных маркеров. Исследовался полиморфизм микросателлитов у подсолнечника, ячменя, яровой твердой пшеницы, риса, картофеля и других культур. А для многих из них уже созданы и с успехом применяются маркерные системы на основе микросателлитов.
Для подсолнечника создана система из 8 SSR-маркеров, позволяющая четко идентифицировать 20 генотипов, а так же определять генетическую однородность линий и уровень гибридности (Солоденко и др., 2004; Soloden-ko et al, 2005). В лаборатории иммунитета и электрофореза ВНИИМК тоже создана система из 9 микросателлитных локусов, определен тип наследования этих локусов, что позволяет решать аналогичные задачи (Гучетль и др., 2004). Ранее полиморфизм селекционных форм подсолнечника выявляли с помощью изоферментов (Туркав и др., 1996, Попов и др., 2002), произвольно праймированной ПЦР (Сиволап и др., 1998) и электрофореза запасного белка - гелиантина (Попереля, 2000). Однако эти маркерные системы имеют ряд недостатков: невысокий уровень полиморфизма, небольшое число кодирующих их локусов и преимущественно доминантный тип наследования этих маркеров.
Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои
При создании системы маркеров на основе микросателлитных локусов ДНК первоначальным этапом работы является проведение предварительных экспериментов по оптимизации методики выделения ДНК, подбору оптимальных температурных режимов амплификации, скринингу SSR-праймеров, выявляющих полиморфизм фракций ДНК, приведение в соответствие физико-химических параметров электрофореза продуктов амплификации ДНК.
Стандартный метод выделения ДНК для последующей амплификации в термоциклере состоит из нескольких этапов: гомогенизации растительной ткани с применением жидкого азота, экстракции ДНК из гомогенизированной ткани СТАБ-раствором, элиминации РНК, депротеинизации ДНК и дальнейшей ее очистки с помощью различных реагентов.
Замораживание растительного материала в жидком азоте используют для улучшения его гомогенизации. Мы не использовали жидкий азот, а гомогенизировали растительную ткань, предварительно выдержав ее при -70С в течение часа. Это существенно не отражалось на качестве и количестве полученной ДНК. Различные методики описывают депротеинизацию ДНК с помощью протеиназ. Мы не использовали подобные ферменты, но это так же не отражалось на качестве ДНК. Таким образом, введенные нами модификации в стандартную методику выделения ДНК позволяют сократить время проведения анализа и его стоимость.
Изначально ДНК выделяли из 5-10 дневных этиолированных проростков сои, причем для анализа брали часть семядоли проростка. Оказалось, что этот растительный материал непригоден для выделения ДНК, использованным нами СТАВ-методом, так как выход ДНК был очень мал и к тому же она плохо амплифицировалась. Возможно, что ДНК, выделенная из семядолей проростка, требует особой очистки. Лучше использовать зеленые листья растений любой фазы развития. Как отмечалось в главе «Материалы и методы» наиболее пригодный материал для выделения ДНК - это примордиальные листья 5-7 дневных проростков, либо кончики корешков длиною 1-1,5 см, так как проростки можно вырастить в лабораторных условиях в любое время года.
Для амплификации микросателлитных последовательностей ДНК из литературных источников были выбраны 11 пар праймеров (Maughan et al, 1995; Rongven et al, 1995; Li et al., 2000). В настоящее время известно много микросателлитных локусов у дикорастущей и культурной сои. Мы выбрали праймеры, выявляющие наибольшее количество полиморфных аллелей.
У трех выбранных пар праймеров, фланкирующих локусы Soyhspl76, Soyprpl и Soygy2 известно расположение их на хромосомах сои (Morgante et al., 1994). На рисунке 3 показана локализация локусов на RFLP -генетической карте сои. Как видно из рисунка, эти локусы находятся на разных хромосомах, следовательно, с их помощью можно маркировать три разные хромосомы. Расположение остальных локусов на хромосомах нам пока неизвестно.
Следующим этапом работы было подобрать параметры амплификации ДНК сои с каждой выбранной парой праймеров.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на том, что участок ДНК можно размножить в пробирке, увеличив количество его копий в миллионы раз. Механизм ПЦР заключается в многократном повторении (25-30 раз) определенного цикла температурно-временных режимов. Во время одного такого цикла число копий фрагмента ДНК удваивается. Каждый цикл включает три стадии: 1. Денатурация (расплетение) двойной спирали ДНК; 2. Гибридизация (отжиг) праймеров с матричной ДНК; 3. Элонгация (достраивание) комплиментарных цепей при помощи фермента ДНК-полимеразы.
Денатурация проводится при температуре 92-96С, которая зависит от ионной силы буфера и является постоянной для каждого типа буфера.
Отжиг праймера проходит при температуре в пределах от 36С до 60С. Температура отжига зависит от многих факторов, но в большей степени от количества гуаниновых, цитозиновых, адениновых и тиминовых оснований в нуклеотидной последовательности праймера и его первичной структуры, т.е. процента GC-нуклеотидов. (Вартапетян, 1991; Сиволап, 1998; Сулимова, 2006).
Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров
Анализ 28 сортов сои из разных российских и зарубежных селекцентров по девяти микросателлитным локусам показал, что в этой группе генотипов полиморфны все локусы. Всего было выявлено 27 полиморфных аллелей. Локус Soygy2 в данной коллекции полиморфен, у него обнаружено 2 аллеля. Как и у сортов селекции ВНИИМК по остальным локусам выявлено такое же количество аллелей (табл. 6 и 9). В среднем на локус приходится 3 аллеля.
Эффективное число аллелей в этой выборке сортов почти во всех локусах выше, чем у сортов селекции ВНИИМК. Исключение составляют локусы Soyprl, Satt9 и Soyhspl76. Причем по локусу Satt9 из 5 полиморфных аллелей эффективными являются, только три. А по локусу Sat36 наоборот выявлен больший уровень полиморфизма по сравнению с сортами селекции ВНИИМК (табл. 6, 9). Среднее эффективное число аллелей равно 2,36
В этой группе сортов наибольший индекс полиморфности обнаружился у локуса Satt5 - 0,74. А наименьшее значение этого показателя у локусов Soygy2 и Soyhspl76 - 0,20. Причем по локусу Soygy2 этот показатель больше чем у сортов селекции ВНИИМК, а по локусу Soyhspl76 - меньше. В целом средние значения РІС в обеих группах одинаковое - 0,50.
Результаты ПЦР-анализа представлены в таблице 10. В результате исследований не было получено идентичных наборов аллелей по изученным микросателлитным локусам. В этой группе генотипов сорта отличаются по одному и более локусам. Например, по одному локусу отличаются Safi-Abad 1 (Иран) и Юг-30 (Украина) (локус Satl), Aldana (Польша) и К-11641 (ВИР) (локус Soygy2) и другие (табл. 10).
В этой группе сортов по локусу Satt9 редкими оказались аллели D2 (Ланцетная) и D3 (Приморская 56). Это сорта российской селекции. У иностранных сортов эти аллели не выявлены. А у сортов селекции ВНИИМК они имели частоту встречаемости 19,2% и 34,6% соответственно (табл. 10; рис. 21). Эти аллели, по-видимому, так же могут характеризовать общий тип сорта сои селекции ВНИИМК.
Для каждого сорта был создан индивидуальный молекулярно-генетический паспорт, по аналогии с сортами селекции ВНИИМК (табл.11).
Были вычислены частоты встречаемости аллелей каждого локуса в группе сортов разных селекцентров. Результаты представлены на рисунках 23 и 24. Так же как и у сортов селекции ВНИИМК по локусам Satt2, Sat36, и Soyhspl76 выявляются аллели с частотой встречаемости более 50%, причем те же, что и у сортов селекции ВНИИМК. Это аллели - В2, G2 и Н3. По локусам Satt5 и Satl, в отличие от сортов ВНИИМК, частоты встречаемости аллелей не превышают 50%.
Дискриминационный потенциал описанной выше маркерной системы изучался в выборке дикорастущих генотипов сои. В эту группу вошли три образца, принадлежащих дикорастущему виду G.soya и промежуточному между дикорастущей и культурной соей подвиду G. gracilis.
В этой выборке генотипов всего было выявлено 25 аллелей. Несмотря на маленькую выборку у локуса Satt9 обнаружено 5 аллелей, так же как и у культурных сортов. А по локусам Sattl Satt5 и Satl, наоборот, выявлено меньшее количество аллелей, чем у культурной сои. Например, по локусу Sattl у культурной сои обнаружено 4 аллеля, а у дикорастущей всего 2. Среднее количество аллелей на локус составило 2,7. Среднее эффективное число аллелей на локус составило 2,43 (табл. 12).
Индекс полиморфного информационного содержания варьировал от 0,78 у локуса Satt9 до 0,28 у локусов Soyprl и Sat36. Среднее значение РІС в этой выборке генотипов достаточно высокое, и даже немного выше, чем в обеих группах культурных сортов 0, 52 (табл.12).
По двум локусам Soygy2 и Soyhsp 176 выявлены аллели, не встречающиеся у культурных сортов. Это аллель 3 у локуса Soygy2 и аллель І у локуса Soyhspl76 (табл. 13). На рисунке 25 представлена фореграмма продуктов амплификации ДНК по этому локусу. Образцы на дорожках 5 и 6 - это образцы дикорастущей сои Соя-93 (G.soya) и Соя-133 (G.soya) У них выявлен редкий аллель 3 не обнаруженный больше ни у одного изученного генотипа.
