Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ГЛИКОЛАТОКСИДАЗА И ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ 14
ЗНАЧЕНИЕ В РАСТЕНИЯХ С РАЗЛИЧНЫМ ТИПОМ
МЕТАБОЛИЗМА
1.1. Фотодыхание у С3 - и С* - растений 14
1.1.1. Гликолатный путь у Сз - растений 14
1.1.2.Типы фотосинтетического метаболизма 16
Фотосинтез у С3 - растений 16
Фотосинтез у С4 - растений 17
САМ - метаболизм 20 1.1.3. Гликолатный путь у С4 - растений 22
Связь между ВПФП и фотодыханием 23
Гликолатоксидаза 24
Реакция и ее механизм 24
Распространение гликолатоксидазы 25
Очистка гликолатоксидазы 26
Свойства гликолатоксидазы 27
Кодирование гликолатоксидазы в геноме различных растений и 28 животных
1.4. Адаптация растений к воздействию стрессовых факторов 32
Общие представления о стрессе 32
Влияние освещения на метаболизм растительной клетки 33
Влияние света на темновое дыхание З 3
Влияние света на фотодыхание 35
Ответная реакция растений на солевой стресс 37
Влияние гипотермии на метаболизм растений 47
1.4.5. Роль ферментов в адаптации растительного метаболизма к 55
неблагоприятным факторам среды
1.5. Значение гликолатного пути в метаболизме 56
Фотодыхание как энергетический процесс 56
Роль фотодыхательных интермедиатов в метаболизме растений 58 1.5.3 Функции пероксисомального метаболизма 66 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 71
Объекты исследования 71
Методы исследования 71
Метод выделения ферментов из растительных объектов 71
Метод разделения клеток обкладки и мезофилла кукурузы 72
Метод определения перекрестного загрязнения тканей 72
Методы определения активности ферментов 72 2.2.4.1.Метод определения активности гликолатоксидазы 72 2.2.4.2.Метод определения активности аконитатгидратазы 73 2.2.4.3.Метод определения активности фумаратгидратазы 74 2.2.4.4.Метод определения активности ФЕП - карбоксилазы 74 2.2.4.5.Метод определения активности НАДФ - МДГ 75
Методы очистки изучаемого фермента 75
Методика очистки ГО из целых листьев 75
Методика очистки ГО из клеток обкладки и мезофилла кукурузы 76
Исследование кинетических характеристик и регуляции ферментов 77
Метод определения количества белка 77
Метод определения содержания хлорофилла 78 2.2.9.Методы создания физиологических стрессов 78
Метод создания условий с повышенной освещенностью 78
Метод создания солевого стресса 79
Метод создания гипотермии 79
2.3. Статистическая обработка данных 79
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ 80
ГЛИКОЛАТОКСИДАЗЫ У С4 - РАСТЕНИЯ КУКУРУЗЫ
Распространение ГО в растениях с различным типом метаболизма 80
Распределение активности ГО между тканями листа С4 - растения 81 кукурузы
3.3. Определение перекрестного загрязнения между изучаемыми тканями 82
3.4.Очистка ГО из С3 - и С4 - растений 83
Очистка ГО из Сз - растения пшеницы 83
Очистка ГО из целых листьев С4 - растения кукурузы 85
Очистка ГО из мезофилла и клеток обкладки проводящих пучков 87 кукурузы
3.5. Изучение каталитических свойств ГО из листьев пшеницы и клеток 91
обкладки и мезофилла кукурузы
3.6. Изучение влияния некоторых метаболитов на активность ГО в 94
растениях
3.6.1. Изучение влияния изоцитрата и сукцината на активность ГО из С3 94
- и С4 - растений
3.6.2. Изучение влияния глицина и серина на активность ГО из С3 - и С4 98
- растений
ГЛАВА 4. РОЛЬ ГЛИКОЛАТОКСИДАЗЫ В АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ 100 С РАЗЛИЧНЫМ ТИПОМ МЕТАБОЛИЗМА К ИЗМЕНЕНИЯМ УСЛОВИЙ СРЕДЫ
4.1. Изучение влияния интенсивности освещения на метаболизм 100
растений
4.1.1. Изучение влияния интенсивности освещения на темновое дыхание 100
растений
4.1.2. Влияние интенсивного освещения на гликолатный путь в 108
растениях с различным типом метаболизма
4.1.3. Изучение влияния интенсивного освещения на этиолированные 114
проростки кукурузы и пшеницы
4.2. Изучение влияния засоления на активность ГО в С3 - и С4 - 117
растениях
Изучение влияния кратковременного засоления на активность ГО в 117 С3 - и С4 - растениях
Изучение влияния длительного засоления на активность ГО в С3 - 122 и С4 - растениях
4.3. Изучение действия положительных пониженных температур на 126
активность ГО в Сз - и С4 - растениях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 133
ВЫВОДЫ 137
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 139
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ФЕП -КК - фосфоенолпируват - карбоксикиназа
ФГК - фосфоглицерат
ФМН - флавинмононуклеотид
ФГ - фумаратгидратаза
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЩУК - щавелевоуксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
Введение к работе
глюконеогенетическим (Igamberdiev A. U., 2002). При этом у С3-растений теряется до 50% ассимилированного углерода.
Многие методы, применяемые для обнаружения фотодыхания в целых листьях, говорят о том, что у С4-растений фотодыхание отсутствует, или же его активность не велика (Brown W. V., 1975; Глаголева Т. А., 1975). Это, однако, не связано с отсутствием ферментов фото дыхания. Вероятнее всего, обмен веществ, связанный с функционированием гликолатного пути, просто подавлен. У С4-растений для защиты от фотодыхательных потерь существует функциональное разделение фотосинтетических процессов между клетками обкладки и мезофилла. В клетках обкладки достигается уменьшение содержания Ог, что приводит к снижению оксигенирующей активности РУБФ-карбоксилазы (Chollet R., 1975). Предполагают, что в результате работы С4-цикла в клетках обкладки пучков в процессе фотосинтеза поддерживает относительно высокий уровень С02. В результате этого отношение С02/ 02 у них выше, чем у Сз-растений, а это благоприятствует фотосинтезу и способствует подавлению синтеза гликолата (Любимов В. Ю., 1985). Ключевым ферментом гликолатного пути является ГО - оксидаза L-2-гидроксикислот (гликолат: Ог-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.15), которая локализована в пероксисомах фотосинтетических тканей. Она окисляет различные 2-гидрокислоты, но более специфична к гликолату.
Ферменты гликолатного пути были выделены преимущественно из Сз-растений. Однако имеются данные об их присутствии у некоторых С4-растений (Любимов В. Ю., 1984), но их локализация и функциональная роль остаются слабо изученными. Участие фотодыхания в адаптивной реакции растительного организма рассматривалось в ряде работ. Было показано, что этот процесс активируется при засолении (Cheesman J. М., 1988), изменении интенсивности освещения (Шахов А. А., 1993), повышенной температуре (Косулина Л. Г., 1993), развитии окислительного стресса (Калинкина Н. Г., 2001). Основным фактором, регулирующим интенсивность фотодыхания, является уровень освещенности, от которого зависит скорость оксигеназной реакции РуБИСКО. Однако, у С4 - растений, клетки обкладки, содержащие этот фермент, обеднены кислородом и изучение световой регуляции ферментов гликолатного пути в
различных тканях остается нерешенной проблемой. В Сз-растениях основной поток окислительного С02 и 02 газообмена идет по пути оксегенирования РБФ и последующей метаболизации гликолата. Возможно, что какая-то часть гликолата у С4 растений синтезируется за счет РуБФ-оксигеназы, т.к. в обкладке проводящих пучков поддерживается определенная концентрация 02. Это особенно справедливо для С4-растений, у которых очень высокая активность фотосистемы II, а хлоропласта клеток обкладки характеризуются повышенной способностью к выделению 02 (Osmond СВ., 1971). Но, по -видимому, основным источником гликолата у С4-растений является окислительный путь от оксалоацетата через малонат или гидроксипируват с участием активных форм кислорода (Del Rio L. A. [et al.], 1998; Любимов В. Ю., 1985), образование которых интенсифицируется при воздействий стрессоров различной природы, таких как пониженная и повышенная температура, засоление, гипероксидная атмосфера, воздействие патогенов.
Развитие толерантности в стрессовых условиях зависит от энергетического статуса клетки, в которой индуцируются соответствующие изменения, поэтому многие ткани растения при стрессе испытывают повышенные потребности в быстрометаболизируемых углеводах, что может поддерживаться за счет обходных реакций, в том числе, и реакций гликолатного пути.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение особенностей функционирования изоформ гликолатоксидазы в листьях кукурузы и выявление роли этого фермента в адаптивной реакции растений с различным типом метаболизма к условиям среды. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить распространенность гликолатоксидазы у растений с различным типом метаболизма.
Осуществить разделение изоформ гликолатоксидазы из клеток обкладки и мезофилла листьев кукурузы и идентифицировать их тканевую специфичность.
Провести очистку изоформ гликолатоксидазы из различных тканей листа кукурузы.
Изучить каталитические и регуляторные свойства изоформ гликолатоксидазы, имеющих различную тканевую специфичность.
Исследовать динамику изменения активности гликолатоксидазы в растениях с различным типом метаболизма при варьировании условий освещенности и выявить корреляцию активности функционирования этого фермента с интенсивностью окислительного метаболизма митохондрий.
Изучить индукцию активности гликолатоксидазы в листьях этиолированных растений при зеленении.
Исследовать активность гликолатоксидазы у различных растений под влиянием хлоридного засоления.
Изучить функционирование гликолатоксидазы у Сз - и С4 -растений в условиях пониженной температуры.
Научная новизна работы. Нами была модифицирована методика разделения клеток обкладки и мезофилла С4 - растений, что позволило провести эффективное деление тканей листа кукурузы и обнаружить наличие нескольких изоформ ГО различной локализации. Впервые был очищен ферментный препарат ГО из клеток мезофилла кукурузы и изучены каталитические свойства этой изоформы в сравнении с ГО из клеток обкладки С4 - растения кукурузы и листьев Сз - растения пшеницы. Исследована регуляция активности различных изоформ ГО из С4 - растения кукурузы некоторыми метаболитами дыхания и гликолатного пути.
В представленной работе проведено исследование динамики активности ключевого фермента гликолатного пути - ГО в растениях с различным типом метаболизма, подвергавшихся стрессовым воздействиям. Изучен характер изменения активности ГО в растениях с различным типом метаболизма и различных по функциональной нагрузке тканях одного растения в условиях интенсивного освещения, засоления и гипотермии. Показано, что мезофилльная форма ГО менее устойчива к стрессорам различной природы, что указывает на возможную протекторную роль мезофилльных клеток кукурузы в защите фотосинтетического метаболизма С4 - растений от повреждающего действия факторов внешней среды.
Практическая значимость. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о физиолого -биохимических механизмах участия пероксисомальных процессов в адаптации растительных клеток. Традиционно считается, что фотодыхание снижает продуктивность сельскохозяйственных культур, однако получение мутантных организмов, дефицитных по этому пути, показало снижение их жизнеспособности (Blackwell R. D.[et al.], 1990; Leegoon R. С. [et al.],1995; Igamberdiev A. U., 2001). Фото дыхание защищает растения от фотоингибирования, развивающегося при различных стрессовых условиях (Wingler А., 2000), а также участвует в поддержании энергетического статуса хлоропластов при лимитированном поступлении СОг и высокой интенсивности освещения (U. Heber [et al.], 1996). При изучение регуляции гликолатного пути нами получены данные о модуляции активности гликолатоксидазы, которые представляют интерес в понимании механизмов объединения энергетического и конструктивного обмена в единую целостную регулируемую систему, определяющую в конечном счете продуктивность растений. Представленные данные важны для получения новых сортов растений, обладающих повышенной экспрессией гликолатоксидазы как одного из механизмов устойчивости к изменениям факторов среды.
Модифицирован метод эффективного разделения клеток обкладки и мезофилла на примере С4 - растения кукурузы, у которого эти ткани несут различную функциональную нагрузку. Это позволит в дальнейшем изучить особенности локализации изоформ ферментов цикла Кальвина и гликолатного пути у различных представителей растений с С4 - типом метаболизма. Получены высокочищенные белковые препараты изоформ ГО из клеток обкладки и мезофилла, которые различаются по каталитическим свойствам, а также регуляцией дыхательными интермедиатами. Полученные предложенным путем препараты могут применяться для аналитического определения гликолата в биологических образцах.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты
исследований вошли в курсы лекций по «Физиологии растений», спецкурсы «Дыхание растений» и «Фотосинтез».
Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 7-ой международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры VII» (Пермь, 2000), III съезде фотобиологов (Воронеж, 2001), 6 - ой и 9-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука 21 -го века» (Пущино, 2002, 2005 гг.), V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), научных сессиях Воронежского государственного университета (1999, 2001, 2003).
Публикации. Результаты работы изложены в 12 публикациях: 7 статьях и 5 тезисах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературных данных, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе использовано 252 литературных источника, из них 91 отечественный и 161 иностранный. Иллюстрационный материал включает 39 рисунков, 8 таблиц.
