Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
Происхождение домашней овцы (Ovis aries L.) 7
Характеристика пород овец, разводимых в Калмыкии 8
1. Тонкорунные овцы 8
2. Грубошерстные овцы 13
Цитогенетическая характеристика овцы 17
Структура и функция ядрышковых организаторов 19
Полиморфизм ядрышкообразующего района 23
Использование групп крови в селекции овец 29
Материал и методика исследований 38
Иммуногенетический метод исследования 39
Анализ ядрышек в клетках крови 44
Результаты собственных исследований 45
Состояние овцеводства в Калмыкии 45
Продуктивность овец 48
Продуктивность экспериментального поголовья 53
Генетические особенности пород овец, разводимых в Калмыкии: их сходство и различия 61
1. Частота встречаемости антигенов 61
2. Генетические расстояния 73
3. Иммуногенетические маркеры продуктивности 78
Выявление ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови у овец 84
Вариабельность числа ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови у овец 88
Анализ активности ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови у овец пород, разводимых в Калмыкии 94
4. Обсуждение результатов собственных исследований 106
Выводы 117
Предложения производству 118
Список использованной литературы
- Грубошерстные овцы
- Полиморфизм ядрышкообразующего района
- Генетические расстояния
- Выявление ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови у овец
Введение к работе
Актуальность. Калмыкия - один из европейских регионов России, для которого овцеводство традиционно является основной отраслью животноводства.
Системный кризис 90-х лет прошлого столетия привел к резкому падению численности основных видов сельскохозяйственных животных в стране. В результате «реформирования» экономики России произошло резкое падение объемов производства животноводческой продукции. Производство молока и яиц стало низко рентабельным, а мяса и шерсти убыточным (Чинаров Ю.И. и др., 2004; Чинаров Ю.И., 2005).
Особенно в большей мере деструктивные процессы затронули овцеводство Калмыкии. Если за указанный период поголовье овец и коз в стране уменьшилось более чем в три раза, то в республике за это время число овец снизилось с 3,44 млн. в 1990 г до 400 с небольшим тысяч голов в 2000 г., т.е. более чем в 8 раз.
Существование овцеводства в России в XXI веке возможно только при наличии рентабельного производства и стабильного рынка реализации продукции. Современная расстановка приоритетов цен на шерсть, мясо и смушки диктует необходимость интенсивного использования биологических возможностей разных пород, реализации их генетического потенциала.
В условиях сокращения поголовья велика вероятность элиминации ценных генотипов и утери своеобразия отечественных пород (Столповский Ю.А., 1997). Метод генетической паспортизации животных позволяет объективно оценить изменения, произошедшие в породе, и ответить на вопрос: сохранилась ли ее генетическая структура или от нее осталось только название (Саморуков Ю.В., Марзанов Н.С., 2002).
Проблема сохранения, обогащения, рационального использования генофонда всегда актуальна и требует решения многих задач. Одной из них является разработка методов более полной реализации генетического потенциала продуктивности с привлечением методов иммуногенетического и
цитогенетического анализа (Яковлев А.Ф., 1985; Марзанов Н.С, 1991; Попов Н.А., Иванов В.А..1999; Кленовицкий П.М. и др., 2004, 2005).
В связи с тем, что в Калмыкии после значительного спада поголовья овец начинается медленный рост их численности, требуется более продуманный, основанный на современных технологиях подход к восстановлению поголовья.
Традиционная, зоотехническая оценка должна быть дополнена системой генетического контроля. Достаточно информативными являются полиморфные системы, к которым относятся группы крови, и цитогенетический анализ. Изучение продуктивных и биологических особенностей 5 ведущих пород Калмыкии должно внести определенный вклад в разведение овец республики.
Цели и задачи исследований. Целью наших исследований было изучение биологических и продуктивных особенностей овец в Калмыкии, поиск информативных критериев, способных дать прогноз продуктивности. При этом ставились задачи:
охарактеризовать фенотип разных пород овец в Калмыкии;
охарактеризовать генотип разных пород в Калмыкии;
провести сравнительный анализ продуктивных и биологических особенностей в межпородном и межрегиональном аспекте.
провести адаптацию программы Image Scope для анализа структур клеточного ядра у овец.
Научная новизна работы. Впервые:
проведена комплексная оценка биологических и продуктивных качеств разных пород овец, разводимых в Калмыкии;
проведена сравнительная характеристика тонкорунных пород овец Калмыкии и Ставропольского края по генетическим маркерам;
использована характеристика ядрышковых организаторов;
проведена адаптация программы Image Scope для анализа структур клеточного ядра у овец.
6 Основные положения, выносимые на защиту:
анализ продуктивности овец в Калмыкии;
анализ полиморфизма групп крови разных пород в Калмыкии;
сравнительный анализ иммуногенетических показателей овец Калмыкии и Ставропольского края;
характеристика ядрышковых организаторов.
Теоретическая и практическая значимость и реализация результатов исследований.
Материалы исследований расширяют характеристику пород овец Калмыкии, дополняют селекционную работу иммуногенетическими и цитогенетическими параметрами, что позволит повысить эффективность ведения овцеводства.
Апробация работ. Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры общей и частной зоотехнии Калмыцкого госуниверситета в 2005 г.; на Российской научной конференции «Буддийская культура и мировая цивилизация», Элиста, 2003; Всероссийской научно-практической конференции «Наука - XXI веку», Майкоп, 2003; Международной научной конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов, Элиста, 2004; Международной конференции. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, Дубровицы, 2004; Международной научно-практической конференции. Современные технологические аспекты развития животноводства России, Дубровицы, 2005; Межреспубликанской научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий, Краснодар, 2005.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 статей.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и рекомендации по использованию научных выводов.
Содержание работы изложено на 132 машинописного текста. В работе 32 таблицы, 23 рисунков. Список литературы включает 148 наименований, в т.ч. 58 на иностранных языках.
Грубошерстные овцы
В современных условиях в России возрос интерес к грубошерстному овцеводству. Падение спроса на мериносовую шерсть сделало мясные качества овец ценным биологическим признаком. Потребность в дешевой баранине, неприхотливость и экологичность овец грубошерстных пород сделали их разведение привлекательным.
Наиболее ценным направлением грубошерстного овцеводства в Калмыкии является смушковое и мясо-сальное.
Каракульская порода - самая многочисленная среди грубошерстных пород, единственная порода, учение о которой составляет особый раздел зоотехнии, а использование ее в практической деятельности человека -отдельную отрасль народного хозяйства (Н. Гигинейшвили, 1976).
Каракульские овцы созданы на основе курдючных и длинножирнохвостых овец. У этих овец были и есть в настоящее время задатки смушковых свойств, которые систематически, из поколения в поколение совершенствовалось в результате тщательного отбора и подбора животных (А. Николаев, А. Ерохин, 1987).
Ряд авторов (П.Н. Кулешов, 1995; В.М. Юдин, М.И. Котов, 1951; Н.С. Гигинейшвили, 1967) считают каракульскую породу наиболее древней, созданной многовековым отбором ягнят, у которых произошла мутация по извитости волоса. Однако, Б.Н. Васин (1944) и М.Ф. Иванов (1925) рассматривают происхождение каракульских овец как результат скрещивания и считают, что порода имеет сравнительно небольшой возраст.
Каракульские овцы создавались для содержания на пастбищах круглый год на скудных кормах и в экстремальных условиях. Они характеризуются отличной терморегуляцией, нетребовательны к кормам и хорошо переносят значительное снижение массы тела в зимний период.
Климатические и пастбищные условия разведения овец оказали влияние на формирование типа породы. Результаты этих влияний оказались настолько очевидными, что дали основание описывать экологические типы породы (Е.В. Одинцова, И.Н. Дьячков и др. цит. по А.А. Вениаминову, 1984).
Каракульские овцы Калмыкии относятся к типу овец пустынных степей Нижнего Поволжья. По мнению Н.С. Гигинейшвили (1967) экологический тип, даже если он обладает признаками таксономической категории, по своей практической значимости (особенно в племенной работе) уступает другим зоотехническим категориям. Однако, в наших исследованиях, в свете поставленной задачи, будет речь идти именно об экологическом типе.
Каракульские овцы имеют большое разнообразие экстерьера и, как следствие, значительные колебания в живой массе. Живая масса баранов-производителей от 60 до 90 кг, маток 40-70 кг. Естественная плодовитость невысокая - 110-115%.
В России овец каракульской породы разводят в Калмыкии и Астраханской области. Основной продукцией каракульских овец являются смушки, мясо и шерсть получают в виде дополнительной продукции. Ценны смушки однодневного каракульского ягненка. Из черных смушков выше ценятся те, что имеют интенсивную иссиня-черную окраску. Наряду с черными смушками имеются серые (ширази), коричневые (камбар), так называемые золотистые (сур) и розовые (гулигаз). Вопросу наследования главного типового свойства -окрасок каракульских овец, посвящены исследования Б.Н. Васина (1932), М.Ф. Иванова (1947), Н.С. Гигинейшвили (1976).
Черная окраска является доминантной по отношению к коричневой и белой, исключение составляет белая окраска афганских овец - гильджан. Серая окраска каракуля является доминантной над черной.
Овцы каракульской породы являются исключительно приспособленными к экстремальным условиям. Сравнительные исследования Г. Алексеевой (1960) выявили более высокие адаптационные качества каракульских овец в сравнении с курдючными (порода джайдара).
Калмыцкая порода. Курдючные овцы, разводимые в Калмыкии официально именуются эдильбаевскими. Однако, следует уточнить, что фактически они таковыми не являются.
В период войны в 1941-1942 гг. курдючные овцы калмыцкой породы были эвакуированы в Западный Казахстан в Гурьевскую и Уральскую области, где породу стали называть астраханской.
Калмыцкие курдючные овцы стали смешиваться с эдильбаевскими и постепенно название породы астраханская также было стерто, как и калмыцкая.
В начале 80-х годов в хозяйствах Гурьевской области были отобраны наиболее типичные для калмыцкой породы животные, и завезены в несколько хозяйств зоны Черных земель и Эспериментальное хозяйство НИИ сельского хозяйства Калмыкии.
Полиморфизм ядрышкообразующего района
В результате исследований, выполненных в конце 70-х и первой половине 80-х годов текущего века, было показано, что число и морфологический тип ядрышкообразующих хромосом являются видовой характеристикой животных (Графодатский А.С., Раджабли СИ., 1988; Hens L. etal. 1980).
Для домашних животных характерен широкий видовой полиморфизм по числу хромосом, несущий ЯОР и месту локализации ЯОР на хромосомах (Зенгбуш П., 1982; Графодатский А.С, Раджабли СИ., 1988; Кленовицкий П.М. с соавт., 1999; Алексеевич Л.А. с соавт., 2001).
Общим для большинства видов сельскохозяйственных животных является объединение 18/28S- рРНК генов в несколько кластеров, причем гены обоих типов локализованы рядом. В отношении локализации и организации генов 5S - рРНК информация ограничена отдельными видами.
Сведения о генетической регуляции и эволюционном значении числа рибосомных генов и ЯОР в геномах животных и в частности, млекопитающих весьма скудны. Как правило, ЯОР связаны с вторичными перетяжками. Однако, у ряда видов, в том числе у КРС и других представителей Bovidae вторичная перетяжка отсутствует (Киселева Т.Ю. с соавт., 1985). Подробный обзор этого вопроса приведен в ряде монографий (Зенгбуш П., 1982; Графодатский А.С., Раджабли СИ., 1988; Кленовицкий П.М. с соавт., 1999).
Для домашних животных, входящих в семейство Bovidae, характерен высокий консерватизм числа ЯОР. У представителей вида B.taurus и близкородственных ему видов, принадлежащих роду Bos, ЯОР локализованы на теломерных районах пяти пар хромосом: 2, 3, 4, 11 и 28 аутосом. У быка число активных ЯОР колеблется от 3 до 10. Аналогичная локализация ЯОР отмечена у яка. У принадлежащего к этому же семейству буйвола ЯОР выявляются на коротких плечах 3 и 4 пар и на акроцентрических хромосомах 6, 18 и 24.
У входящих в семейство полорогих овец и коз ЯОР также локализованы в теломерных районах хромосом. У овцы они расположены терминально на коротких плечах 1 пары, длинных - плеч 2 и 3 пар и акроцентрических хромосом 4 и 25. А у козы на 2, 3, 4, 5 и 28 хромосомах.
Значительный шаг в изучении ЯОР был сделан после того как Goodpasture С. и Bloom S. (1975) установили возможность их выявления путем окраски азотнокислым серебром a Howell W. и Black D.(1980) усовершенствовали этот метод. Подавляющее число работ по цитологическому анализу ЯОР основано на методе Хавела-Блэка и его модификациях.
Помимо широко используемой методики выявления ЯОР азотнокислым серебром (Howell W., Black D., 1980) используется N-окраска и окраска Кумаси бриллиантовым синим (Макаров В.В., Сафронов В.В., 1978; Яковлев А.Ф., Бавин В.Г. и др., 1984). При окраске азотнокислым серебром отмечено стабильное выявление ЯО. Методом окраски Кумаси были выявлены подобные ЯО структуры только в части клеток и не у всех животных. При окраске N-методом специфическая окраска зон ЯО отсутствовала. Следовательно, лишь Ag+- метод оказался пригодным для изучения ядрышковых организаторов (Кленовицкий П.М. и др., 1995). В результате многочисленных исследований показано широкое распространение в пределах видов полиморфизма ЯОР, затрагивающее число, размеры и морфологию ЯО.
Так у свиней ЯОР соответствовал районам вторичных перетяжек 8 и 10 пар, причем для европейских пород характерно преобладание Ag окрашенных ЯОР на 10 хромосоме (Графодатский А.С., 1981; Стефанова В.Н.,1981; Вишневская С.С., Всеволдов Э.Б., 1986) при этом отмечен межклеточный и межиндивидуальный полиморфизм по среднему числу ЯО в метафазе (Стефанова В.Н., 1983).
В работе Myake Y. с соавт. с использованием изотопной метки, включенной в зонд, комплементарных рРНК, была подтверждена локализация генов рибосомной РНК в зоне вторичной перетяжки на 10 хромосоме у свиней. Аналогичные данные были получены и в отношении локализации рРНК генов на 8 хромосоме свиньи (Mellink С.Н., 1991; Anderson et.al.1993).
В ранних исследованиях по изучению ЯОР несущих хромосом высказывалось мнение, что для домашних свиней европейского и азиатского корня характерно четкое различие по числу активных ЯОР (Вишневская С.С, Всеволодов Э.Б., 1986; Графодатский А.С., 1981), а наличие клеток, несущих дополнительные активные кластеры рРНК генов рассматривалось как погрешность исследования.
Генетические расстояния
Наследственный полиморфизм антигенов эритроцитов был использован для установления филогенетических взаимосвязей между исследованными породами. С этой целью были рассчитаны индексы генетического сходства и генетические дистанции.
Анализ распределения по суммарным частотам подтверждает реальные взаимоотношения, сложившиеся между породами. Установлены общность происхождения, и различия в направлении продуктивности и зонах разведения.
Генетические дистанции, рассчитанные по А.С. Серебровскому и М.Нею несколько различаются, однако общая тенденция сохраняется.
Ничтожно малое генетическое расстояние было между грозненской и ставропольской породами. Ведь обе породы выводились в одних экологических условиях, а генетический вклад асканийской породы в одном случае и австралийских мериносов в другом не оказал существенного влияния.
Грубошерстные породы достаточно находятся от ставропольской и, грозненской пород, что является закономерным, так как направление продуктивности у них разное. Расстояние между калмыцкой и каракульской породами незначительно и указывает на одинаковую адаптацию. В данном случае остается неясной природа огромной дистанции между породами советский меринос и другими мериносовыми породами. То, что они являются неродственными породами, мало объясняет наибольшую дистанцию между ними. Предполагается, что приспособление к экологическому прессингу у этих пород пошло по разным путям, что сказалось на преимуществе тех или иных антигенов.
Основополагающей проблемой повышения эффективности животноводства является определение генетических детерминант высокой продуктивности сельскохозяйственных животных и целенаправленное их использование в селекционном процессе. Разработка этой проблемы предусматривает решение задач по установлению связи локусов генома животных с хозяйственно-ценными признаками и отбору значимых для селекционных целей маркеров (Л.А. Калашникова, 1997; В.Г. Шевченко, Т.Ю. Шмидт, 2000). Группы крови, благодаря своей неизменяемости в течение жизни животного и независимости от условий внешней среды, представляет удобную генетическую модель для поиска маркеров продуктивности (В.Н. Тихонов, 1991). В пользу данного высказывания свидетельствуют исследования ряда ученых, в которых установлена положительная как жирномолосность, обильномолочность в скотоводстве (Ю.Г. Быковченко, 1991; Л.А. Герасимова, 1995; Деева, Н.О. Сухова, 2002), стрессустойчивость и жизнеспособность в свиноводстве (В.Н. Тихонов, 1991; А.А. Новикова, 1997).
Однако исследований, посвященных выявлению генетических маркеров хозяйственно-ценных признаков у овец, выполнено недостаточно как в нашей стране, так и за рубежом. До настоящего времени нет объективных данных, позволяющих судить о взаимосвязи между генетическими характеристиками овец и признаками их продуктивности.
С целью выявления антигенов эритроцитов сопряженных с хозяйственными признаками, был проведен сравнительный анализ показателей настрига шерсти и живой массы овец с различными антигенами групп крови (табл. 22, 23).
В результате анализа наших данных выявлено, что в каждой исследованной породе существуют собственные маркерные антигены, сопряженные с продуктивностью
Анализ показателей шерстной продуктивности у овец мериносовых пород показал, что большая часть эритроцитарных антигенов была нейтральная по отношению к данному признаку. Однако имелся общий антиген Be системы В, который обуславливал незначительное превосходство по настригу.
Различий было гораздо больше. Так, у овец ставропольской породы наличие АЬ антигена давало преимущество в настриге шерсти на 0,33 кг, разница была достоверной (Р 0,99). Достоверно был выше настриг у носителей СЬ антигена (Р 0,999).
У овец грозненской породы овцы, носители антигена Be на 0,29 кг превосходили средние показатели по породе (Р 0,999). Также более высокий настриг имели овцы не имеющие СЬ антиген (Р 0,99). Однако мы не можем учитывать этот показатель, так как таких овец было две.
У овец породы советский меринос самый высокий настриг получен от носителей Ма и АЬ антигена (Р 0,999).
У овец грубошерстных пород также имелась разница в настриге. Так, у овец каракульской породы АЬ антиген обусловил разницу в настриге на 0,22 кг (Р 0,95). У овец калмыцкой породы выявлено два антигена, носители которых достоверно превосходили средние показатели по породе: Ма - носители на 0,35 кг (Р 0,999) и Са на 0,2 кг (Р 0,95). Анализ живой массы среди овец-носителей тех или иных антигенов также не выявил общего маркера.
Выявление ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови у овец
Для оценки активности ядрышковых организаторов можно использовать их число и/ или площадь (Кленовицкий П.М., Гусев И.В., 2001). Однако из-за малых размеров ядрышек в значительной части лимфоцитов точное определение их площади затруднено. В связи с чем при оценке активности ядрышек в лимфоцитах овец мы основывались только на подсчете их числа в клетках белой крови.
От каждого подопытного животного исследовали не менее 100 клеток. В результате исследований было установлено, что в популяции циркулирующих лимфоцитов, после окраски серебром выделяется два типа клеток покоящиеся лимфоциты (рис. 11) и лимфоциты с активными ядрышкоми (рис. 12).
Интактные лейкоциты овцы Окраска азотнокислым серебром по Хавелу-Блейку. Микроскоп Nicon microphot -FX, увеличение 100х. Система Image Scope 1. Ядрышки отсутствуют.
Среди обследованных лимфоцитов более 90,0 % несли активные ядрышки. На рис. 12 представлено распределение лимфоцитов овец по числу активных ядрышек, выявляемых при окраске азотнокислым серебром. Число ядрышек выявляемых в лимфоцитах овец колебалось от 1 до 10. Таким образом, максимальное значение этого показателя совпадало с числом кластеров рибосомных генов у овцы.
Мы проанализировали зависимость между числом ядрышек и линейными размерами лимфоцитов. Для этого по выборке из 100 клеток средствами системы Image Scope 1 для каждого лимфоцита определили величину среднего диаметра. Коэффициент корреляции между средним диаметром и числом ядрышек в клетке составил 0,46 (р 0,05).
Как видно из рис.15 в сегментоядерных лимфоцитах овец окрашенные ядрышки отсутствуют. Это подтверждается и сравнением клеток, представленных на рисунках 15 и 16. Аналогичные результаты были получены на нутриях Гришиным В.Н. и др. (2002). Возможно, что это связано с различиями в функциональных особенностях моноцитов и полиморфоядерных лимфоцитов.
Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что мы действительно имеем дело с избирательной окраской локализованных в ядрышках продуктов, обеспечивающих синтез рРНК. Подтверждением чему служит тот факт, что хотя в большинстве случаев ядрышки в лимфоцитах окрашиваются как монолитная структура (рис. 17 а и б), в части клеток ядрышки имеют дисперсную структуру, а характер их окраски напоминает окраску ядрышек в активно функционирующих клетках (рис. 17 в и г).
Характер окраски клеток представленных на рис. 17 в) и 17 г), очевидно, обусловлен наличием в ядрышках этих клеток большого количества белков транскрипционного комплекса, окрашивающихся азотнокислым серебром. Вероятно, в данном случае мы именем дело либо с молодыми лимфоцитами, либо клетками, специфическая функция которых была стимулирована действием внешних (иммунных) раздражителей. Необходимо отметить, что доля таких клеток не высока и составляет 2,5% от лимфоцитов, окрасившихся азотнокислым серебром.
Нами была изучены особенности окраски азотнокислым серебром клеток лимфоцитарного ряда у овцематок трех пород (рис. 18). Для анализа нами были взяты овцы разного направления продуктивности (калмыцкая, каракульская и советский меринос). Животные этих пород достоверно различаются между собой по основным признакам, характеризующим их продуктивность.
Из приведенных на рисунке 18 данных видно, что характер распределения числа активных ядрышек в лимфоцитах у овец исследованных пород в значительной мере совпадает. Модальное число ядрышек у животных всех пород равно 3. Вместе с тем, отмечаются определенные породные различия. Наиболее четко существование этих различий иллюстрируют данные, приведенные в таблице 26.
