Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Современное состояние метода клонального микроразмножения 6
1.2 Адаптация растений к нестерильным условиям 12
1.3 Покой и его роль в росте и развитии растений 15
1.4 Влияние света, фотопериода и температуры на рост и развитие растений 24
1.5 Влияние различных химических веществ на сокращение и преодоление периода покоя 30
1.6 Влияние элементов минерального питания на рост растений 32
1.7 Рост и развитие растений, размноженных in vitro в полевых условиях, а также использование метода в садоводстве 38
2. Цели и задачи исследований 42
3. Материал и методы исследований 43
4. Результаты исследований 53
4.1 Укоренение микрочеренков 53
4.2 Рост и развитие растений в зависимости от спектрального состава света и освещенности 66
4.3 Влияние продолжительности фотопериода на рост и развитие растений, полученных методом in vitro 94
4.4 Влияние элементов минерального питания на рост и развитие растений, полученных методом in vitro 105
4.5 Влияние тидиазурона и гибберелловой кислоты 3 на возможность сокращения и предотвращения периода покоя 121
4.6 Рост и развитие растений вишни и сливы после клонального микроразмножения в полевых условиях 125
5. Экономические аспекты применения метода клонального микроразмножения 128
6. Обсуждение результатов 131
Выводы 141
Рекомендации производству 143
Список использованных источников
- Покой и его роль в росте и развитии растений
- Рост и развитие растений, размноженных in vitro в полевых условиях, а также использование метода в садоводстве
- Влияние продолжительности фотопериода на рост и развитие растений, полученных методом in vitro
- Влияние тидиазурона и гибберелловой кислоты 3 на возможность сокращения и предотвращения периода покоя
Введение к работе
Объем мирового производства плодов косточковых культур значителен, особенно в северном полушарии, и уступает только семечковым. Однако, в последние десятилетия, происходило и продолжается постоянное сокращение площадей этой группы насаждений в России и странах СНГ. Вместе с тем, спрос на свежие плоды косточковых культур остается стабильно высоким, особенно отечественного производства, поскольку продукция относится к категории скоропортящейся и не подлежит длительному хранению. Это обуславливает интерес к восстановлению садов косточковых современными и районированными сортами, с принципиально новыми качественными характеристиками и экологическими возможностями, в связи с чем, растет потребность в таком посадочном материале (Г.В. Еремин, 2003).
Использование основных способов размножения древесных плодовых культур, таких как прививка и окулировка становится все более проблематичным из-за чрезвычайно высокой трудоемкости. Все актуальнее становятся более производительные методы вегетативного размножения, такие как черенкование и, особенно, клональное микроразмножение. Ряд преимуществ, таких как, отсутствие поросли подвоя, возможность быстрой регенерации за счет спящих почек при механическом повреждении или подмерзании деревьев позволяет, в итоге, создавать более долговечные сады (Е.А. Сидорович, 1996; Г.В. Еремин, 2000).
Корневая система корнесобственных деревьев расположена ближе к поверхности почвы, что позволяет выращивать их на участках с относительно высоким уровнем залегания грунтовых вод. Такие растения полностью сохраняют материнские свойства и признаки, отсутствует возможное при прививке влияние подвоя (В.Ф. Палфитов, 2004).
Лидерство по промышленному выращиванию посадочного материала in vitro принадлежит США, где к 2000 году оно достигло 130 млн. растений в год. Производство плодовых и ягодных саженцев выросло с 1995 по 2000 г на 57% (на 5852000 шт.). Преимущественно, их использовали для закладки маточников и маточно-черенковых насаждений (R.H. Zimmerman, 2001).
В отечественной практике успехи в данном направлении не столь значительны, речь о промышленном производстве, за редкими исключениями, не идет, хотя многолетние и результативные исследования создали для этого необходимые предпосылки. По многим видам плодовых растений была отработана породно-сортовая специфика культивирования in vitro на лабораторном уровне. Вместе с тем, проблематичным оказался переход с материалом древесных плодовых культур в полевые условия. Особенности вегетации растений в умеренном климате, а также отсутствие разработанных проектов современных культивационных сооружений с системами поддержания параметров окружающей среды в заданных значениях не позволяли достичь высоких показателей приживаемости регенерантов после высадки в грунт и обеспечить стабильность их роста и развития в этот период, что и обусловило актуальность настоящих исследований. Основой для выполнения данной работы послужил вывод о возможности и эффективности проведения предпосадочной подготовки адаптированных микрорастений путем охлаждения как средства активизации и синхронизации роста растений, продемонстрированный на примере вишни сорта Память Еникеева (В.В. Чивилева, 2003).
Новизна работы заключается в том, что впервые в России были проведены масштабные исследования на ряде сортов вишни и сливы по влиянию спектрального состава света, фотопериода и уровня освещенности, а также влияния элементов минерального питания на рост растений вишни и сливы в период адаптации к нестерильным условиям и после охлаждения в искусственных условиях. На основании этого были оптимизированы условия выращивания растений, полученных методом in vitro, позволившие повысить приживаемость растений в процессе адаптации и их жизнеспособность в полевых условиях, а в итоге сократить время выращивания саженцев.
Впервые проведены исследования по возможности применения тидиазурона и гиббереллина для вывода адаптированных микрорастений из состояния покоя и показана эффективность их совместного использования.
Покой и его роль в росте и развитии растений
После адаптации растений при пересадке их в открытый грунт, даже в самый благоприятный период, растения вступают в состояние физиологического покоя (С.А. Корнацкий, 1998; В.П. Бленда, 1998; С.А. Корнацкий, 2003 и др.).
У всех растений периоды усиленной жизнедеятельности сменяются периодами ослабления и даже почти полным ее прекращением, то есть растение впадает в состояние покоя. Для роста растений покой характерен на любых этапах онтогенеза. Существует покой на этапе эмбрионального развития растений (покой зиготы и семени), покой побегов растения, находящихся на разных стадиях развития. В состояние покоя может вступать как растительный организм в целом, так и отдельные его части (семена, корни, клубни). В некоторых случаях растительный организм может находиться в растущем состоянии, а отдельные почки - в покоящемся (В.В.Полевой, 1989).
Период покоя имеет различную продолжительность, но не имеет четких границ, подготовка к нему начинается прежде, чем растение заканчивает рост. С периодом покоя тесно связаны созревание тканей и накопление запасных веществ (Р.П. Кудрявец, 1983).
Наступление периода покоя определяется действием и взаимодействием внешних и внутренних (генетических) факторов; его биологическая роль состоит в том, чтобы дать возможность растению пережить время, когда снабжение энергией не достаточно для нормального роста и метаболизма (В.В. Полевой, 1989; Н.Н. Третьяков, 2000).
Как отмечают James W. Frisby and Schuyler D. Seeley (1993c), у семян, сеянцев и взрослых растений персика механизмы покоя подобны, у них наблюдается одинаковая продолжительность прохождения покоя при одинаковой температуре, а также существует корреляция между температурой, продолжительностью покоя и их ростом в следующие после покоя периоды.
Различают два вида покоя, которые находятся в различной зависимости от внешних условий: глубокий и вынужденный покой. При глубоком покое растению необходимы низкие положительные температуры, и оно не возобновляет вегетацию (Я.С. Нестеров, 1962). Вынужденный покой проходит при отрицательных температурах. При обеспечении температур, благоприятных для роста растения, рост возобновляется (Н.Н. Третьяков, 2000 и др.).
Растения красной смородины в условиях Центральной Якутии не возобновляют вегетацию до тех пор, пока не пройдут состояние физиологического покоя, даже при создании оптимальных условий для вегетации. В то же время растения, находящиеся в состоянии вынужденного покоя, начинают расти при создании для них комфортных по температуре, свету и влажности условий (СМ. Сабарайкина, 2004). В теплых областях часто недостаточно суммы низких положительных температур, необходимых для прохождения периода покоя, что приводит к неполноценному возобновлению вегетации и цветению (B.L. Торр, 1989; Е. Young, 1989).
Растения открытого грунта сначала вступают в фазу глубокого (физиологического) покоя, после чего наступает состояние вынужденного, так как растениям необходимо пережить неблагоприятные для роста и развития факторы внешней среды. В регулируемых условиях растения также вступают в состояние физиологического покоя, во время которого в растениях происходят определенные физиолого-биохимические изменения, подготавливающие их последующий рост. (А.К. Федоров, 1989; В.В. Полевой, 1989). Для различных видов растений период глубокого покоя также различен и даже для разных сортов он неодинаков по продолжительности и температуре (К. Ghariani, 1994).
У различных по происхождению сортов яблони и груши различные требования к продолжительности периода покоя: у североамериканских и европейских сортов он обычно больше, чем у сортов из южного полушария (Австралия, Новая Зеландия и Аргентина) и азиатских (К. Ghariani, 1994). В ЮАР из-за того, что яблони (европейские сорта) не получают достаточной суммы низких положительных температур, необходимых для прохождения физиологического покоя, наблюдаются различные морфофизиологические нарушения (М. North, 2003).
Развитие почек заканчивается задолго до листопада. Как в них, так и в окружающих их тканях накапливается в основном крахмал, причем, прежде всего, в зоне хорошо развитых почек. В листьях уменьшается содержание хлорофилла. Растение оттягивает из них большую часть Сахаров, фосфор и азотсодержащие соединения. Калий, кремний и кальций остаются в листьях и при их опадении почти полностью теряются. В результате газообмен через кору оказывается сильно ограниченным, дыхание и обмен воды в надземных частях ослабевают и осуществляются только через кутикулу (Р.П. Кудрявец, 1983).
Сокращение длины дня индуцирует приток Са2+ в ядра клеток апикальных почек древесных растений, а высокий уровень Са в почках является фотопериодическим сигналом трансдукции, вызывающим физиологический покой. Поддержание состояния физиологического покоя требует высокого уровня Са2+ в клетках апикальных почек древесных растений (G. Reuther, 1978; J. Lingcheng, 2004). При повышении влажности в условиях орошения (при влажности 80% от предельной полевой влагоемкости) наблюдается тенденция к снижению содержания Са и растения затягивают вегетацию (К. Дойчев, 1979).
Рост и развитие растений, размноженных in vitro в полевых условиях, а также использование метода в садоводстве
Материал, размноженный методом клонального микроразмножения после посадки в полевые условия, по некоторым данным может иметь некоторые отличия от растений, полученных традиционными способами, которые в последующем исчезают. Возможно более позднее вступление в плодоношение, иногда сильное ветвление. В целом. более высокие коэффициенты размножения, лучшая укореняемость и другие показатели, в сравнении с растениями, полученными традиционными способами, свидетельствуют в пользу техники in vitro, а имеющиеся различия сглаживаются через несколько лет (Е.А. Сидорович, 1996).
Корнесобственные растения яблони, полученные методом клонального микроразмножения, не уступают яблоне, привитой на сеянцах или клоновых подвоях. С вступлением в плодоношение иногда отмечалось запаздывание в сравнении с привитыми яблонями, причем цветение регистрировали на шестой-седьмой год после посадки (R.H. Zimmerman, 1989). В четырехлетнем возрасте корнесобственные растения яблони, размноженные in vitro, отличаются интенсивным типом кроны и большей площадью листовой поверхности (на 10-40%), в сравнении с привитыми растениями (С.Г. Долгих, 2004).
Как отмечают Карычев К.Г. и Янкова А.И., растения сливы сорта Стенлей, размноженные in vitro, несколько позже вступают в плодоношение, но вместе с тем к 13 летнему возрасту продолжают наращивать урожайность, а растения, привитые на алычу, уже начинают ее снижать. Урожайность растений сливы, размноженных in vitro, за все года плодоношения превысила привитые на алычу в 1,2 раза. Растения сливы, размноженные in vitro, отличаются более активным ростом и сильными приростами и требуют более разреженной посадки по сравнению с привитыми на алычу (К.Г. Карычев, 2004).
Рассматривая рост древесных плодовых растений, размноженных in vitro и традиционным способом, можно заметить, что существует проблема вывода их на единый уровень отсчета. На точке отсчета, которой всякий раз является начало вегетации, оказывается корнесобственное растение, выращенное in vitro, и привитое растение того же сорта или клона, которое имеет преимущества по сравнению с растениями, полученными методом in vitro. Если окулировка была сделана в позапрошлом сезоне (или копулировка в прошлом), то растение вегетировало и имеет хорошо развитую корневую систему и надземную часть. Если же подвои были окулированы в прошлом сезоне (или копулировка сделана весной текущего сезона), то размноженные традиционным способом растения будут уступать растениям, размноженным in vitro, так как рост первых только начнется из одной почки (или черенка), в то время как растения, размноженные in vitro, уже имеют более или менее развитую надземную часть (Л.А.Крамаренко, 1993).
Иногда, для того чтобы выровнять шансы испытуемых яблонь, все растения, находящиеся в опыте, подрезают до одинаковой величины. Однако эта мера является недостаточной, так как разница в степени развития корневой системы все равно существует (R.H. Zimmerman, 1986).
При сравнении укореняемости черенков подвоев груши, полученных с растений, размноженных методом in vitro, было установлено, что они лучше укореняются по сравнению с черенками с растений, полученных без использования этого метода. Это делает перспективным использование метода клонального микроразмножения для получения материала, необходимого для черенков (О.Р. Jones, 1989). Укореняемость и качество зеленых черенков, срезанных с маточных растений, размноженных in vitro значительно выше, чем с обычного маточника (О.В. Матушкина, 2004). Подвои вишни, полученные методом in vitro по зимостойкости не уступают подвоям, полученным без использования этого метода (P. Rosati, 1989).
В некоторых случаях у растений сливы, высаженных в полевые условия, после микроразмножения наблюдаются типичные ювенильные характеристики: сильный рост и большое количество шипов на побегах. Черенки, полученные с этих растений, укореняются лучше, чем черенки с растений, полученных обычным способом размножения (В.Н. Howard, 1989а; В.Н. Howard, 19896).
Растения винограда и голубики склонны к образованию большего числа побегов и корней, малина красная имеет большее количество корневых отпрысков, а смородина - ветвей, причем полученные растения отличались высокорослостью, в сравнении с растениями, полученными традиционными способами размножения (Л.А. Леонтьева-Орлова, 1991).
Усиление побегообразовательной способности, улучшение укореняемости растений объясняются реювенилизацией, происходящей в культуре in vitro, связанной с увеличением в тканях пробирочных растений доли молодых клеток, изменением биохимического состава, а также анатомо-морфологической подготовленностью тканей к регенерации (А.Г. Юсуфов, 1981; С.А. Острейко, 1985).
Существует предположение, что в ювенильном (омоложенном) материале, размноженном в условиях in vitro, идет интенсивный синтез эндогенных цитокининов, способствующих активации развития пазушных почек и, как следствие, пазушных побегов. Но данное предположение недостаточно доказано.
Как отмечают некоторые ученые (А.И. Литван, 1988; Л.К. Вашакидзе, 1988), растения, которые получены при клональном микроразмножении из пазушных меристем, по своим морфофизиологическим характеристикам сходны с материнским растением, то есть генетически однородны и стабильны.
Часто отклонения в развитии растений могут носить кратковременный характер и регенеранты, образованные in vitro, после высадки в грунт могут преодолеть влияние условий культивирования in vitro на их последующий рост, и уже первое вегетативное поколение имеет характеристики исходного сорта. Изменения такого рода относят к эпигенетическим, и их связывают с изменением экспрессии генов в клетках растений (R.L.M. Pierik, 1987).
Проблема генетической нестабильности уменьшается, если регенерация растений происходит путем прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза (V. Vasil, 1982; G. Maheswaran, 1987), тогда как при адвентивном органогенезе из каллусов, клеточных суспензий и протопластов часто сталкиваются с генетической неоднородностью получаемых растений (P.J. Larkin, 1981; F. Meins, 1983).
Влияние продолжительности фотопериода на рост и развитие растений, полученных методом in vitro
Несмотря на изначально существенно меньшие размеры, растения сорта Молодежная после адаптации оказались существенно крупнее при максимальном освещении. Сходной картина была и при освещении комбинированным спектром (красный 611 нм 87,5% + синий 450 нм 12,5%).
Также по сорту Молодежная отмечено существенное преимущество максимальной освещенности в сравнении со значением 0,3 max. Различия между сортами имелись также, но ни в одном случае не достигли порога существенности. Те же закономерности можно было проследить и в отношении приростов в период адаптации. При освещении красным светом (спектр 611 нм 100%) диаметр стволика у основания у обоих сортов уменьшался с уменьшением уровня освещенности, но разница между лучшими и худшими вариантами не достигла порога существенности. Когда использовалось освещение лампами с комбинированным спектром (красный 611 нм 87,5% + синий 450 нм 12,5%), было установлено существенное влияние максимальной освещенности при данном спектре.
После доращивания в искусственных условиях при различных уровнях освещенности разных спектров определенных закономерностей выявить не удалось. Рост растений во всех вариантах: как по освещенности, так и по сортам был достаточно ровным, что и подтверждает результат математической обработки. Данный результат хорошо согласуется с исследованиями Федорова А.К. (А.К. Федоров; 1989), где наглядно продемонстрирована роль периода покоя как фактора, выравнивающего физиологическую разнокачественность растений в процессе его прохождения. После завершения покоя начало поступательного роста обеспечивается действием благоприятных температур, а не действием света. Однако действие света отразилось на таком качественном показателе как диаметр стволика. Максимальное освещение красным светом (611 нм 100%) оказалось существенно лучше, чем 0,3 max на сорте Молодежная и было близко к существенности при комбинированном спектре. Несколько иной картина была в отношении сорта Память Еникеева (1996 г. введения в культуру). При красном свете (611 нм 100%) преобладание максимальной освещенности над 0,3 max было близким к существенности, а при комбинированном спектре существенная разница была установлена не только для максимальной освещенности, но и 0,6 max в сравнении с 0,3 max.
Также были проведены дополнительные исследования по влиянию типа ламп и уровня освещенности на рост растений вишни сорта Волочаевка и сливы сорта Урожайная Бабича.
При сравнении ламп люминесцентных ЛД 40-2 и натриевых высокого давления ДНАТ 400-3 (рисунок 26) можно отметить положительное влияние ламп ДНАТ 400-3 на приживаемость растений вишни сорта Волочаевка и сливы сорта Урожайная Бабича, независимо от уровня освещенности. Причем у вишни сорта Волочаевка и у сливы сорта Урожайная Бабича под лампами ДНАТ 400-3 приживаемость была примерно на одном уровне: при 0,6 максимальной освещенности она составила 75%, при максимальной 60%. Под лампами ДНАТ 400-3 наибольшая гибель растений происходила на стадии адаптации к нестерильным условиям. В дальнейшем гибель растений происходила во время охлаждения из-за обезвоживания растений, описанных ваше. В то же время под лампами ЛД 40-2 на протяжении всего периода наблюдений происходила постоянная гибель растений.
Сходные результаты были получены и у сорта сливы Урожайная Бабича (таблица 19) за исключением того, что диаметр стволика после второй остановки роста оказался примерно равным при обеих освещенностях под лампами ДНАТ 400-3. Столь значительное преимущество ламп ДНАТ 400-3 обусловлено в первую очередь высокой светоотдачей (на уровне 15 тыс. люкс), что создает оптимальные условия для фотосинтеза.
Основываясь на положительных результатах использования охлаждения растений для выведения из состояния покоя, а также на том факте, что наиболее активный и продуктивный их рост длится в пределах 2-2,5 мес, нами была предпринята попытка повторной холодовой обработки после окончания этого периода.
Часть растений вишни сорта Волочаевка, освещавшихся лампами ДНАТ 400-3, после окончания вегетации оставили в светокомнате другую, а другую группу растений подвергли второму охлаждению, через 2,5 месяца обе группы высадили в стеклянную обогреваемую теплицу где растения наблюдались в течение 3,5 месяцев.
Доращивание растений сорта вишни Волочаевка при освещении двумя типами ламп, имеющими принципиальное различие по различным спектральным составляющим и создаваемым уровням освещенности, выявило существенное преимущество ламп ДНАТ 400-3 в сравнении с лампами ЛД 40-2 (рисунок 27). Растения к моменту окончания адаптации, так и после доращивания в искусственных условиях (таблица 18) в первом случае имели надземную часть существенно больших размеров, чем во втором. Наибольший диаметр стволика у основания был отмечен в варианте с максимальным освещением лампами ДНАТ 400-3, который существенно превосходил остальные варианты.
Влияние тидиазурона и гибберелловой кислоты 3 на возможность сокращения и предотвращения периода покоя
Внедрение новых приемов требует дополнительных затрат. При внедрении этих приемов необходимо определить их экономическую эффективность. Культура тканей, по мнению многих исследователей, является эффективным и экономически выгодным способом размножения посадочного материала.
По сравнению с традиционными методами вегетативного размножения растений клональное микроразмножение растений требует больших капиталовложений и, соответственно, больших текущих расходов. Персонал должен обладать соответствующим уровнем знаний и владеть стандартными приёмами микробиологии. Однако здесь исключается тяжёлый физический труд по уходу за растениями, и условия работы приближены к условиям работы на производствах высоких технологий.
Среди основных преимуществ использования биотехнологических приёмов в садоводстве наиболее часто называют следующие: 1. возможность получения посадочного материала, свободного от вирусов, бактериальных, грибных фитоплазменных болезней, а также клещей и нематод; 2. быстрое размножение ценных клонов растений; получение в большом количестве вегетативного потомства трудноразмножаемых в обычных условиях форм растений; 3. работа в лабораторных условиях круглый год и планирование выпуска растений к определённому сроку; 4. возможность длительного хранения растительного материала без контакта с внешней средой; 5. возможность обмена материалом в международном масштабе без риска занести карантинных вредителей.
Если работы по клональному микроразмножению хорошо организованы, чётко отработаны все звенья производственного процесса, в котором заняты высококвалифицированные специалисты, можно ожидать высокий уровень рентабельности производства.
Расчёт экономической эффективности производства посадочного материала с использованием клонального микроразмножения по традиционной схеме и включающей применение предпосадочной подготовки адаптированных микрорастений к пересадке показан на примере вишни сорта Волочаевка (таблица 34, приложение Г).
По данным таблицы можно отметить, что рентабельность производства посадочного материала вишни при использовании 1-го охлаждении (ранее разработанная технология) составила 82,4%, с использованием 2-х охлаждений (оптимизированная технология) увеличилась до 142,3%.
Разработанный ранее способ предусматривает охлаждение микрорастений при +3...6 С в течение 2-2,5 мес, повышает в 2-2,5 раза выход стандартного по высоте посадочного материала, а также позволяет эффективно использовать производственные площади. Разработанный нами способ предусматривает освещение лампами другого спектрального состава и проведение двух охлаждений микрорастений при +3...6 С в течение 2-2,5 мес, а также повышает выход стандартного и однородного по высоте и диаметру посадочного материала за 1 год, позволяя более эффективно использовать производственные площади (рисунок 54). Хранение растений практически исключает расходы электроэнергии, а использование двух охлаждений в контролируемых условиях позволяет к минимуму свести процент выпада растений и более эффективно и рационально использовать время и оказывать влияние на ростовые показатели растений.
Для достижения цели исследования потребовалась разработка путей управления ростом и развитием растительного материала на конечных этапах микроразмножения, что позволило усовершенствовать технологию доращивания адаптированных микрорастений косточковых культур за счет увеличения процента выхода и улучшения показателей качества адаптированных растений, а после доращивания - и стандартных саженцев. Нами были оптимизированы условия доращивания растений регенерантов на основе комплексного изучения действия ряда различных физических и химических факторов, а именно: продолжительности культивирования, спектрального состава света, уровня освещенности, длительности фотопериода, элементов минерального питания, регуляторов роста на стадиях укоренения микрочеренков вишни и сливы, а также адаптации полученных при этом растений с последующим анализом влияния изученных факторов на рост растений в полевых условиях.
