Содержание к диссертации
Введение
1Обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о дирофиляриозе и биологии дирофилярий 11
1.2 Распространение дирофиляриоза 16
1.3 Клинические признаки и патоморфологические изменения при дирофиляриозе собак 19
1.4 Диагностика дирофиляриоза 27
1.5 Профилактика и лечение дирофиляриоза 34
2 Собственные исследования 40
2.1 Материал и методы исследования 40
2.2 Результаты собственных исследований 52
2.2.1 Распространение дирофиляриоза у собак 52
2.2.2 Клинические проявления дирофиляриоза у собак 55
2.2.3 Гематологические показатели при дирофиляриозе 67
2.2.4 Патанатомические изменения у собак при дирофиляриозе 71
2.2.5 Патогистологические изменения тканей и органов при дирофиляриозе собак 102
2.2.6 Оценка терапевтической эффективности микрофилярицидных Препаратов при дирофиляриозе собак 135
Обсуждение результатов 139
Выводы 151
Практические предложения 153
Библиографический список 155
- Распространение дирофиляриоза
- Диагностика дирофиляриоза
- Распространение дирофиляриоза у собак
- Патанатомические изменения у собак при дирофиляриозе
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Значение служебного
собаководства для человечества трудно переоценить. Сдерживающим фактором для разведения и улучшения пород собак являются инфекционные и инвазионные болезни. Они не только приносят значительный экономический ущерб, не позволяют использовать собак в различных отраслях хозяйства, спорте, армии, органах правопорядка, обмениваться животными, а также могут быть опасными для людей. К таким болезням относится дирофиляриоз – единственный гельминтоз, который в умеренно-континентальном климате нашей страны передается трансмиссивным путем через комаров (Колодий И.В., 2012).
Дирофиляриоз плотоядных вызывается нематодами рода Dirofilaria, относится к типу Nemathelmintes Schneider, классу Nematoda Rudolphi, подклассу Phasmida Chitwood, отряду Spirurida Chitwood, подотряду Filariata Skrjabin, семейству Onchocercidae Leiper, роду Dirofilaria Railliet et Henry. Род Dirofilaria включает следующие виды: D. immitis, D. repens и D. ursi (Сонин М.Д., 1975; Lok J.B., 1998). У плотоядных наибольшее распространение получили два вида – Dirofilaria immitis (Leidy. J., 1856) и Dirofilaria repens (Railliet A., 1911). D. immitis, паразитируя в правой половине сердца и легочной артерии, способны вызывать тяжелую патологию не только этих органов, но других систем организма. Заболевание приводит к асциту и циррозу печени, в результате механической закупорки и прогрессирующего эндокардита, к эмболии кровеносных сосудов и к внезапной гибели собак (Atwell R.B.,1983; Bredal W.P., 1998; Kume S., 1970; Savell C.M., 1974; Sharma M.S., 1982; Tarello W., 2000). D. repens паразитирует в подкожной клетчатке, что сопровождается гнойным воспалением и может привести к септическому состоянию животных.
Определенную опасность дирофилярии представляют для человека, у которого не достигающие половой зрелости дирофилярии вызывают серьёзную патологию в форме подкожных и субконъюктивальных узелков и поражения глазного яблока. Случаи дирофиляриоза в настоящее время выявляются уже в 39 субъектах Российской Федерации достигающих 59 с.ш., а не только у жителей южных регионах страны (Бескровная Ю.Г., 2009; Дарченкова Н.Н., 2009; Сергеев В.П., 2012). Заболеваемость людей дирофиляриозом не изучена, так как официально не ведется регистрация этого заболевания. Поскольку медицинский персонал не знает об этой патологии, дирофиляриоз диагностируется очень редко. Поэтому эта инвазия, как редко встречающаяся и требующая повышенного внимания, с 2003 года впервые данный паразитоз включен в официальные документы Минздрава РФ (СанПиН 3.2.1333-03 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации», МУ 3.2.1756-03 «Эпиднадзор за паразитарными болезнями» и МУ 3.2.1880-04 «Профилактика дирофиляриоза»).
В последние годы в мире ареал распространения дирофиляриоза собак значительно расширился и в нашей стране достиг Дальнего Востока (Архипов И.А., 1986; Архипов И.А., Архипова Д.Р., 2002; Архипова Д.Р., 2003; Жуков
В.М., 2011; Кадыров У.Г., 2010; Козлов Д.П., 1962; Кудинов А.В., 2002; Пономарев А.А., 2005; Салимов В.А., 2009; Сергеев В.П., 2012; Сухова М.В., 2002; Хударведиев Т.П., 1979). На Южном Урале эти гельминты ранее не были описаны («Гельминты животных, человека и растений на Южном Урале» Уфа, 1974). На территории Республики Башкортостан дирофиляриоз был установлен нами в 2003 году, при вскрытии внезапно павших собак и, в настоящее время, стал широко распространенным заболеванием, что, прежде всего, негативно сказывается на развитии служебного собаководства.
Степень ее разработанности. Большинство научных исследований посвящено изучению распространения D. immitis у собак в том или ином регионе (Аракелян Р.С., 2008; Архипова Д.Р., 2003; Бескровная Ю.Г., 2009; Богданова Т.В., 2010; Веденеев С.А., 2004; Винокурова Д.П., 2011; Колесников П.В., 2009; Колодий И.В., 2009; Медведев А.Ю., 2007; Петров А.М., 1931; Серебрякова Н.В., 2009; Сухова М.В., 2004; Фисько А.М., 2005; Шинкаренко А.И., 2005; Ярошенко Н.В., 2010; Ястреб В.Б., 2003; Baneth G., 2002; Bredal W.P., 1998; Jubb K.F., 1970; Tarello W., 2000; Taylor A.E.R., 1960). Однако, до сих пор недостаточно освещены вопросы прижизненной клинической и лабораторной диагностики, патоморфологии и патогенеза, лечения и специфической профилактики дирофиляриоза (Баранова А.М., 2003; Березанцев Ю.А., 1961; Беспалова Н.С., 1999; Борисова М.А., 1997; Гаркави Б.Л., 1995; Горохов В.В., 1996; Жуков В.М., 2011; Кадыров У.Г., 2010; Кудряшев А.А., 1994; Нагорный С.А., 2012; Согоян И.С., 1962; Супряга В.Г., 2004).
Таким образом, дирофиляриоз собак в условиях Южного Урала изучен недостаточно. Не вызывает сомнения, что исследования посвященные распространению данного заболевания, апробации методов прижизненной диагностики, описание патоморфологических изменений и патоморфогенеза дирофиля-риоза, разработка эффективных методов лечения и профилактики этой инвазии актуальны, теоретически и практически значимы.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлось выяснение патоморфологии, патогенеза, диагностики дирофиляриоза и лечение собак при этой инвазии в условиях Республики Башкортостан.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи.
-
Определить распространение дирофиляриоза у служебных собак в Республике Башкортостан.
-
Выполнить сравнительный анализ методов прижизненной диагностики дирофиляриоза.
-
Выявить клинические признаки и гематологические изменения при ди-рофиляриозе собак.
-
Установить патологоанатомические и патогистологические изменения, патоморфогенез при дирофиляриозе собак в условиях Республики Башкортостан.
-
Провести сравнительное исследование эффективности препаратов используемых для микрофилярицидной терапии дирофиляриоза и профилактики этой инвазии служебных собак.
Научная новизна и ценность полученных результатов настоящей работы заключается в том, что впервые в условиях Республики Башкортостан проведено комплексное клинико-морфологическое и лабораторное исследование служебных собак, и изучено распространение, патоморфология, патогенез и методы диагностики нового для Южного Урала трансмиссивного инвазионного заболевания. Доказано, что наличие дирофилярий в сердце собак, даже в небольшом количестве, может привести к тяжелым патологиям эндокарда, легких (застойная гиперемия, отек, пневмонии), печени (венозная гиперемия и индура-ция, гепатоз), почек (гломерулонефрит). Проведено сравнительное исследование терапевтической эффективности ивермектина, мильбемакса и селамектина с целью совершенствования лечебно-профилактических мероприятий, проводимых против дирофиляриоза служебных собак в Уфимской школе по подготовке специалистов-кинологов МВД Российской Федерации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют имеющиеся в настоящее время сведения: о распространении дирофиляриоза собак, о клинических, патоморфологических проявлениях этого заболевания, об информативности лабораторных методов диагностики микро-филярий, о препаратах, позволяющих эффективно проводить микрофиляри-цидную терапию и, тем самым, профилактировать распространение дирофиля-риоза трансмиссивным путем.
Результаты могут быть использованы в учебном процессе на ветеринарных факультетах, при проведении научно-исследовательской работы и написании учебников, учебных пособий и монографий.
Полученные данные свидетельствуют о широком распространении диро-филяриоза среди собак, поступающих в школу по подготовке специалистов-кинологов практически из всех регионов Российской Федерации. В Республике Башкортостан экстенсивность инвазии у служебных собак достигает 25-30%, а у собак, содержащихся в вольерах, не обработанных с профилактической целью, достигает 90%. Клинические признаки дирофиляриоза выявляются у собак старше пятилетнего возраста. Лечение таких животных осложнено, зависит от степени развития патологических процессов в сердце и других органах, и часто не эффективно. Это необходимо учитывать при разработке лечебно-профилактических мероприятий в служебном собаководстве.
При совершенствовании диагностики дирофиляриоза необходимо учитывать, что методы, основанные на обнаружении микрофилярий, достаточно эффективны и просты в выполнении, но не позволяют провести видовую дифференциацию паразита. Для этого необходимо применять более сложные методики, основанные на полимеразно-цепной реакции или иммуноферментном анализе, экспресс-тесты.
Реализация результатов исследований. Настоящее исследование является разделом комплексной научно-исследовательской работы кафедры морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ (№ госрегистрации 0120.0950308). Материалы диссертационной работы включены в рекомендации «Диагностика, лечение и профилактика дирофиля-риоза собак» утвержденные Управлением ветеринарии Республики Башкорто-
стан (2014), используются в кинологических подразделениях МВД РБ, МВД РФ, ФТС и ветеринарных клиниках г. Уфы, а также в учебной и научно-инновационной деятельности кафедр ветеринарного профиля аграрных вузов РФ.
Публикации результатов исследований. Основные положения
диссертационной работы отражены в 9 научных статьях, в том числе в двух публикациях в рецензированных научных журналах «Вестник Башкирского государственного аграрного университета» и «Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины».
Методология и методы исследования. Методологической основой нашего исследования является комплексный клинико-морфологический подход изучения нового для Южного Урала заболевания – дирофиляриоза собак. Особенностью нашей работы, в отличие от других исследований, выполненных на базе городских ветеринарных клиник, когда диагноз «дирофиляриоз» устанавливался только при появлении клинической симптоматики у домашних собак, заключалась в том, что мы обследовали всех собак, независимо от наличия или отсутствия симптомов дирофиляриоза, что позволило выявлять бессимптомное носительство дирофилярий в популяции собак.
Работа проводилась на кафедре морфологии, патологии, фармации и
незаразных болезней федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Башкирский государственный аграрный университет» и в федеральном
государственном казенном образовательном учреждении дополнительного
профессионального образования «Уфимская школа по подготовке
специалистов-кинологов Министерства внутренних дел Российской
Федерации» в 2003-2013 годах.
Нами было обследовано 650 служебных собак, прибывших в школу для
обучения из двадцати регионов России. При поступлении собак в
кинологическую школу проводили тщательно клиническое исследование
животных. При этом особое внимание обращали на возраст, породу, условия
содержания, регион из которого прибыла собака, длительность пребывания по
постоянному месту службы, перемещения собак в другие регионы, наличие
клинических признаков, результаты проведенных ранее исследований на
дирофиляриоз. Для проведения рентгенологического обследования собак,
использовался переносной рентгенаппарат (модель DIG 360), ток
рентгеновской трубки 10-16 мА, режим экспозиции 50- 60 мАс.
Для лабораторной диагностики дирофиляриоза использовали следующие методы: обогащения по Кнотту (Newton W.L. et Wright W.H., 1956); фильтрации (Wylie J.P., 1970); обнаружения микрофилярий в нативной сыворотке (Архипов И.А., Архипова Д.Р., 2004); мазок крови. Для видовой дифференциации обнаруженных микрофилярий D. immitis от D. repens, использовали следующие методы: окраску на кислую фосфатазу (Chalifoux L. et Hunt R.D., 2003); экспресс-тесты (иммунохроматография) производства Dignostica Fennica (Финляндия) и VetExpert-BioNote Inc. (Южная Корея); окраску по Романовскому-Гимзе.
Гематологические исследования проводили с помощью общепринятых
методов: подсчет лейкоцитарной формулы проводился по окрашенному мазку
крови; подсчет эритроцитов и лейкоцитов проводился в камере Горяева,
гематокрит измерялся с помощью гематокритного капилляра после
центрифугирования. Биохимические исследования крови собак проводились с
использованием полуавтоматических анализаторов «ROKI» и «Mindray» и
реактивов для биохимических исследований производства «Ольвекс
диагностикум».
С целью патоморфологического исследования провели вскрытие 318 трупов собак, поступающих из школы кинологов, а также собак, павших от разных причин и поступавших в «Консультационно-диагностический центр ветеринарной медицины» Башкирского ГАУ. При этом учитывали не только наличие дирофилярий, их количество, величину, локализацию в сердце, но и изучали патологию других органов тканей животных. В необходимых случаях проводили патогистологическое исследование. Гистологическую обработку материала проводили по общепринятым методам, согласно методическому руководству «Морфологические исследования в ветеринарных лабораториях» (МСХ РФ, Москва, 2003). Кусочки толщиной не более 0,5 мм фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, жидкости Карнуа. Затем кусочки обезвоживали и заливали в парафин. С помощью роторного микротома получали срезы толщиной 5-6 мкм и после депарафинации окрашивали их гематоксилином и эозином. Срезы, полученные на замораживающем микротоме, окрашивали гематоксилином и эозином, а для выявления нейтральных жиров окрашивали суданом III.
Микрофилярицидное действие препаратов изучали на собаках, спонтанно зараженных дирофиляриозом и условно распределенных на 3 группы по 20 животных в каждой. В первой группе применяли препараты ивермектина (отодектин, ивермек) подкожно в дозе 0,2 мг действующего вещества на 1 кг массы животного. Ивермектин применяли в форме 1%-го раствора для собак крупных пород («Ивермек») и в форме 0,1%-го раствора («Отодектин») для собак мелких и средних пород, подкожно в область холки с соблюдением правил асептики и антисептики. Во второй группе применяли препараты мильбемицина («Мильбемакс») в дозе 2,0 мг/кг, орально. В третьей группе применяли препараты селамектина («Стронгхолд») дозе 6,0 мг/кг наружно в виде капель на холку. Учет эффективности препаратов проводили путем исследования проб крови до применения препарата, через 24 часа, 48 часов, далее через 7, 14, 21, 28 суток после применения препарата. Кровь исследовали методом обогащения по Кнотту.
Полученные количественные показатели подвергали статистической обработке в соответствие с ГОСТ 11.004-74. Достоверность наблюдаемых различий определяли по критерию Стьюдента. Микрофотографирование проводили с помощью микроскопа и цифровой фотокамеры Nicon Cool Pix 4500.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
В Республике Башкортостан зараженность дирофиляриозом служебных собак составляет 25-30%. Среди собак, содержащихся в вольерах и не подвергнутых профилактической обработке, этот показатель достигает 90%.
-
Традиционные методы диагностики дирофиляриоза, такие как микроскопия капли нативной крови и метод Кнотта, основанные на непосредственном обнаружении микрофилярий, достаточно эффективны и просты в выполнении. Однако они не позволяют провести дифференциацию вида паразита. Для этого необходимо применять сложные методики (ПЦР, ИФА) или использовать экспресс-тесты (иммунохроматография).
-
Клинические признаки дирофиляриоза выявляются у собак старше пятилетнего возраста. Лечение таких животных осложнено и зависит от степени развития осложнений в сердце и других органах.
4. Патоморфологические изменения выявляются в правом желудочке
сердца и легочной артерии в виде дистрофических изменений трехстворчатых
клапанов, вальвулярных эндокардитов и артериитов. Эти процессы приводят к
образованию тромбов, эмболии кровеносных сосудов и внезапной гибели со
бак, в результате механической закупорки легочной артерии, венозной гипере
мии и отеку легких, а в хронических случаях к циррозу печени и асциту. Нали
чие микрофилярий в крови сопровождается развитием гломерулонефритов. D.
repens паразитирует в подкожной клетчатке, что сопровождается гнойным вос
палением и может привести к септикопиемии.
5. Микрофилярицидные препараты (ивермектин, мильбемицин), приме
няемые с интервалом 30-35 дней в теплый период года, губительно действуют
на микрофилярии. Таким образом, не допускается заражение других собак, что
позволяет приостановить дальнейшее распространение инвазии среди служеб
ных собак.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов исследования основана на том, что исходные данные получены на
сертифицированном оборудовании, с помощью современных методик сбора и
обработки информации. Данные достаточно полно опубликованы в доступных
рецензированных источниках и апробированы на крупных специализированных
научных форумах. Основные положения диссертации доложены и обсуждены
на следующих международных и всероссийских научных конференциях:
международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию
ФГОУ ВПО Башкирский ГАУ «Состояние, проблемы и перспективы развития
АПК» (Уфа, 2010); II международной научно-практической конференции
«Безопасность жизнедеятельности: современные проблемы и пути их решения»
(Уфа, 2011); всероссийской научно-практической конференции «Научное
обеспечение устойчивого развития АПК» (Уфа, 2011); 17-й всероссийской
научно-методической конференции по патологической анатомии
«Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики
болезней животных» (Москва, 2011); международной научно-практической
конференции в рамках ХХII международной специализированной выставки
«АгроКомплекс-2012» «Инновационному развитию АПК – научное
обеспечение» (Уфа, 2012); всероссийской научно-практической конференции
«Современные достижения ветеринарной медицины в сельскохозяйственном
производстве. Африканская чума свиней – прогноз, проблемы и пути их
решения» (Уфа, 2012); всероссийской научно-практической конференции в
рамках XXIII международной специализированной выставки «АгроКомплекс
2013» «Современные подходы к обеспечению здоровья животных. Инновации,
опыт, проблемы и пути решения» (Уфа, 2013); всероссийской научно-
практической конференции «Современные достижения ветеринарной
медицины и биологии – в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, библиографический список. Последний включает 198 источников, из них 111 работ отечественных авторов и 87 работ на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 73 рисунками, 7 таблицами.
Распространение дирофиляриоза
Многие страны в мире эндемичны по дирофиляриозу, и это заболевание продолжает распространяться на территории где раньше дирофиляриоз не регистрировался. По мнению многих авторов, главным факторов распространения этого дирофиляриоза является миграция зараженных животных, в крови которых присутствуют микрофилярии. Повсеместное распространение комаров делает возможность передачи дирофиляриоза практически везде, где присутствуют больные собаки. Основным условим враспространения дирофиляриоза является климатические условия, обеспечивающие влажность (60% и выше) и достаточно высокую температуру (23С и выше), необходимые для поддержания жизнеспособности комаров, а также развития личинок в организме комара до инвазионной стадии [17]. Температура, является очень важным фактором, влияющим на распространенность дирофиляриоза, т.к. от температуры зависит не только численность и активность комаров, но и развитие определенного вида личинок дирофиляриоза в их организме (D.immitis или D.repens). При изменении погодных условий сезона передачи инвазии в различные годы исследований отмечается колебание видового состава дирофилярий в организме дефинитивного хозяина. Нормальное развитие личинок D. immitis в организме комара возможно при температура выше 27С в течение 2 недель [13]. Более низкая температура окружающей среды продлевает развитие личинок D. immitis в организме комара. При температуре ниже 15С в течение 50 дней личинки D. Immitis, в организме комара, были найдены живыми, но мало подвижными [142, 150].
Дирофиляриоз, вызываемый D. repens, обнаружен в Бухарской [58], Ростовской областях [1], Абхазии [20], Азербайджане [37, 48], Киргизии [77], Грузии [25], Армении [61], Узбекистане [39, 10, 11, 13,104], Кзыл-Ордынской [91, 101], Семипалатинской областях [29]. На Украине, в зоне полесья, D. repens обнаруживали у 3% исследованных собак [26, 72]. На территории Российской Федерации дирофиляриоз регистрируется в Краснодарском крае [31], Саратове [50, 93, 98], Нижнем Новгороде [70], Волго граде [2], Московской области, Приморском, Хабаровском, Краснодарском, Ставропольском краях, Астраханской, Волгоградской, Ростовской, Липецкой, Воронежской Саратовской, Самарской и Нижегородской областях [108, 109]. Артамонова А. А. [9] проводя исследования в г. Ростов-на-Дону установила 30% зараженность собак дирофиляриями, по данным Серебряковой Н. В. [81] зараженность собак в том же регионе составляет до 28,0%, в Ростовской области до 31,5% по данным Нагорного С.А. [60]. В Республике Калмыкия по данным Архипова И.А., Архиповой Д.Р. [13] инвазированность собак, содержащихся в городских условиях составила 18.5%, собак, содержащихся в сельской местности составила 23.6%. В Московской области Ястреб В.Б. [111] указывает на зараженность от 5,0% обследованного поголовья собак в 2003 году и до 2,3 % в 2007 году. Медведев А. Ю. [56] в своих исследованиях указывает на выявление зараженных собак в Краснодарском крае от 17,52% холодное время года до 42,56% в теплое время года. В Волгоградской области Шинкаренко А.Н. и Петров Ю.Ф. [103] сравнивали зараженность собак дирофиляриями в городе собаки инвазированы на 8,2%, а в области - 10,8%. В Самарской области по данным Салимова В.А. [80] интенсивность инвазии достигает 60%. По данным Управления ветеринарии Самарской области поражение дирофиляриозом собак в г. Самаре в период с 2005 по 2010 гг. составляет от 13,9 до 51,8%. Мезенцев С.В. [57] указывает на пораженность собак дирофиляриозом в г. Барнауле 2008-2012 от 5,0 до 19,2 %. Аракелян Р.С. [7] в Астраханской области установил, что инвазированность собак дирофиляриями составляет 10,9%. Распространение дирофиляриоза приводит к угрозе здоровью людей, подтверждением этому является Письмо Роспотребнадзора от 09.09.2013 № 01/10330-13-32 - «О ситуации по дирофиляриозу в Российской Федерации», по данным этого письма дирофиляриоз человека зарегистрирован в 53 субъектах РФ, из них 29 в Европейской части России. Для дирофиляриоза свойсвенна очаговость распространения. Очаги дирофиляриоза выявлены у жителей в Московской, Рязанской, Тамбовской, Тульской, Воронежской, Липецкой, Челябинской, Новосибирской, Тюменской областях, в Алтайском крае, Республиках Башкортостане, Марий-Эл и Татарстане.
В Нижегородской области при исследовании крови у 86 служебных собак центра кинологической службы Нижегородской области. Выявлено 11 собак, зараженных дирофиляриозом [70]. Дирофиляриоз, вызыванный D. immitis, выявляютт у собак в 50 штатах США. Очаги дирофиляриоза выявлены в Калифорнии и Орегоне, Вайоминг, Юта, Айдахо и Вашингтон [198]. В Италии инвазированность собак D.immitis колеблется от 2,1 до 28,9%, а зараженность D.repens составляет 0,5-8,3% [127, 131, 185]. В последние годы отмечается тенденция к распространению дирофиляриоза не только в южных районах, но и на территориях с умеренным климатом, в местах, где много водоемов - мест для развития комаров. Отмечается быстрое распространение дирофиляриоза собак, вызваемого D. repens, на Украине [36, 49, 74].
Диагностика дирофиляриоза
Учитывая то, что клинические признаки при дирофиляриозе собак на ранних этапах заболевания являются малоспецифическими, очень важное значение при постановке диагноза имеют лабораторные исследования проводимые для выявления в крови личинок дирофилярий или специфических для паразита антигенов. Наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие предупредить распространение инвазии. При этом очень важна дифференциальная диагностика микрофилярий на видовом уровне, поскольку виды Dirofilaria immitis и D. repens обладают разной степенью патогенности по отношению к собакам. Для выявления дирофилярий у животных используются клинико-лабораторные методы диагностики: биохимическое исследование крови, общий анализ крови и специфические методы: микроскопия капли нативной крови или сыворотки, метод обогащенного мазка, ИФА и ПЦР и др.[27]. Диагностика дирофиляриоза обычно заключается в обнаружении и идентификации микрофилярии в крови различными методами. Также необходимо принимать во внимание анамнез и выраженность клинических признаков дирофиляриоза [13]. По данным D. Abraham, R.B. Grieve, J.A. Oaks [112] наибольшее количество микрофилярий в крови обнаруживают вов второй половине дня. Для лабораторного анализа с целью обнаружения личинок дирофилярий образцы периферической или венозной крови необходимо брать в вечерне-ночное время, лучше в теплый период года [14].
Для диагностики дирофиляриоза у собак можно использовать следующие методы: 1. Прямое исследование крови. Метод приемлем только в случаях, когда интенсивность инвазии микрофилярии в крови достаточно высока [13]. Недостатком такого метода по мнению многих исследователей является невозможность идентифицировать микрофилярии до вида [146]. 2. Методы концентрации: - метод Кнотта [147, 191] с используется венозная кровь и раствор уксусной кислоты; W. L. Newton, W.H. Wright [166] предложили усовершенствованный метод Кнотта: при этом 1 мл цельной крови смешивали с 10 мл 2%-ного раствора формалина и смесь центрифугировали в течение 5 минут при 1000-1500 об. /мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок смешивали в равных частях с раствором метиленовым синим. 1 каплю окрашенного осадка помещали на предметное стекло, накрывали покровным и исследовали под микроскопом. Данный метод имеет ряд преимуществ перед другими: все микрофилярии концентрируются в небольшом объеме осадка, состоящего, в основном, из лейкоцитов и разрушенных гемолизированных эритроцитов. Это особенно важно при установлении заражения дирофиляриями при слабой инвазии. - метод с использованием 1 мл 2% раствора сапонина [119]; - метод выявления микрофилярии с применением гематокрита [183]; при данном методе кровь помещают в стандартные микрогематокритные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 8500 об. /мин. После центрифугирования капиллярные трубки помещают горизонтально на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Микрофилярии совершают активные волнообразные движения. При применении данного метода можно исследовать маленький объем крови, но невозможно дифференцировать микрофилярий по видам. 3. Метод фильтрации предложен J.P.Wylie [196]. Через миллипоровые фильтры в шприц набирают 1 мл крови, смешивают с гепарином и добавляют 10 мл лизированного раствора. Полученный лизированный кровяной раствор из шприца пропускают через миллипоровый фильтр. Затем через фильтр медленно пропускают 5-10 мл раствора толуидинового синего. Далее фильтр промывают 10 мл воды, отсоединяют от держателя и исследуют под микроскопом. Окрашенные микрофилярии можно дифференциировать. Этот метод не требует использования центрифуги. 4. Метод количественной диагностики [13, 154] кровь смешивают в шприце с гепарином. Делают 3 мазка, высушивают их и окрашивают красителем Гимза. При обнаружении в мазке в среднем, менее 1 микрофилярий, то считают, что в 1 мл цельной крови меньше 50 микрофилярий, данный метод позволяет не только обнаружить паразитов, но и оценить ее интенсивность инвазии. J.J. Mines [164] H.M. Gordon, H.V. Whitlock [155]. предложили использовать для подсчета микрофилярий в крови специальную камеру. При этом 0,5 мл цельной крови лизируют добавлением 7 мл 0,04%-ного раствора гидрооксида аммония. Специальную камеру заполняют кровью и исследуют под микроскопом, производят подсчет микрофилярий. Количество подсчитанных микрофилярий умножают на 100 и получают число микрофилярий в 1 мл крови. Перспективным методом является клонирование фрагментов генома дирофилярий, данный метод является высокочувствительным и специфичным методом диагностики может применяться для идентификации взрослых особей гельминтов, а также микрофилярий в крови окончательных хозяев и личинок в переносчиках. Человека, болеющего дирофиляриозом, в крови отмечается высокий уровень Ig G [128, 188]. Поскольку виды дирофилярий обладают разной степенью патогенности по отношению к собакам, очень важна дифференциальная диагностика микрофилярий на видовом уровне. При изучении морфологию микрофилярий с использованием специального окрашивания и ультрафиолетового микроскопирования A.E.R. Taylor [186] и установила следующие различия характерные для D. immitis и D. repens в мкм соответственно: длина - 260±5 и 290±10; ширина - 4,5 и 6,0; расстояние от головного конца тела до: нервного кольца - 20 и 23; экскреторной поры - 30 и 30; вэкскреторной клетки - 40 и 33; анальной поры - 74 и 70.
Распространение дирофиляриоза у собак
За период 2009-2011 г.г. нами было обследовано (выявление микрофилярий методом Кнотта) 650 служебных собак прибывших в школу для обучения из 20-ти регионов России. Результаты представлены в таблице 1. Среди них выявлено 106 собак зараженных дирофиляриозом (16,3 %). При обследовании животных учитывался возраст, наличие клинических признаков заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной и других систем, результаты ранее проведенных исследований на дирофиляриоз, регион из которого прибыла собака, длительность пребывания по постоянному месту службы, перемещения собак в регионы в которых дирофиляриоз собак регистрируется очень часто (Ростовская область, Краснодарский край, Республики Кавказа).
Результаты лабораторных исследований крови собак, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что в первый год обследования инвазированность собак дирофиляриозом достигала 17,1%. В последующие годы выявлено снижение количества выявленных зараженных собак. Снижение заболеваемости можно объяснить тем, что это заболевание стали диагностировать, лечить и профилактировать. В комплектующие органы МВД были направлены сведения о зараженных собаках и конкретные рекомендации по организации профилактических мероприятий. С этого времени в подразделениях министерства внутренних дел стали проводиться целенаправленные ветеринарные мероприятия по борьбе с этим опасным заболеванием. В дальнейшем экстенсивность инвазии стабилизировалась, но осталась на достаточно высоком уровне. Практически каждая шестая служебная собака структур Министерства внутренних дел инвазирована.
По результатам наших наблюдений экстенсивность инвазии служебных собак по породам распределяется относительно равномерно (таблица 2). Несколько большее количество инвазированных собак выявляется среди немецких овчарок, что связано с преобладанием данной породы среди служебных собак.
Таким образом, проведенные исследования распространения диро-филяриоза среди служебных собак структур министерства внутренних дел свидетельствуют о широком распространении этого опасного заболевания в подразделениях МВД практически всех регионов России. В Республике Башкортостан зараженность среди служебных собак достигает 25-30%. А среди собак, содержащихся в вольерах, где не проводятся лечебно-профилактические мероприятия, распространение дирофиляриоза достигает 90%. 2.2.2 Клинические проявления дирофиляриоза у собак
Все прибывающие в школу служебные собаки регистрировались. На каждую собаку составлялась «анкета» в которой указывались параметры анамнеза в т.ч.: регион, откуда прибыла собака, особенности кормления и содержания, перенесенные или имеющиеся хронические заболевания, непереносимость лекарственных препаратов, исследования на дирофиляриоз и проводимые профилактические мероприятия (дегельминтизация, вакцинация). После сбора анамнеза проводилось тщательное клиническое обследование собаки: вес, упитанность, качество шерстного покрова, ректальная температура тела, истечения из глаз, цвет конъюнктивы, истечения из носа, трахеальный рефлекс, осмотр наружного слухового прохода, зубов, пальпация лимфатических узлов, состояние суставов (тазобедренных, коленных, локтевых). В обязательном порядке проводили аускультацию сердца и легких. У всех собак производилось взятие крови из подкожной вены предплечья или подкожной вены голени для исследования на дирофиляриоз лабораторными методами.
Основные проблемы, выявляемые при обследовании служебных собак были следующие: у 25-30% собак констатировалась неудовлетворительная упитанность, дирофиляриоз (микрофиляремия) у 25-30% животных, бактериальный или грибковый отит у 3-5%. Кроме того, у некоторых собак диагностировали баланопостит, артрозы (чаще тазобедренных суставов), дерматиты, в том числе вызванные блошиной инвазией, кератиты, завороты век, новообразования, гингивиты вызванные зубным камнем и т.д.
При выявлении у собаки пороков и недостатков исключающих дальнейшее использование собаки в служебной деятельности, данная собака откомандировывалась в распоряжение комплектующего органа для принятия решения о выбраковке или лечении.
Служебные собаки, зараженные дирофиляриями, тщательно комплексно обследовались для выявления наличия или отсутствия признаков дирофиляриоза. В комплекс обследования обязательно входили следующие мероприятия: клиническое обследование в состоянии покоя, клиническое обследование после физических нагрузок (пробежка в течении 15-20 минут), рентгенография грудной клетки, гематологическое и биохимическое исследование крови, повторные исследования крови на наличие микрофилярий после проведения терапевтических мероприятий и в течение всего периода обучения. Биохимическое исследование крови проводилось с использованием полуавтоматических анализаторов ROKI-4 и Mindray BA-88A и реактивов производства "Ольвекс Диагностикум". Для проведения рентгенологического обследования собаки, использовался переносной рентгенаппарат (модель DIG 360), ток рентгеновской трубки 10-16 мА, режим экспозиции 50- 60 мАс. Рисунок 7 Проведение рентгенологического обследования собаки, используется переносной рентгенаппарат (модель DIG 360) В качестве иллюстрации представляем описание некоторых клинических случаев дирофиляриоза, диагностируемых и наблюдаемых нами. Случай 1. В августе 2010 года в школу из Нижегородской области прибыла собака породы бордер-колли, возраст 3 года, содержание вольерное. При обследовании крови с помощью метода обогащения Кнотта была выявлена микрофиляремия. При исследовании методом иммунохроматографии (экспресс-тест) подтвержден диагноз дирофиляриоз вызванный D. immitis. При гематологическом и биохимическом исследовании крови выявлена незначительная эозинофилия - 11% и гиперпротеинемия - 112 г/л. При клиническом обследовании выявлена незначительная одышка после физических нагрузок, положительный трахеальный рефлекс, быстрая утомляемость, редкий кашель.
Патанатомические изменения у собак при дирофиляриозе
В Республике Башкортостан дирофиляриоз был впервые обнаружен нами в 2003 году при вскрытии двух собак в Зональном центре кинологической службы по Республике Башкортостан. На тот момент это считалось случайной находкой – единичным случаем, который вызвал только исследовательский казуистический интерес. В настоящее время это заболевание стало частой находкой при вскрытии не только служебных собак, но и собак, преимущественно крупных пород, содержащихся у частных владельцев, и обнаруживается при вскрытии у 80% собак павших от различных причин, иногда не связанных с дирофиляриозом. При детальном патологоанатомическом исследовании собак обнаруживали патологические процессы не только в месте локализации дирофилярий – в правом желудочке сердца, но и во внутренних органах и подкожной клетчатке. Собаки не подвергались обработкам против дирофиляриоза с лечебной или профилактической целью, вскрытие проводилось с целью установления причины смерти. Смерть иногда была внезапной или в результате эвтаназии, проводимой при неэффективности лечения.
Всего за период исследования мы вскрыли 318 собак и половозрелых гельминтов обнаружили у 23 собак. Возраст собак, у которых обнаружены дирофилярии, варьировал от двух до шестнадцати лет, в среднем возраст больных собак составлял 8 лет. Количество дирофилярий, обнаруженных в сердце, положительно коррелирует с возрастом (коэффициент корреляции 0,3). Мы не выявили преимущественной заболеваемости кобелей или сук, этот показатель распределен приблизительно одинаково. Также не выявили связи между полом и количеством дирофилярий обнаруженных в сердце, что было подтверждено с помощью дисперсионного анализа. В отношении породного состава установили, что чаще дирофилярии в сердце обнаруживали у немецких овчарок (48%), реже у среднеазиатских, восточно-европейских, кавказских овчарок и ротвейлеров (35%), редко у других пород (17%). Это можно объяснить преобладанием овчарок среди служебных собак в нашем регионе.
Количество обнаруженных в сердце дирофилярий было существенным фактором для развития органопатологии у животных. Находили от одного до тридцати девяти гельминтов (в среднем 13). У 22% собак мы обнаружили от одной до трех экземпляров D. immitis в правом желудочке сердца. У 39% собак регистрировали от четырех до десяти экземпляров D. immitis в правом желудочке сердца. У 22% собак регистрировали от одиннадцати до тридцати экземпляров D. immitis в правом желудочке сердца, причем часть дирофилярий располагались в легочной артерии и её ветвях доходящих до легких. У 17% собак подсчитывали более тридцати гельминтов в правом желудочке сердца. Максимальное количество дирофилярий достигало 39 гельминтов. У 20 % собак обнаруживали в подкожной клетчатке D. repens, причем все эти животные относились к группе, у которой в сердце и сосудах ведущих к легким находили более десяти экземпляров D. immitis. Приведем выписки из протоколов вскрытия собак, у которых при вскрытии были обнаружены дирофилярии в сердце и в подкожной клетчатке. Они распределены в зависимости от количества экземпляров дирофилярий обнаруженных в сердце по мере возрастания. По нашим наблюдениям именно этот фактор и определяет появление различных патологий в сердце и осложнений во внутренних органах. 1. Немецкая овчарка, кобель, восьмилетнего возраста. Проведена эвтаназия вследствие неэффективности лечения. В правом желудочке обнаружена одна дирофилярия длиной 17 см. Сердце округлой формы, соотношение толщины правого и левого желудочков 1:4, в полостях сердца рыхлые сгустки крови темно-красного цвета. Острый катаральный колит. Дилатация правого желудочка сердца. Застойная гиперемия и отек легких. Причина смерти эвтаназия. На эндокарде не обнаружили патанатомических изменений связанных с наличием одного экземпляра паразита в правом желудочке (рисунки 15, 16). Патология внутренних органов не связана с носительством паразита. 2. Среднеазиатская овчарка, сука, массой 42,5 кг, 6 летнего возраста. Животное содержалось в вольере. На момент поступления собаки в клинику у животного наблюдалось отсутствие аппетита, вялость, сонливость, слабость. Животное постоянно лежало. Клинический диагноз не был установлен. Было проведено симптоматическое лечение. Состояние не улучшилось, и животное было подвергнуто эвтаназии. Обнаружили три дирофилярии в правом желудочке сердца. Полулунные и створчатые клапаны эластичные, гладкие, полупрозрачные. Соотношение правого и левого желудочка 1:6. Расширение правого желудочка сердца. Непроходимость в области пилорического сфинктера. Обширная гематома под капсулой селезенки и разрыв селезенки рядом с гематомой с кровотечением в брюшную полость (рисунок 17). Новообразование первой пары молочного пакета с правой стороны. Острый катаральный гастрит. Острый диффузный нефрит. Венозный застой и отек легких. Тяжелое клиническое состояние собаки связано с непроходимостью желудка и развитием, вследствие этого крупной гематомы селезенки с последующим разрывом органа, кровотечением в брюшную полость. Дирофиляриоз можно рассматривать как фоновое заболевание, которое не вызвало смерть животного. 3. Вскрытие трупа кобеля черной масти с белыми лапами, 6-летнего возраста, породы – среднеазиатская овчарка, массой около 60 кг. Животное содержалось на улице и пало внезапно. При вскрытии обнаружены следующие патологоанатомические изменения. Заворот правой половины желудка на левую сторону на оборота. Желудок вздут, шаровидной формы, темно-красного цвета, с геморрагической инфильтрацией стенки и содержимого (рисунок 18). Стронгуляционная борозда в пилорической части желудка. Непроходимость в области начала двенадцатиперстной кишки вследствие развития анемического инфаркта. Увеличение и деформация селезенки вследствие ее чрезмерного кровенаполнения. Острая венозная гиперемия и отек легких. Темно-вишневая несвернувшаяся кровь. Общая острая венозная гиперемия. Расширение правого желудочка сердца. В полостях сердца плохо свернувшаяся кровь. Обнаружили три круглых червя - дирофилярий, длинной 32 мм, в правом желудочке. Непосредственными причинами смерти собаки были остановка сердца и асфиксия вследствие венозной гиперемии и отека легких. Это состояние развилось по причине заворота и острого расширения желудка, острой непроходимости кишечника. Наличие дирофилярий в правом желудочке сердца можно рассматривать как гельминтоносительство, т.к. патологоанатомических изменений в месте локализации круглых червей не обнаружили.
