Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Главный комплекс гистосовместимости (МНС) (Major Histocompatibility complex) 9
2.1.1. Функциональная роль главного комплекса гистосовместимости...9
2.1.2. Антигены Главного комплекса гистосовместимости и болезни...20
2.1.3. Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота ..29
2.1.4. Связь антигенов Главного комплекса гистосовместимости сельскохозяйственных животных и восприимчивости к заболеваниям 34
3. Материалы и методы иследования 41
3.1 . Методика выделения суспензии лимфоцитов 43
3.2. Постановка микроцитотоксического теста 44
3.3. Определение полимеразной цепной реакции (ПНР) 45
3.4. Исследование рестрикции продуктов амплификации 46
3.5. Проведение ПЦР с аллельспецифическими праймерами VD-19HER-17 47
3.6. Электрофорез продуктов амплификации 48
3.7. Методы генетико-статистического анализа 48
4. Собственные исследования 52
4.1. Распределение антигенов BoLA-A в популяциях айрширской породы крупного рогатого скота 53
4.2. Характеристика антигенов гистосовместимости в связи с заболеваемостью лейкозом 54
4.3. Оценка коров на устойчивость и восприимчивость к гемобла-стозам крупного рогатого скота методом статусметрии 68
4.4. ПЦР-ПДРФ типирование больных гемобластозами, вирусоносителей и здоровых животных по локусу BoLA -DRB3 73
4.4.1. Амплификация экзона 2 гена BoLA-DRB3 74
4.4.2. Анализ рестрикционного полиморфизма экзона 2 гена BoLA-DRB3 77
4.4.3. Анализ аллелей гена BoLA-DRB3 ассоциированных с устойчивостью и чувствительностью к гемобластозам крупного рогатого скота...82
4.4.4. Анализ аллелей гена BoLA-DRB3 ассоциированных с устойчивостью и чувствительностью к лейкозу крупного рогатого скота у коров в возрасте 5 лет и старше 89
4.4.5. Определение аллельных вариантов гена BoLA-DRB3,
ассоциирующихся с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу, с помощью аллельспецифичной полимеразной цепной реакции 91
4.5. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность в популяции айр-ширского скота 97
4.6. Продуктивность коров айрширской породы и ее связь с устойчивостью и восприимчивостью к гемобластозам крупного рогатогоскота 98
5. Обсуждение полученых результатов 101
6. Выводы 108
7. Сведения о практическом использовании научных результатов 109
8. Рекомендации по применению научных выводов 109
Список литературы
- Главный комплекс гистосовместимости (МНС) (Major Histocompatibility complex)
- Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота
- Методика выделения суспензии лимфоцитов
- Распределение антигенов BoLA-A в популяциях айрширской породы крупного рогатого скота
Введение к работе
Лейкозы человека, животных и птиц относительно широко распространены и встречаются почти во всех странах мира. Среди инфекционных болезней крупного рогатого скота в России (по статистическим данным Министерства сельского хозяйства РФ) гемобластозы занимают первое место. Отсутствие ранней диагностики, лечения и эффективных мер профилактики выдвигает проблему лейкозов в число важнейших биологических и социальных задач.
Многочисленные исследования, проводимые как в России, так и за рубежом (Miller Y. et al., 1969; Calafat Y. et al., 1974; N.Sagata et al., 1985; Straub, 1984; J.L.Heeney, V.E.O.Valli, 1990; J.Coulston et al.,1991; Надточей Г.В., Валихов А.Ф., 1972; Валихов А.Ф., 1978, 1991; Шишков В.П. исоавт., 1984, 1989; В.В.Разумовская и соавт., 1997; Ломакин А.И. и соавт., 1998; В.И.Колесников и соавт., 1999; Р.С.Москалик исоавт., 1999; С.В.Новицкий и соавт., 1999; ГулюкинМ.И. исоавт. 1998, 1999, 2000), направленные на изучение эпизоотологии, этиологии и биологических особенностей лейкозного процесса, позволили установить вирусную природу этого заболевания и разработать доступные и чувствительные методы диагностики. Установлено, что лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы, вызываемое РНК-содержащим вирусом семейства Retroviridae - вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), поражающим лимфоидную ткань, то есть являющимся лимфотропным.
Согласно вирусоиммуногенетической концепции этиопатогенеза гемо-бластозов, выдвинутой В.П.Шишковым, клиническому и патоморфологическо-му проявлению болезни, кроме вирусного инфицирования, способствуют генетическая предрасположенность и иммунологическая недостаточность организма.
Лейкозы наносят значительный экономический ущерб вследствие гибели и вынужденной выбраковки животных, утилизации органов и туш при убое; расходов, связанных с ограничительными мероприятиями. Широкая распространенность инфекции наносит урон генофонду племенного молочного животноводства, так как гематологические признаки заболевания лейкозом более часто регистрируется у высокопродуктивных животных ценных молочных пород (Эрнст Л.К., Шишков В.П., 1983).
В последнее время стала очевидна необходимость разработать методические подходы, и получить достоверные критерии, позволяющие судить о генетической предрасположенности животного к заболеванию и об изменении его иммунологического состояния при развитии патологического процесса. Существует большое количество работ, посвященных этому вопросу, выполненных как отечественными (Никитенко И.Н. и др., 1983, Сулимова Г.Е. и соавт., 1995; Эрнст Л.К. и соавт., 1998), так и зарубежными учеными (Вегпосо, 1991; Stear Mi. et al.,1982, 1988; Lewin H.A. et al., 1988; Xu A., 1992). Однако анализ данных литературы показывает весьма ограниченные возможности использования изучаемых авторами полиморфных систем (эритроцитарные антигены, белки сыворотки крови и т.д.) при прогнозировании устойчивости сельскохозяйственных животных к болезням. В каждом стаде, в каждом случае частота встречаемости тех или иных аллелей у больных и здоровых животных различна.
К сожалению, этим и ограничивается материал, по которому сходятся мнения большинства исследователей. Причиной может быть недостаточное количество данных, или ошибки в методическом подходе, заключающиеся в проведении исследования по частоте встречаемости в стаде отдельных факторов или аллелей, но не по оценке комплексного генотипа. Кроме того, ни одна изученная ранее полиморфная система групп крови или белков не ответственна непосредственно за резистентность организма к тому или иному заболеванию.
Совершенно иначе следует рассматривать гены Главного комплекса гис-тосовместимости (МНС - Major histicompatibility complex), который присутствует у всех позвоночных, в том числе и крупного рогатого скота, и обеспечивает иммунный ответ на чужеродные антигены, что обусловливает наличие ассоциаций с устойчивостью и восприимчивостью к различным болезням: к лей козу (Эрнст Л.К. с соавт, 1997; Stear MJ. et al., 1988; Levin H.A., 1989), паразитарным заболеваниям (Stear et al., 1988; Williams et al., 1991), маститам (Ложкин Э.Ф. с соавт., 1996; Spooner et al., 1987,1987; Meidell et al, 1994). Однако и в этом случае у разных пород и популяций животных в ассоциации с одним и тем же заболеванием могут быть вовлечены разные антигены (Слеп-ченко А.Р., 1994; Stear et al., 1988; Levin et al., 1988), что, вероятно, связано с полигенным типом наследования устойчивости к болезни. В некоторых случаях ассоциативные связи обнаруживаются не только к патологическому процессу, но и к особенностям патогенеза.
Все сказанное выше говорит о несомненной актуальности иммуногене-тической проблемы лейкоза.
Цели и задачи исследований
Целью работы было - изучить генетическое разнообразие по антигенам классов I и II системы BoLA (Bovin leicocite antigens) айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота, и дать сравнительную характеристику; выявить ассоциации полиморфных вариантов фенотипов антигенов классов I и II Главного комплекса гистосовместимости с устойчивостью к лимфолейкозу; на основе полученных результатов дать оценку возможности использования антигенов системы BoLA в качестве маркеров устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-изучить полиморфизм антигенов системы BoLA в популяциях крупного рогатого скота айширской и черно-пестрой пород;
-провести сравнительный анализ исследованных популяций по частоте встречаемости различных антигенов Главного комплекса гистосовместимости (классов I и II);
-на основе популяционных исследований определить риск заболевания лейкозом коров изучаемых пород;
-определить возможные ассоциации антигенов системы BoLA с восприимчивостью к лимфолейкозу; -разработать и обосновать применение антигенов гистосовместимости в качестве маркеров устойчивости к заболеваниям.
Научная новизна проводимых исследований
Впервые в 11 JUL 13 «Смена» и колхозе им. Кирова изучен полиморфизм антигенов системы BoLA у коров, соответственно айрширской и черно-пестрой пород . Изучены внутри- и межпородные различия, дана сравнительная характеристика пород, по частоте встречаемости антигенов классов I и II Главного комплекса гистосовместимости, получены интегральные формулы устойчивости в связи с ассоциацией с восприимчивостью к лимфолейкозу на основе применения метода статусметрии.
Научное и практическое значение исследований
В результате проведенных исследований определены возможности использования антигенов гистосовместимости в качестве прогностических маркеров устойчивости к заболеваниям при формировании племенного ядра стад и решении судьбы высокопродуктивных животных - вирусоносителей ВЛКРС. Использование иммуногенетических параметров в качестве дополнительных мер, в оздоравливаемых от лейкоза популяциях крупного рогатого скота, позволяет существенно ускорить процесс оздоровления хозяйства и снизить экономические потери от этого заболевания.
На защиту выносятся следующие положения:
- результаты сравнительной характеристики полиморфизма Главного комплекса гистосовместимости в стадах крупного рогатого скота айширской и черно-пестрой пород.
- сведения о генетической устойчивости к лимфолейкозу на основе изучения антигенов системы BoLA классов I и II.
- на основе метода статусметрии получена интегральная формула оценки устойчивости к лейкозу.
- использование выявленных антигенов BoLA в качестве прогностических иммуногенетических маркеров при проведении оздоровительных противолей-козных мероприятий. Апробация работы
Основные положения полученных результатов исследований доложены на научно-практических конференциях факультета Зоотехнологий и агробизнеса ФГОУ ВПО «Московская Государственная Академия Ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» в 2003 году и на международной научно-практической конференции в Калининграде, 2002 г.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 28 таблиц, 12 рисунков, 8 диаграмм; состоит из введения, обзора литературы, материалов исследований, выводов, обсуждения, сведений о практическом использовании научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов. Список литературы включает 177 источников.
Главный комплекс гистосовместимости (МНС) (Major Histocompatibility complex)
С момента открытия в 1936 году Gorer первого антигена мышей и идентификации первого антигена человека, система гистосовместимости животных и человека являются объектом пристального внимания со стороны исследователей всего мира. Gorer провел классические опыты на мышах, впервые показавшие на существование у них локуса тканевой совместимости (Н-2). Несмотря на то, что сведения о структуре и функциях Главного комплекса гистосовместимости накапливались стремительными темпами, тем не менее, точное установление функций и той биологической значимости, которую играет Главный комплекс гистосовместимости в жизнедеятельности организма, еще далека от завершения. Это происходило из-за того, что в то время не существовало клинической аллотрансплантации, казалось, что основные антигены, ответственные за совместимость тканей, содержатся на эритроцитах, так как все опыты Р. A. Gorer проводил на мышах.
Главный комплекс гистосовместимости (МНС) первоначально был описан в ходе исследования системы основных групп крови человека. Изучение антигенного строения клеток крови привело к выделению групп крови человека, а обнаружение антигенов эритроцитов позволило считать, что совокупность именно этих групп антигенных факторов определяет антигенную способность у животных и человека.
Только с развитием клинической и экспериментальной трансплантологии (50-е годы) появились данные, изменившие известные представления о тканевых антигенах, так как даже при максимальной совместимости донора и реципиента по эритроцитарным антигенам наблюдалось отторжение аллогенных тканей. Стало ясно, что кроме эритроцитарных антигенов имеются факторы, определяющие развитие реакции отторжения органов и тканей. Интенсивные поиски этих факторов закончились выделением новой системы групповых антигенов, а именно изоантигенов лейкоцитов, непосредственно участвующих в отторжении аллотрансплантатов (Зарецкая Ю.М., 1983,2002).
До 1964 г. выделение и изучение антигенов гистосовместимости проходило самостоятельно в лабораториях разных стран; к 1965 г. назрела необходимость сравнить серологическую специфичность выделенных антигенных групп между собой и создать единую международную номенклатуру. Результаты сравнительных испытаний были доложены на Рабочем совещании в Турине в 1967 г., где были представлены четкие доказательства того, что антигены, открытые и изученные в разных странах, идентичны друг другу и присутствуют в той или иной степени во всех исследованных к тому времени популяциях.
В начале Главный комплекс гистосовместимости изучали на уровне антигенов, используя серологические методы. В настоящее время структуру генов Главного комплекса гистосовместимости исследуют с привлечением различных молекулярно-генетических методов: гибридизации in situ, клонирования, рест-рикционного анализа, секвенирования ДНК и других методов.
С тех пор иммуногенетика становится самостоятельной отраслью генетики, то есть учением о генетической детерминированности тканевых антигенов, о наследовании антигенов тканевой совместимости, о роли генетических субъединиц тканевой совместимости в инициировании и реализации иммунных реакций. Она стала мощным импульсом для развития неинфекционной иммунологии, экспериментальной онкологии, транспланталогии, учения о трансплантационном иммунитете.
Перспектива этих исследований заключается в сочетании двух наук: иммунологии и генетики. Специфические антигены и иммунная система, контролируемые генетически, дают представление о механизме иммунного ответа, то есть иммуногенетика включает в себя генетический контроль аллотранс-плантации, или сходства и различия между индивидами (Klein J., 1978). В настоящее иммуногенетика определяется как раздел иммунологи, изучающий вутренние антигенные системы организма; их генетическое предстаительство, хромосомную локализацию (Ю.М.Зарецкая, 2002).
Чрезвычайно важным для фундаментальной иммунологии, клинической медицины и ветеринарии в целом являются исследования роли генов и антигенов I и II классов главного комплекса гистосовместимости в развитии физиологических и патологических процессов. Эти исследования дают возможность выяснить молекулярно-генетические основы предрасположенности идивидов ко многим заболеваниям человека и животных и условия реализации такой предрасположенности.
Главный комплекс гистосовместимости представляет собой полиморфную генетическую систему. Первоначально предполагалось, что ведущая функция МНС заключается в определении судьбы трансплантата. Однако уже в 70-е годы сложилась концепция, согласно которой данный комплекс антигенов ответственен за формирование иммунного ответа; взаимодействие макрофагов, Т-и В-лифоцитов; поддержании иммунологического гомеостаза в целом. В настоящее время известно, что МНС-системе принадлежит существенная роль в определении предрасположенности к различным заболеваниям, а также с репродукцией и продолжительностью жизни (Бондаренко А.Л., 1999).
Функциональная роль МНС генов класса I и 2 стала ясна благодаря накоплению данных об экспрессии их антигенов на поверхности клеток и в различных тканях. Оказалось, что экспрессия - необходимый процесс, сопровождающий различные этапы иммунной реакции. Молекулы I класса представлены на поверхности всех ядросодержащих клеток организма, особенно на клетках крови и иммунной системы. Кроме того, в гаплотипическом состоянии они представлены на спермиях (Halim К. etal., 1981). Fabre W. (1991) подтверждает это положение, но указывает, что антигены МНС класса I отсутствуют на клетках миокарда и некоторых типах клеток слюнных желез.
Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота
Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA - Bovin Leucocyte Antigens) был постулирован в 1978 году в Эдинбурге на первом Международном Рабочем совещании. Этому событию предшествовало независимое исследование нескольких лабораторий, которые выявили одну и ту же лейкоцитарную систему антигенов крупного рогатого скота [Amorena, 1980; Schmid , Caldvel, Ostergard H.). Так, используя аллоиммунные сыворотки многотельных коров в микроцитотоксическом тесте Amorena and Stone (1978) определили 11 кодоминантно экспрессированных лимфоцитотоксических антигена, кодируемых одним локусом названным как BoLA-A. Spooner et al. (1978) обнаружил 17 лимфоцитарных ашгоантигенов, используя антисыворотки, полученные путем аллоиммунизации коров лоскутком кожи от их потомков. Четвертое Международное совещание по иммуногенетике животных стандартиза-ровало серологическое типирование BoLA-системы.
На данном этапе в международных исследованиях признаны 56 аллос-пецифичностей BoLA-системы, отнесенных к локусу A [Hoang-Xuan М., Batra T.R., Spooner R.L.). Существование второго локуса класса I - BoLA-B подтверждается анализом двух cDNA клонов - BL3-6 и BL3-7 (Ennis et al., 1988). Ennis с соавт. нашли 86,2% нуклеотидной гомологии между этими клонами в З -нетранслируемой области. Гомологичность в 86,2% находится в предполагаемых пределах (74-95 %) для аллелей двух различеых локусов класса I. Таким образом, эти авторы показали, что два cDNA клона могут быть двумя экспрессированными локусами класа I (BoLA-A и BoLA-B). Результат был подтвержден одномерным изоэлектрофокусированием, где также было показано наличие более чем одного локуса I класса лимфоцитарных антигенов, экспрессированных на клеточной поверхности (Joosten et al., 1988; Watkins etal., 1989 b).
В дальнейшем Joosten (1990) продемонстрировал экспрессию двух локусов класса 1(А и В) используя как одномерное, так и двумерное изоэлектрофо-кусированиеу животных с "ШОгаплотипом. BoLA-W25 и BoLA W32 определены на третьем Рабочем совещании как экспериментально доказанными антигенами класса I BoLA-B локуса (Bull et el, 1989; Bernoco et al., 1991). Для идентификации каждого антигена применяют не менее 3-5 реагентов, что связано с трудностью получения моноспецифичных антилимфоцитарных сывороток. Чаще всего они бывают олиго- или полиспецифическими. Даже при использовании моноклональных антител к антигенам МНС возможно получение перекрестных реакций.
Серологически определяемые антигены (SD) BoLA-системы класса I идентифицируются в микроцитотоксическом двухступенчатом тесте с помощью абсорбированных моно- или олигоспецифицеских типирующих сывороток, полученных при изоиммунизации лимфоцитами или имплантации кожных лоскутков опытных животных, что качественно отличает их от типирова-ния антигенов гистосовместимости человека, где в основном пользуются сыворотками, полученными от многорожавших женщин (Amorena).
В настоящее время известно несколько способов получения антилимфоцитарных сывороток крупного рогатого скота: от многотельных коров, внут-рикожным введением суспензии лейкоцитов, с помощью трансплантации и имплантации кожи. Исследованиями этих авторов установлено, что у 14-15% коров, начиная с 15-месячного возраста, идет образование цитотоксических антител.
При этом слабые антитела обнаруживаются за 10 дней до отела, но уже через 4-12 дней их титр значительно повышается. Цитотоксические антисыворотки, полученные в результате трансплантации кожных лоскутов, имеют достаточно высокий титр антител. В случае подбора доноров и реципиентов, отличающихся лишь по одному антигену, достигаются наилучшие результаты. Однако, часто при трансплантации даже у идентичных индивидов происходит образование дополнительных цитотоксических антител, направленных к новым BoLA-антигенам.
Основное преимущество метода трансплантации кожных лоскутов заключается в получении более сильного иммунного ответа антител, направленных в основном к антигенам МНС. Специальные эксперименты по HLA-системе показали, что даже моноспецифические сыворотки, полученные в результате абсорбции, имеют различную реактивность и перекрестные реакции, что является основным недостатком при тканевом типировании (Зарецкая, 1983). Типирование антигенов BoLA-системы класса I проводят также с участием моноклональных антител (Kemp S.S., et al., 1990), разработан метод изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Snow L.C., 1991).
Доказано, что большинство лимфоцитарных антигенов не являются общими с уже известными более ста антигенными факторами эритроцитов, относящихся к 13 системам групп крови крупного рогатого скота. Установлено, что локус М групп крови сцеплен с BoLA А16, некоторые антигены В, С, S-системы также сцеплены с локусом A BoLA системы. Очевидно, антигены J системы присутствуют и на лимфоцитах.
Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота расположен на коротком плече 23-й хромосомы и обычно организован, как очень сходный с МНС человека (Fries, 1986). Он является эквивалентом системы лейкоцитарных антигенов человека (комплекс HLA), открытой Dausset (1958), который картирован на 6-ой хромосоме (Lamm et al., 1974). На рис.2 представлена генетическая карта Главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA).
Методика выделения суспензии лимфоцитов
1. 3 мл крови коров наслаивали на градиент плотности (2,5 мл) фикол верографина с плотностью 1,076 - 1,077 и центрифугировали в течении 20 ми нут при 600 g.
Приготовление градиента плотности: к 1 ампуле 76 %-ного верографина добавляли 24,7 мл дистиллированной воды для получения 33,9%-ного раствора верографина, затем 9 %-ный раствор фикола смешивали с 33,9 %-ым раствором верографина в соотношении 24:10. плотность полученного раствора проверяли с помощью ареометра, в случае необходимости доводили ее до 1,076 - 1,077.
Кровь от коров с повышенным лейкоцитозом, а также от телят моложе 6-ти месяцев предварительно разбавляли забуференным физиологическим раствором в соотношении 1:2.
Забуференный физиологический раствор готовили по стандартной методике (рН = 7,2 - 7,4).
После центрифугирования получали следующие фракции: на дне четкий слой эритроцитов, содержащий также и гранулоциты; над ним матовый слой, состоящий из тромбоцитов и лимфоцитов; далее четкое белое кольцо, содержащее в основном лимфоциты; самый верхний слой - плазма крови.
2. Осторожно снимали плазму, которую использовали для постановки ре акции бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови и содержание общего белка и его у-глобулиновой фракции, а кольцо лимфоцитов переносили в чистую центрифужную пробирку с забуференным физиологическим раство ром или раствором Хенкса, центрифугируя при 100g в течение 7 минут до мак симального освобождения от тромбоцитов. Присутствие тромбоцитов в суспен зии лимфоцитов периодически контролировали в камере Горяева под микроско пом (отмывку лимфоцитов проводили три раза в забуференном физиологиче ском растворе).
В случае наличия эритроцитов в лимфоцитарной суспензии последнюю обрабатывали 0,83 %-ным раствором хлористого аммония в течение 1 минуты при периодическом легком встряхивании, после чего дважды промывали суспензию PBS.
3. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендировали в PBS, доводя концентрацию лимфоцитов до 4 - 6 х 10 кл/мл. такая суспензия лимфоцитов готова для разделения ее на субпопуляции.
1. Луночки пластиковых микрокамер для иммунологичесских реакций заполняли вазелиновым маслом для предотвращения высыхания сывороток и суспензии клеток. К 1 мкл тестируемой сыворотки, помещенной под вазелиновое масло, добавляли 1 мкл суспензии лимфоцитов и инкубировали в термостате при температуре 26 - 27С.
2. В каждую луночку добавляли 5 мкл кроличьего комплимента и снова ставили в термостат на 1 час. Усиление цитотоксической реакции при использовании кроличьего комплимента связано с синергическим действием ксеноген-ных антител.
3. Окрашивание проводили эозином, внося в лунки на 3 -5 минуты по 5 мкл 1 %-ного раствора, приготовленного на дистиллированной воде. По истечении указанного срока вносили 5 мкл 40 %-ного формалина для фиксации микроцитотоксического теста. После этого лунки накрывали покровным стеклом. Микроцитотоксический тест, подготовленный таким способом, позволяет производить чтение реакции в течение 2-4 дней.
4. При чтении реакции учитывали клетки, «убитые» цитотоксическими антителами, окрашенные в розовый цвет и имеющие нечеткие контуры вследст вие начавшегося лизиса. Силу реакции оценивали по количеству мертвых клеток по восьми бальной шкале: 1=0-10% мертвых клеток 2 = 10-20% мертвых клеток 4 = 20 - 40 % мертвых клеток 6 = 40 - 60 % мертвых клеток = 80 % мертвых клеток
За положительную реакцию принимали оценки 6-8 баллов. В качестве контроля жизнеспособности лимфоцитов вместо типирующей сыворотки использовали физиологический раствор.
В случае сомнения наличия у обследуемого животного того или иного антигена гистосовместимости, типирование проводили повторно.
Распределение антигенов BoLA-A в популяциях айрширской породы крупного рогатого скота
В результате проведенных исследований установлена частота антигенов BoLA-A класса І у коров айрширской породы таблица 5.
Распределение антигенов BoLA-A было следующим: наибольшее распространение в популяции получили антигены MSUA15 (=0,504; р=0,296), MSUA24 (=0,444; р=0,253), MSUA1 (=0,419; р=0,238), W15 (=0,405; р=0,238), MSUA11 (=0,349; р=0,193) и MSUA12 (=0,333; р=0,183), в тоже время наименьшее отмечено в равной степени для W14 и W31 (f=0,085; р=0,043).
Изучено непосредственное распределение частот антигенов BoLA-A и контролирующих их генов у здоровых, (таблица 6) инфицированных (таблица 7) и больных животных (таблица 8). У животных здоровой группы наиболее часто встречаются антигены MSUA15 (=0,500, р=0,293), MSUA24 (=0,397, р=0,223) и MSUA18 (=0,379, р=0,212) и наименее встречающиеся W14 (=0,086, р=0,044).
Наибольшее распространение у вирусоносителей имеют BoLA антигены MSUA15 (=0,484, р=0,282), W15 (=0,419, р=0,238), MSUA12 (=0,387, р=0,217) и MSUA24 (f=0,387, р=0,217) и наименьшее MSUA13 и MSUA14 (=0,065, р=0,033).
В группе больных животных наиболее часто встречаются антигены MSUA1 и MSUA24 (=0,550, р=0,329), MSUA15 (=0,525, р=0,311) и W15 (=0,450, р=0,286) и менее встречающиеся антигены MSUA7 (=0,025, р=0,013) и MSUA2 (4),050, р=0,025). Характеристика антигенов гистосовместимости в связи с заболеваемостью лейкозом
BoLA-A антигены, определяемые на лимфоцитах периферической крови у восприимчивых и устойчивых к лейкозу коров айрширской породы показали, что антигены MSUA21 (RR=2,842; =5,248; Р 0,05; 5=0,260) и MSUA1 (RR=2,320; %2=4,069; Р 0,05; 5=0,310) имели положительную связь с заболеваемостью лейкозом, таблица 9. Установлена достоверная связь с устойчивостью к лейкозам антигена MSUA7 (RR=0,073; %2=9,458; Р 0,01; 5 =-0,320), который имел достоверно низкую частоту встречаемости в группе больных лейкозом по сравнению со здоровыми животными.
В популяции черно-пестрого скота наибольшая ассоциация с заболеваемостью лейкозом была установлена у антигенов MSUA8 и W19 (RR=14,933; у? =6,942; Р 0,05; 5=0,450), W15 (RR=13,837; і = 3,919; Р 0,05; 5=0,276) и W21 (RR=11,294; %2 =5,025; Р 0,05; 5=0,377) (таблица 14). Также выявлена связь антигенов MSUA24 (RR=0,174; і =7,869; Р 0,05; 5=-2,126), W8 (RR=0,375; %2 =2,650; Р 0,05; 5=-0,172) и MSUA23 (RR=0,544; у? =1,625; Р 0,05; 5=-0,231) с устойчивостью к заболеванию лейкозами.
Анализ генетико-статистических показателей, распределение антигенов в популяции животных, сводится к оценке степени достоверности наблюдаемых альтернатив. Такой альтернативой считается наличие или отсутствие антигена у устойчивых и восприимчивых животных. О достоверности наблюдаемого распределения антигенов при альтернативном разнообразии судят по критерию х2. Достоверность полученного распределения определяют по величине х2 для принятого уровня значимости Р (степени достоверной вероятности) для одной степени свободы. Для четырехпольной таблицы, в которую вписываются значения а, Ь, с и d, число строк и граф таблицы равно 2. Следовательно число степеней свободы -N- (2-1) (2-1) = 1, а значения х2 составят: для Р = 0,95, х2 = 3,8; для Р = 0,99, rf= 6,6; для Р = 0,999, tf= 10,8.
Биологический смысл относительного риска (RR - relatively risk) заключается в вероятности развития заболевания у животных, имеющих данный антиген по сравнению с животными, не имеющими его. Показатель относительного риска более двух считается значимым. При значении RR 1 частота антигена у больных животных становится ниже, чем у здоровых. Это свидетельствует о том, что данный антиген выполняет "защитную" функцию. При значении RR 0,5 защитная роль антигена считается значимой.
В этом случае значение RR определяется как 1/RR с противоположным знаком. Поэтому, чем больше отрицательная величина относительного риска, тем выше защитная роль данного антигена (Зарецкая Ю.М., 1983).
Наибольшее положительное значение относительного риска было определено для антигенов MSUA21 (RR=2,842), MSUA8 (RR=2,336) и MSUA1 (RR=2,320) у животных айрширской породы и MSUA8 (RR=14,933), W19 (RR=14,933), W15 (RR=13,837) и W21 (RR=11,294) у черно-пестрых коров.
Наиболее значимая отрицательная величина относительного риска (RR 0,5) у коров айрширской породы установлена для антигена MSUA7 (RR=0,073) и для антигенов MSUA24 (RR=0,174) и W8 (RR=0,375) у животных черно-пестрой породы.
Атрибутивный риск является возрастающей функцией, как относительного риска, так и частоты фактора риска в популяции и поэтому может быть расценен, как мера тяжести фактора риска заболеваемости для изучаемых популяций. Биологический смысл атрибутивного риска заключается в том, что его величина определяет какой из антигенов, ассоциированных с заболеванием, имеет наибольшую генетическую связь с ним. Высокое значение атрибутивного риска указывает на более тесную связь заболевания с "disease -аллелем. Отрицательное значение атрибутивного риска указывает на то, что частота антигена среди больных животных меньше, чем среди здоровых.
Похожие диссертации на Влияние антигенов Главного комплекса гистосовместимости на заболеваемость лейкозом у коров айрширской и черно-пестрой пород
