Содержание к диссертации
Введение
I. CLASS Обзор литератур CLASS ы 6
1.1 Использование гетерозиса в селекции культур вида Raphanus sativus 6
1.2 Стерильность растений 11
1.2.1. Морфобиологическая характеристика ЦМС 11
1.2.2. Физиолого-биохимическая характеристика ЦМС 12
1.2.3. Генетические основы возникновения ЦМС у высших растений 18
1.2.4. Система ЦМС-Ogura у дайкона и практические результаты ее использования 20
1.3. Метод культуры клеток и тканей in vitro 23
1.3.1 Способы регенерации растений 23
1.3.2. Этапы процесса регенерации 26
1.3.3. Влияние внутренних и внешних факторов на процессы морфогенеза 27
1.4. Культура изолированных клеток и тканей в селекции растений 40
рода Raphanus
II. Цели, задачи, научная новизна, практическая значимость, материалы и методы исследовний 43
2.1. Цель, задачи, научная новизна и практическая значимость исследований 43
2.2. Место и условия проведения исследований 45
2.3. Материалы и методы исследований 49
III. Результаты исследований 58
3.1. Особенности микроспорогенеза и микрогаметогенеза у фер-тильных и стерильных растений вида Raphanus sativus 58
3.2. Морфологические особенности цветка у андростерильной формы дайкона MS Gensuke и фертильных растений вида Raphanus sativus 70
3.3 Оптимизация методики определения жизнеспособности пыльцы культур вида Raphanus sativus
3.4. Характеристика гибридов Fi на основе формы дайкона с ЦМС- 84
Ogura по комплексу селекционно-ценных признаков
3.4.1. Проявление признака стерильности ЦМС-Ogura у гибридов F] 85
3.4.2. Характеристика гибридов F] по качественным и количественным признакам листа
3.4.3. Характеристика гибридов Fi по качественным и количественным признакам корнеплода
3.4.4. Наследование основных морфобиологических признаков у гибридов F] 94
3.5. Разработка элементов технологии клонального микроразмно жения растений вида Raphanus sativus из гипокотильных экс-плантов в условиях in vitro 99
3.5.1. Стерилизация исходного материала 99
3.5.2. Влияние типа и возраста экспланта на процессы органогенеза in vitro 101
3.5.3. Влияние различных комбинаций ауксинов и цитокининов на процессы морфогенеза у различных образцов вида Raphanus sativus 106
3.5.4. Влияние различных биологически активных веществ на органогенез in vitro 111
3.5.5. Влияние положения экпланта на питательной среде на процессы органогенеза 117
3.5.6. Влияние низкой температуры на процессы органогенеза 124
3.6. Разработка методов индукции морфогенного каллусогенеза из бутонов стерильных растений вида Raphanus sativus. 125
3.6.1. Влияние линейного размера бутона на индукцию морфгенного каллусогенеза 126
3.6.2. Влияние состава питательной среды на морфогенный каллусо-генез из пестиков бутонов 129
3.6.3. Влияние стрессовых факторов и биологически активных веществ на эффективность морфогенного каллусогенеза 133
3.7. Укоренение и адаптация растений — регенерантов к условиям in vivo 137
Выводы 143
Практические рекомендации 144
Список литературы 146
Приложение 176
- Генетические основы возникновения ЦМС у высших растений
- Особенности микроспорогенеза и микрогаметогенеза у фер-тильных и стерильных растений вида Raphanus sativus
- Влияние типа и возраста экспланта на процессы органогенеза in vitro
- Укоренение и адаптация растений — регенерантов к условиям in vivo
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время существенно расширилось представление о роли репродуктивной биологии в селекционной практике. Половая и вегетативная репродукция является центральным вопросом на разных этапах селекционного процесса, начиная с оценки и создания исходного материала и вплоть до получения сортов и гибридов. Особую актуальность это направление имеет при получении гетерозисних гибридов, использование которых увеличивает урожай на 10-30% по сравнению с сортами.
Производство гибридных семян культур вида Raphanus sativus имеет фундаментальное значение в современном сельскохозяйственном растениеводстве как в отношении повышения урожайности и качества выращиваемой продукции, так и получаемой прибыли. Начиная с 30-х годов у многих видов Raphanus sativus гибридные семена^ получают, используя главным образом, гены самонесовместимости. Однако сложность спорофитной системы самонесовместимости привела к сокращению количества линий используемых в семеноводстве. Эта система требует также трудоемкого опыления бутонов для достижения высокой гомозиготности линий и получения изогенных линий с целью отбора родительских компонентов. Наиболее полно преимущества генетического подхода, препятствующего самоопылению при гибридном семеноводстве культур вида Raphanus sativus, проявляются при использовании цитоплазматической мужской стерильности (Бунин М. С, 1994). В связи с этим важное значение для гетеро-зисной селекции вида Raphanus sativus приобретают исследования по созданию гибридов F] этих культур на основе Ogura-ЦМС, источником которой может являться японский дайкон.
Многие приемы использования, в том числе оценка особенностей проявления этого типа стерильности, основываются на данных репродуктивной биологии по развитию пыльника и пыльцы, аномалиях развития. Изучение закономерностей развития пыльника, микроспор и мужского гаметофита на клеточ-тюм уровне имеег большое значение для разработки многих методовв селекци» на гетерозис вида Raphanus sativus.
5 С другой стороны, методы культуры тканей и органов в репродуктивной
биологии в настоящее время приобретают все большее значение для построения рациональных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур. Важными предпосылками экономически выгодного использования методов культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности; а также экономия времени при размножении в условиях in vitro, что дает возможность эффективно включать их в селекционный процесс.
Получение линий путем инцухта у культур вида Raphanus sativus вследствие сильной инцухт-депрессии значительно затруднено, а часто вообще неосуществимо. В связи с этим методы культуры клеток и тканей в производстве элитных растений, их размножении, а также генетически идентичном вегетативном сохранении стерильных форм вида Raphanus sativus приобретают особую актуальность. Однако по литературным данным лишь единичные экспериментальные исследования преимущественно авторов Японии, Китая, Кореи посвящены вопросам регенерации растений рода Raphanus в процессе клонально-го микроразмножения в условиях in vitro.
В связи с этим разработка основных элементов, оценка перспективности использования технологии клонального микроразмножения, а также других методов репродуктивной биологии имеют перспективное значение, в частности, при создании сортов и гибридов, поддержании и размножении инцухт-линий без дальнейшего снижения их жизнеспособности, сохранении и размножении оригинального материала с цитоплазматической мужской стерильностью, представляющего селекционную ценность для селекции на гетерозис вида Raphanus sativus.
Генетические основы возникновения ЦМС у высших растений
ЦМС встречается почти у 140 видов высших растений и связана с аномальным развитием пыльника (нераскрываемость пыльника или абортация пыльцы на различных стадиях микроспорогенеза). Во всех случаях ЦМС генетическая способность к стерильности, передается через клетки цитоплазмы семян женской родительской формы (Renard М, et al., 1992).
Предполагают, что цитоплазматическими детерминантами ЦМС у ряда #У растений являются митохондрии (Peterson et al 1975). В большинстве случаев причиной возникновения ЦМС являются мутации в митохондриальной ДНК (mt-DNA) как результат внутри или межмолекулярных рекомбинаций, включая коротко повторяемые последовательности ДНК (Lonsdale, 1987; Handa, 1992; 1993; Dewey et al., 1986; Erickson et al., 1986; Newton K., 1988). В последние годы у 12 видов растений, в том числе и у Raphanus sativus, охарактеризованы появившиеся в результате рекомбинаций и обуславливающие ЦМС 29 генов вместе с кодируемыми ими последовательностями молекул ДНК (Hanson М. et al., 1989; Newton К., 1988; Srivastava, 2000). В ряде случаев эти химерные гены являются транскрипционно активными и могут экспрессировать новые протеины, обуславливающие, по видимому, нарушения в функционировании митохондрий, тапетума пыльника и микроспор, что в итоге приводит к неспособности продуцировать пыльцу (Makaroff. et al., 1989). Химерные гены ответственны за различные типы (А стерильности кукурузы, петунии, редиса (Hossain et al, 2002), рапса (Palmer et al., 1983) подсолнечника и бобовых культур (Budar, 1995). При этом разные системы стерильности обусловлены различными перестройками в геноме (Fu, 1981; Jan et al., 1986V Так, молекулярно-биологические методы анализа позволили обнаружить участки митохондриальной ДНК - ATF 6 и СОХ II, связанные со стерильностью перца (Kim et at, 2001). Изучены нуклеотидные последовательности Nco2,5 фрагментов ДНК митохондриального генома, обуславливающие ЦМС цибридов В. nap us (Bonhome et al., 1991). Механизм абортации пыльцы до сих пор не выяснен. Возможно, появление новых вариантов полипептидов определяет функционирование внутренней митохондриальнои мембраны (Singh М. et at, 1991). Во время нормального вегетативного роста нарушение митохондриальнои активности не имеет отрицательных последствий, однако при формировании пыльцы это приводит к митохондриальнои недостаточности. Таким образом, митохондриальная дегенерация является первой причиной анормальности развития у растений с ЦМС. Другая гипотеза предполагает, что промоторные последовательности, обычные для новых генов и генов, от которых они появились, конкурируют по лимитирующим факторам, контролирующих экспрессию природных и различных вариантов полипептидных генов (Leaver, 1992). Это может привести к повреждению митохондриального биогенеза или функции, которая становится лимитирующей только при формировании пыльцы, в свою очередь, гены-восстановители фертильности подавляют синтез рекомбинантного полипептида ниже порогового уровня проявления его функции. После открытия специфичных доминантных генов, восстанавливающих фертильность (Rf-генов) стало возможным коммерческое использование ЦМС-линий в качестве женских родительских форм таких сельскохозяйственных культур, как рис, сахарная свекла, сорго, кукуруза, подсолнечник (Renard М. et al., 1992). Открытие методов генной инженерии позволило создать трансгенный восстановитель фертильности хлопка (Wang-Xue De, 2002). У растений семейства капустных наблюдается сложное наследование ЦМС, что повлияло на эффективность использования андростерильных линий в гетерозисной селекции. Фенотипическое проявление андростерильности у їх культур обусловлено взаимодействие генами ядра, находящимся в гомозиготном состоянии, то есть фактически относится к ядерно-цитоплазматической МС. Поэтому, требуется создание дополнительных линий - закрепителей стерильности (фертильных аналогов МС-линий), что усложняет селекционно-семеноводческий процесс производства гибридов F. 1.2.4. Система ЦМС-Ogura у дайкона и практические результаты её использования в селекции капустных культур Среди многообразия видов Brassicaceae L формы с ЦМС была впервые обнаружены X. Огурой у неиндентифицированного сорта японского подвида R. Sativus -дайкона (Ogura, 1968). Результаты молекулярных методов исследования японских ученых (Yamagishi and Terachi, 1994) показали, что Ogura - тип митохондриальной ДНК наиболее старый и достаточно широко распространенный среди капустных культур, особенно среди диких представителей японской редьки. В связи с этим существует предположение о первоначальном возникновении Ogura-ЦМС именно у диких представителей дайкона, хотя точное происхождение этого типа стерильности до конца не выяснено. Цветки растений с этим типом стерильности имеют ряд особенностей: уменьшенный размер цветочной почки, петелькообразный или выступающий из почки пестик. Дегенерация пыльцы у таких МС растений дайкона происходит в стадии микроспорогеза и связана с ранним коллапсом ткани тапетума. Установлено, что данный тип стерильности контролируется взаимодействием гомозиготного рецессивного ядерного гена msms (rf Dg rf og) и стерильной цитоплазмой S (ogu). При этом, что все сорта дайкона, распространенные в Японии не только отличаются от этой формы наличием нормальной цитоплазмы N (гар), но и не имеют генов восстановителей ферТИЛЬНОСТИ (Rf 0g; Rf og). Макаров С. А., Палмер Д. И Алел И. (1991), сравнивая организацию mt-DNА—стерильной цитоплазмы (ogu)—и- юрмальной— (гар) цитоплазмы представителей вида R. sativus L., нашли случаи рекомбинаций ДНК генов atp A, atp6 и coxl, В настоящее время в различных странах исследователи занимаются поиском закрепителей для цитоплазматическои мужской стерильности типа Ogura. Так, Nieuwhof (1990) идентифицировал закрепители из японских и европейских популяций редиса. В 70-х годах А. Бонне обнаружил закрепители для интродуцированной формы мужскистерильного дайкона среди линий редиса, относящегося к европейскому подвиду Raphanus sativus. В дальнейшем им была получена линия МС редиса методом беккроссирования исходной МС формы дайкона с образцами, выделенными из европейских сортов редиса. На основе этой МС линии удалось получить гибриды Fi, которые проявили высокий гетерозисный эффект по урожайности, скороспелости, характеризовались высокой степенью однородности и качеством продукции (Bonnet, 1975). Кроме того, Ogu (8)-цитоплазма, полученная от дайкона, может быть использована не только в селекции растений вида Raphanus sativus, но и в гетерозисной селекции вида Brassica oleracea, посредством серии беккроссов W МС формы дайкона с различными разновидностями капусты (Бунин М. С, 1993; 2002; Renard М. et al., 1992).
Особенности микроспорогенеза и микрогаметогенеза у фер-тильных и стерильных растений вида Raphanus sativus
Несмотря на значительный интерес к проблеме цитоплазматической мужской стерильности, связанный с практической значимостью мужски стерильных форм для получения высокопродуктивных гетерозисных гибридов, и огромное число публикаций, посвященных различным аспектам этой проблемы, пока еще не представляется возможным определить физиолого-биохимические механизмы возникновения и проявления этого типа мужской стерильности. Это отчасти связано с тем, что до настоящего времени полностью не раскрыты механизмы, обуславливающие морфологические и цитологические особенности развития пыльника в норме, что затрудняет оценку отклонений, выявленных на разных этапах развития пыльника у растений с ЦМС. В связи с этим изучение ЦМС-Ogura дает возможность лучше оценить фенотипическое проявление ци-топлазматически наследуемой изменчивости у растений вида Raphanus sativus.
Сравнительное изучение развития пыльников стерильных и фертильных цветков растений вида Raphanus sativus, особенно процесса развития микроспор in vivo, способствует раскрытию причин нарушения процессов микроспорогенеза в пыльниках растений с ЦМС - Ogura и образования стерильной пыльцы.
Пыльник - представляет собой целостную интегрированную систему. Развитие в нем соматических тканей и репродуктивных клеток происходит опосредовано. Развитие пыльника может быть разделено на два больших периода (Goldberg et al., 1993). В течение первого периода устанавливается морфология пыльника, происходит дифференцировка клеток и тканей, и материнские клетки (микроспороциты) подвергаются мейозу, К концу первого периода пыльник редиса и дайкона четырехгнездный. Гнезда с тетрадами микроспор объединены попарно, в две теки. Стенка пыльцевого гнезда пыльника развивается по однодольному типу и состоит из эпидермиса, эндотеция, среднего слоя и тапетума (рис 1,2, 3,4, 5). Для выявления различий в развитии пыльника и мужского гаметофита (пыльцы) мужскистерильного дайкона с ЦМС - Ogura при помощи цитологического анализа нами были изучены стадии развития микрогаметофита в различных по размеру бутонах фертильных и стерильных растений. На основании немногочисленных литературных данных и наших исследований было выделено 9 стадий развития мужского гаметофита у фертильных растений дайкона Саша:
1 стадия - тетрады (рис. 6, А);
2 стадия - ранняя одноядерная (рис. 6 Б, В);
3 стадия - ранняя средняя одноядерная (рис. 6, Г);
4 стадия - средняя одноядерная (рис. 6, Д);
5 стадия - поздняя одноядерная вакуолизированная (рис. 6, Е);
6 стадия - поздняя одноядерная (рис. 6, Ж);
7 стадия - митотическая (рис. 6,3);
8 стадия - двухклеточная (рис. 6, И);
9 стадия - трехклеточная (рис. 6, К);
Мейоз в микроспороцитах, приводящий к образованию тетрад микроспор, протекает в бутонах дайкона длиной меньше 1,5мм. Тетрады микроспор образуются по симультанному типу. Микроспоры в них располагаются тетраэдрально и изобилатерально (рис. 6, А). В бутонах фертильных растений дайкона длиной 1,5мм (табл.4) микроспоры, образовавшиеся сразу после распада тетрад, имеют крупное ядро, расположенное в центре клетки, плотную цитоплазму, тонкую оболочку (рис 6, Б). По мере роста объем микроспоры увеличивается, а клеточная стенка утолщается (рис 6, В). Микроспора фертильных растений дайкона и редиса в бутонах размером 2-2,5мм и 2,5-Змм, соответственно, приобретает характерную трехлопастную форму, которая сохраняется до первого митоза (рис. 6, Г-Е). Для последующего этапа развития характерно образование сначала мелких вакуолей (рис. 6, Г, Д), затем одной более крупной, занимающей большую часть микроспоры (рис. 6, Е, Ж, 3). Ядро при этом сдвигается к стенке, занимая пристеночную позицию, максимально удаленную от поры. Это поздняя стадия развития микроспоры, которая завершает развитие, вступая в асимметричный митоз, образуя новую структуру - пыльцевое зерно, состоящее из вегетативной и генеративной клеток (рис. 6, И).
A - тетрады; Б - тонкостенная микроспора с крупным центрально расположенным ядром; В - округлая микроспора с утолщенной оболочкой без видимых вакуолей; Г - микроспора с началом образования лопастной формы, с мелкими вакуолями; Д - микроспора трехлопастной формы, с центрально расположенным ядром, начало образования крупной вакуоли; Е -ядро перемещается в боковую позицию, размеры вакуоли увеличиваются; Ж - вакуолизированная стадия развития, крупная вакуоль занимает значительную часть микроспоры, трехлопастная форма сохраняется; 3 -микроспоры округлой формы, ядро занимает латеральное положение, максимально удаленное от поры. Микроспора находится накануне асимметричного митоза; И - двухклеточная пыльца; К - трехклеточная пыльца. Двуклеточная стадия развития пыльцы фертильного дайкона отмечена в пыльниках бутонов длиной 4мм, а фертильного редиса в бутонах 3,5мм (табл. 4). Вскоре после первого митоза генеративная клетка перемещается в центральную часть пыльцевого зерна. Двухклеточная стадия пыльцы у изученных представителей рода Raphanus не продолжительная, генеративная клетка делится митотически с образованием двух спермиев.
Влияние типа и возраста экспланта на процессы органогенеза in vitro
Для успеха работ по регенерации растений выбор исходного экспланта играет первостепенную роль. Условия предварительного выращивания растений также могут существенно влиять на последующий рост экспланта в культуре.
Анализ литературы показал, что успешная регенерация в условиях in vitro уже достигнута у большинства видов капусты из различных частей растения (Bhattach-arya and Sen, 1980; Kirti and Chopra, 1989). Такого разнообразия лите 102 ратурных сведений об эффективности процесса регенерации растений рода Raphanus из различных типов эксплантов нами не обнаружено.
В связи с этим нами была изучена морфогенетическая активность наиболее часто встречаемых в работе с культурой растительных тканей типов эксплантов. Культивирование верхней и нижней частей гипокотиля, семядолей и сегментов корней, выделенных из 4 суточных стерильных проростков редиса Фея, проводили на среде МСм с 0,2 мг/л НУК, ТДЗ.
В результате эксперимента установлено, что через 3-5 суток инкубирования происходило увеличение размера всех исследуемых типов эксплантов без образования каллуса. Органообразовательной и регенерационной способностью обладали только фрагменты гипокотиля, выделенные из верхней его части и захватывающие ткани эпикотиля с высокой меристематической активностью.
Единичное побегообразование в этом случае происходит как из апикальной, так и из периферической меристем. Полученные различия в регенератив-I ной способности гипокотильных эксплантов могут быть связаны с клеточной детерминацией. Так, например, при культивировании черешков моркови в образовании адвентивных побегов, корней и эмбриоидов принимают участие различные ткани исходного экспланта. Клетки, прилегающие к сосудистым пучкам, делятся, образуя корневой примордий, развивающийся в корень. Субэпи-дермальные клетки развиваются в соматические эмбриоиды, а паренхимные клетки дают начало каллусу (Neumann and Grieb, 1992; Newmann, 1995).
Из выбранных нами эксплантов только различные типы клеток верхней части гипокотилей, обладали высокой тотипотентностью и детерминацией на формирование различных органов растения. Так, корни из этих фрагментов гипокотилей развивались с частотой 7%, побеги с одной листовой розеткой - 84%, а частота процесса регенерации из пазушных почек экспланта составила 23% (табл. 13). Клетки семядолей были детерминированы только на развитие корней, встречающихся у 13,6% эксплантов, а морфогенетическая активность корневых сегментов и нижних участков гипокотилей вообще не обнаружена (рис. 19).Проявление морфогенетической активности тканей у разных типов эксплантов редиса Фея на среде МСм с 0,2 мг/л НУК и ТДЗ: 1 - верхняя часть гипокотиля с эпикотилем; 2 - нижняя часть гипокотиля; 3 - фрагменты семядолей
Аналогичные изменения морфогенетической активности в зависимости от длины гипокотиля были обнаружены в работе с культурой растительной ткани огурца (Gambley and Dodd, 1990).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки различных типов эксплантов редиса обладают неодинаковой способностью к морфогенезу. Наибольшей способностью к органогенезу и регенерации побегов в условиях in vitro обладают фрагменты гипокотилей редиса длиной 4-5мм с участком эпикотиля, которые могут использоваться в процессе клонального микроразмножения культур вида Raphanus sativus.
Возраст донорного растения/экспланта - существенный фактор, воздействующий на процессы органогенеза при культивировании капустных культур в условиях in vitro (Yang et al., 1991). Обычно в культуре растительных тканей используются молодые ткани в качестве исходных эксплантов, старых тканей стараются избегать (Guo Y - D, 2000).
Было проведено изучение влияния физиологического возраста первичного экспланта на его морфогенетическую активность. Для этого исследуемые экс-планты редиса Феи изолировали с 3-6 суточных проростков и культивировали на питательной среде МСм с 0,2 мг/л НУК и ТДЗ.
В результате культивирования разновозрастных эксплантов было обнаружено, что интенсивность процессов побегообразования и регенерации побегов
Влияние возраста гипокотильных эксплантов на интенсивность процессов органогенеза у редиса Фея
Использование молодых трехсуточных проростков приводило к уменьшению частоты образования одной листовой розетки на 12,5%. Количество регенератов из гипокотильных эксплантов этого возраста уменьшилось на 77,5%, тогда как из пятисуточных и шесгисуточных проростков - на 18,6% и 25,3%, соответственно. Кроме того, с увеличением возраста проростков индуцировался корневой ризогенез, подавляющий развитие дополнительных пазушных почек на { экспланте.
Таким образом, для успешной регенерации наибольшего количества рас-тений-регенерантов в клональном микроразмножении редиса целесообразно использовать гипокотильные экспланты, выделенные из четырехсуточных стерильных проростков.
Укоренение и адаптация растений — регенерантов к условиям in vivo
Образующиеся в результате субкультивирования гипокотильных эксплантов растения-регенеранты с хорошо развитыми побегами выделяли и проводили их укоренение на жидких питательных средах (рис. 34).
В ходе исследований нами было исследовано влияние двух регуляторов роста - НУК и БАП в концентрациях 0,2 мг/л, а также безгормональной среды МСм на интенсивность процессов корнеобразования у эксплантов лобы и дай-кона. Так, через 2 недели культивирования растений-регенерантов лобы и дайкона на жидких питательных средах in vitro, наблюдалось начало процессов корнеобразования. Развитие корневой системы растений лобы и дайкона происходило без осложнений.
Количество укоренившихся регенерантов лобы было больше, чем у дайкона на всех трех вариантах сред. При этом на среде, содержащей БАП, корнеобразова-ние у регенерантов дайкона в отличие от лобы не наблюдалось.
Безгормональная среда способствовала укоренению растений и лобы и дайкона в большем числе случаев по сравнению другими вариантами сред (рис. 35). Количество побегов с образовавшимися корнями у лобы достигало - 50%, тогда как у дайкона лишь 29%.
Таким образом, для индукции корнеобразования у наибольшего числа растений-регенерантов, полученных при культивировании гипокотильных эксплан-тов растений вида Raphanus sativus в условиях in vitro, возможно использование безгормональной питательной среды МСм.
Образовавшиеся здоровые, крепкие растения с хорошо сформировавшейся корневой системой были высажены в торфяные или пластиковые горшочки с
Адаптация растений-регенерантов редьки китайской к условиям in стерильной почвосмесью, состоящей из дерновой земли и торфа в соотношении 1:2, прикрытые сверху прозрачным пластмассовым стаканчиком, для поддержания высокой влажности (рис. 36). Период их адаптации к условиям внешней среды составил 14-16 суток. После появления 2-3 новых листьев на растениях стаканчики снимали. Горшочки оставляли в затенении до тех пор, пока растения не привыкли к условиям внешней среды.
Проведенные нами исследования в культуре тканей растений вида Raphanus sativus показали, что воспроизведение растений идет путем прямой регенерации. В условиях in vitro при создании экспериментальных систем со строго определенными, регулируемыми условиями, свойство тотипотентности растительных клеток проявляется в большей степени и пути морфогенеза у эксплан-тов вида Raphanus sativus в следующих направлениях: органогенез - геммогенез, ризогенез. Воспроизведение растений осуществляется через геммогенез.
Использование методов репродуктивной биологии позволило исследовать закономерности проявления цитоплазматическои мужской стерильности типа Ogura в процессе развития пыльника и пыльцы на клеточном уровне, а также способствовало выявлению маркерных морфологических признаков цветка у растений вида Raphanus sativus, обладающих этим типом стерильности. Выявленные морфологические особенности цветка и цитологические особенности процессов микроспорогенеза и микрогаметогенеза могут использоваться при отборе стерильных форм в практической селекции исследуемых культур на гетерозис.
Проведенные исследования по предварительному определению жизнеспособности пыльцы фертильных растений, используемых в качестве отцовских форм в скрещиваниях с андростерильной формой дайкона, позволили модифицировать питательную среду для проращивания пыльцы различных сортообраз-цов редиса и дайкона. Гибридизация изучаемой андростерильной формы дайкона MS Gensuke, используемой в качестве материнского компонента в скрещиваниях,, с фертильными растениями из различных сортопопуляций редиса и дайкона, показала перспективность использования данной формы дайкона для интродукции исследуемого типа стерильности и создания стерильных линий редиса. Кроме того, сравнительная оценка родительских компонентов скрещивания и полученных гибридов Fi, позволила выявить наиболее перспективные сортопопуляций редиса для получения на основе андростерильной формы дайкона гете-розисных гибридов Fi с высокой продуктивностью. Полученный исходный материал может использоваться в дальнейшей практической селекционной работе с культурами вида Raphanus sativus.
