Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1. Биологическая характеристика и лизоцимная активность различных видов стафилококков 11
2. Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения 17
3. Биологическая роль лизоцимного фактора у микроорганизмов и практическое использование лизоцима в медицине 21
4. Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов 27
5. Факторы межмикробного взаимодействия стафилококков в бактериальном биоценозе 32
6. Генетические механизмы контроля факторов межмикробного взаимодействия 34
7. Клонирование генов литических ферментов грамположительных бактерий 36
Глава II. Материалы и методы 51
1. Питательные среды и штаммы бактерий 51
2. Микробиологические методы 56
2.1. Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis 56
2.2. Качественный метод определения лизостафиновой активности Staphylococcus simulans 58
2.3. Количественный метод определения лизоцимнои активности S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis 59
2.4. Определение антагонистической активности лактобацилл против условно-патогенных бактерий 60
3. Молекулярно-генетические методы 61
4. Методы статистического анализа 69
Глава III. Результаты собственных исследований 71
1. Коллекция клинических штаммов S. aureus и их общая характеристика 71
2. Определение спектров лизоцимнои активности Staphylococcus aureus 118 и лизостафиновой активности Staphylococcus simulans RN3239 77
3. Выбор векторной системы и реципиента для клонирования гена лизоцима S. aureus 118 и гена лизостафина S. simulans RN3239 79
4. Проверка штаммов Bacillus subtilis AJ73 на лизоцимную и лизостафиновую активность, на устойчивость к лизоциму S. aureus 118 и лизостафину S. simulans RN3239 80
5. Клонирование гена, кодирующего лизоцим S. aureus 118 в клетках В. subtilis AJ73 82
Выводы
- Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения
- Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов
- Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis
- Определение спектров лизоцимнои активности Staphylococcus aureus 118 и лизостафиновой активности Staphylococcus simulans RN3239
Введение к работе
Система производства здорового посадочного материала во многом является отражением потенциальных возможностей способов размножения садовых растений. В идеале плодоносящие насаждения желательно закладывать исходными здоровыми растениями. Однако, их высокая стоимость, необходимость использовать привитой посадочный материал, ювенилизация отодвигает такую систему на большую перспективу. Хотя она и возможна при создании сортов, сочетающих в себе характеристики клоновых подвоев и современных сортов при условии размножения растений на основе соматического эмбриогенеза (искусственные семена, Bio Industry, 1985). В начале 20-х годов прошлого века, когда основными способами получения исходных здоровых растений были визуальный отбор и тестирование на растительных индикаторах, количество получаемых исходных здоровых растений было незначительным, а себестоимость высокой. Удовлетворить потребность в здоровом посадочном материале можно было за счет большого числа этапов размножения (категорий посадочного материала), строгой пространственной изоляции, размножение посадочного материала в районах с малой инфекционной нагрузкой, отсутствием активных переносчиков инфекции, интенсивных обработок ядохимикатами.
Способность меристематических верхушек регенерировать на питательных средах 30-100% здоровых растений, особенно в сочетании с термотерапией, а также современные методы тестирования, такие как иммуноферментный анализ, полимерная цепная реакция, электрофорез, электронно-микроскопическая диагностика, дают основание утверждать, что создание здоровых исходных растений не является проблемой в системе производства здорового посадочного материала, хотя и требует соответствующего оборудования, трудовых и денежных затрат. Однако, технология «одна меристематическая верхушка - одно растение» не
ВВЕДЕНИЕ
Стафилококки представляют собой большую гетерогенную группу грамположительных микроорганизмов. Они широко распространены в окружающей среде, и некоторые виды являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В настоящее время все описанные виды стафилококков делятся на две основные группы - коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Самым же известным среди всех коагулазоположительных видов стафилококков является золотистый стафилококк- Staphylococcus aureus, который на протяжении всего XX века был одним из наиболее значимых оппортунистических патогенов в медицинской практике. Основной экологической нишей S. aureus являются апокриновые железы, расположенные в передних отделах носовых ходов человека, а также в подмышечных ямках и паховых складках, что связано с высокой степенью сродства данного вида микроорганизмов к расположенным там эпителиоцитам. Условием для освоения S. aureus данной экологической ниши является способность бактерий противостоять действующим в ней механизмам противоинфекционной резистентности организма хозяина (Дерябин Д.Г., 2000). S. aureus способен вызывать широкий спектр заболеваний - от «малых» кожных инфекций до тяжелых септических состояний с возможным летальным исходом (Grosserode, Wenzel, 1991, Бухарин О.В. и др., 2001).
Золотистый стафилококк характеризуется многообразием факторов патогенности, к которым относятся экзотоксины, факторы адгезии, инвазии и иммунорезистентности. Среди многочисленных экстрацеллюлярных продуктов стафилококков наибольший интерес представляет бактериолитический лизоцимподобньш фермент /ЛПФ/, относящийся к аутолитическим ферментам-гидролазам, и стафилококковый бактериоцин /лизостафин/. Эти два фермента
например, физических, которыми часто пренебрегают (Pierik R.L. 1988). Микроклональное размножение позволяет создать систему производства здорового посадочного материала, которая может состоять только из этапа микроклонального размножения исходных здоровых растений и однократного размножения растений в закрытом и открытом грунте. Однако, каждый из этих этапов требует доработки или даже другого его решения. В настоящее время есть смысл сделать переоценку некоторых положений методики промышленного использования микроклонального размножения. Считают, что окончательный выход растений, размноженных in vitro, зависит от коэффициента размножения на этапе пролиферации и приживаемости их в нестерильных условиях. Поэтому основная масса работ посвящена этому разделу. Коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов зависит от состава и концентрации регуляторов роста питательных сред.
Увеличение концентрации регуляторов роста часто отрицательно влияет на рост и развитие эксплантов и качество полученных растений. В то же время, если иметь достаточное количество жизнеспособных эксплантов на первом этапе, то это будет равносильно увеличению коэффициента размножения на этапе пролиферации боковых побегов. При таком подходе к методике размножения нет смысла стремиться получить большой коэффициент размножения за счет регуляторов роста и числа пассажей. Нужно отметить правильность утверждения о возможности производства растений in vitro в любое время года, однако, в этом нет необходимости, так как маточные растения для размножения в защищенном грунте требуются в конкретные сроки (март-май, август). В связи с этим возникает потребность в хранении растительного материала. Очевидно, что это направление может быть использовано для создания банка исходных здоровых растений.
Использование защищенного грунта при производстве здорового посадочного материала необходимо, так как позволяет влиять на рост и
практическое применение микробных ферментов гораздо экономичнее, чем применение яичного лизоцима.
Известно, что резкое снижение уровня эндогенного лизоцима свидетельствует о серьезных дефектах систем регуляции гомеостаза, неблагоприятно отражается на морфогенезе и функционировании иммунной системы организма.
Многие условно-патогенные бактерии могут снижать концентрацию лизоцима за счет продукции антилизоцимного фактора (Бондаренко В.М., Романова Ю.М., Яблочков А.Я., 1988). Поэтому восполнение дефицита лизоцима является патогенетически вполне оправданным в лечении и профилактике многих заболеваний, в том числе дисбактериозов, тесно взаимосвязанных со вторичными иммунодефицитными состояниями, ослабляющими колонизационную резистентность открытых полостей организма хозяина (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Г.В., 2003). Разработка нового препарата-пробиотика, в основе которого могут быть молочнокислые бактерии, продуцируюпще лизоцим, весьма перспективна и нова.
Что касается другого фермента стафилококкового происхождения — лизостафина, который разрушает как грамотрицательные виды стафилококков, так и грамположительные, то он необходим в генетических исследованиях стафилококков для получения протопластов этих микроорганизмов. Но в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего оба вышеуказанных фермента стафилококкового происхождения (лизоцим и лизостафин).
Одним из подходов к решению этой проблемы является клонирование гена, детерминирующего синтез стафилококкового
лизоцима, и передача его представителям нормальной микрофлоры
человека, например лактобациллам, и создание таким образом новых
J видов пробиотиков. В настоящее время существуют единичные работы по
клонированию гена стафилококкового лизоцима и лизостафина в клетках Е. coli, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий (сенной палочке, лактобациллах), поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным.
Цель работы - клонирование гена, кодирующего синтез лизоцима Staphylococcus aureus, и гена, кодирующего синтез лизостафина Staphylococcus simulans, и изучение экспрессии клонированных генов в гетерологичных хозяевах.
Задачи исследования
изучение коллекции штаммов Staphylococcus aureus с целью выявления штаммов с наибольшей лизоцимной и лизостафиновой активностями;
создание геномной библиотеки (банка генов) Staphylococcus aureus и Staphylococcus simulans при помощи вектора pLFi4 в клетках Bacillus subtilis AJ73;
3) отбор рекомбинантных клонов с лизоцимной и лизостафиновой
активностями на специально разработанных селективных средах,
выделение рекомбинантных плазмид, содержащих вставки стафикокковых
генов, кодирующих синтез лизоцима и лизостафина соответственно;
4) перенос гена лизоцима S. aureus, клонированного в клетках В. subtilis в составе вектора pLF]4, в клетки Lactobacillus fermentum методом
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Значение здорового посадочного материала и особенности его производства в современном садоводстве
Последние 50 лет характеризуются серьезными изменениями в области садоводства мира. Эти изменения определили новые подходы к устройству сада, типу сорта и дерева, контролю за болезнями и вредителями. Плотность посадки 1000-2000 растений на гектар считается обыденным явлением. Уже показана биологическая целесообразность посадки 50-100 тысяч растений на гектар. Количество деревьев, высаживаемых на гектар сада, зависит от многих причин, в том числе от эффективности работы питомников. Основная задача питомников - производство различного по назначению посадочного материала. Часть продукции питомников можно отнести к средствам производства, а часть к средствам оформления. Работа питомников в стране должна быть построена таким образом, чтобы ежегодно выпускать 30 млн. саженцев косточковых и 40 млн. семечковых культур. При этом большая часть должна выпускаться на подвоях, регулирующих рост. Ежегодная потребность в рассаде земляники 825000 тысяч штук, саженцев смородины 90000 тысяч, малины 70000 тысяч, крыжовника 9000 тысяч, других ягодных культур 8364 тысячи штук. Только такой выпуск посадочного материала позволяет заложить сады, которые обеспечат приемлемый объем плодов и ягод, рекомендуемый медициной. Вместе с тем в 2001 году в стране было заложено всего 300 га очередного поля питомника, что позволит получить через 3-4 года всего около 7 млн. саженцев плодовых. Следует отметить, что только Англия ежегодно экспортирует около 40-50 млн. клоновых подвоев (Carter А.Р., 1972). Однако, страна не может ориентироваться на поставку посадочного материала из-за рубежа. Еще в конце 19 века П.Г.Шитт обратил внимание на недопустимость использования саженцев, выращенных в Европе, которые погибали в условиях России.
Гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов S. aureus.
Практическая значимость работы
В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотиков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кишечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условнопатогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков.
Сконструированы штаммы B.subtilis, стабильно наследующие ген, кодирующий синтез лизоцима и лизостафина стафилококков и характеризующиеся повышенным уровнем его продукции, которые могут быть использованы для промышленного получения фермента.
Разработана тест-система на основе ПНР для идентификации и выявления лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов, выделенных от больных, а также из окружающей среды (смывы с медицинских инструментов, мебели, белья, медицинской одежды в поликлиниках, больницах и роддомах). По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными чашечными методами определения лизоцимной активности, разработанная ПЦР-тест-система значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора лизоцимактивных штаммов стафилококков.
Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения
Европейская организация по защите растений утвердила схему производства здорового посадочного материала (Bull., 2001). В этой схеме определены учреждения, занимающиеся оздоровлением и дальнейшим размножением по общепринятой для всех стран методике.
Производство исходных здоровых растений финансируется государством. Ответственность этого этапа огромна. Потомство от одного исходного здорового растения земляники может занимать площадь более 10 га плодоносящих насаждений. И если это растение окажется больным, то вся система превращается в распространителя больных растений. Поэтому на всех этапах производства здорового посадочного материала осуществляется государственный контроль, который гарантирует отсутствие болезней и сортовую чистоту. В нашей стране работа по производству здорового посадочного материала была начата в ТСХА (Савздарг Э.Э., 1972) и НИЗИСНП (Трушечкин В.Г., 1965). К середине 70-х годов прошлого века была отработана система производства здорового посадочного материала. Она определяла категории посадочного материала, методику выращивания, фитосанитарный контроль. В стране существуют следующие категории посадочного материала. микробных энзимов. Сейчас не вызывает сомнения, что во многих случаях практическое использование микробных ферментов весьма экономично. Литические ферменты микроорганизмов являются одним из самых мягких средств разрушения клеток, обладающих широким спектром действия (Богданова Л.Ф., 1976). Они также могут быть использованы в качестве лечебных препаратов, благодаря высокой эффективности и специфичности действия, как на другие микроорганизмы, так и на обмен веществ микроорганизмов (Имшенецкий А. А., 1978).
Лизоцим выгодно отличается от других химиотерапевтических препаратов, так как он характеризуется не только сильным бактерицидным и бактериолитическим действием, но также, вероятно, стимулирует механизм иммуногенеза, ускоряет процессы заживления и рассасывания патологического очага (Ермольева З.В., 1972; Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974).
Согласно определению Jolles (1968) к лизоцимам как микробного, так и животного происхождения, относятся такие вещества, которые имеют 6 основных признаков: 1) белковую природу, 2) низкий молекулярный вес -около 15000, 3) термолабильность в кислой среде (способность выдерживать нагревание до 100С в течение 1-2 минуты при рН 4,5), 4) термостабильность в щелочных растворах, 5) способность к лизису суспензии или клеточных стенок М. lysodeikticus, М. luteus, 6) способность разлагать пептидогликан грамположительных бактерий.
В настоящее время известно около 50 представителей данного класса. Важной вехой в изучении химии лизоцима послужила работа Salton (1952), показавшего, что субстратом действия этого фермента у М. lysodeikticus является мукополисахарид (пептидогликан) бактериальной стенки.
Одно из названий микробного лизоцима S. aureus по субстрату действия - эндо-Р-Ы-ацетилглюкозаминидаза. Лизоцимы - это ферменты, которые расщепляют Р-/1 4/, а также Р-Д-/1 2/-гликозидные связи (Pollock, Sharon, 1970). Как уже сообщалось выше, субстратом действия лизоцимов у бактерий является сополимер ї [-ацетилглюкозамин-М-ацетилмурамовая кислота, а также олигосахариды с такой же чередующейся структурой и даже полимеры, содержащие только N-ацетилглюкозамины (Munoz, 1972). Гексамер реагирует с ферментом в 3000 раз быстрее, чем мономер. Имеются данные о наличии у этого фермента и эстеразной активности.
Стафилококковый лизоцим, выделенный Леоненко В.А. (1974) из культуральной жидкости золотистого стафилококка, отличается по свойствам, как от яичного лизоцима, так и от других лизоцимов бактериального происхождения по конечным продуктам, на которые он расщепляет пептидогликан клеточной стенки. При этом, несмотря на то, что объектом действия как яичного лизоцима, так и стафилококкового лизоцима, является пептидогликан (муреин) клеточной стенки, но конечные продукты, на которые расщепляют муреин эти два фермента, при этом разные.
Стафилококковый лизоцим, в отличие от яичного лизоцима, содержал больше липидов (80% сухого вещества), отношение белка к липидам равнялось 1:4. Обезжиренный фермент по многим признакам был сходен с яичным лизоцимом: молекулярный вес был 53815, сходным оказался аминокислотный состав. Отмечены лишь небольшие различия в количественном содержании отдельных аминокислот (Леоненко В.А., 1974). Активность лизоцима в виде липопротеидного комплекса (в пересчете на белок) оказалась в 1,5 раза выше белка яичного лизоцима. Вместе с тем, после удаления из лизоцима липидного комплекса активность обезжиренного лизоцима оказывалась равной активности яичного лизоцима. Очевидно, что липидная часть стафилококкового лизоцима является его неотъемлемым компонентом "и способствует крестьянско-фермерские хозяйства, которые не отвечают требованиям производства здорового посадочного материала. В странах с развитым садоводством хозяйство получает статус базового питомника только в том случае, если оно обеспечивает пространственную изоляцию от промышленных насаждений; отсутствуют злостные сорняки; на отведенном участке не выращивались 3-5 лет картофель, томаты; обследование участка показало отсутствие нематод - переносчиков вирусов; в хозяйстве есть возможность борьбы с переносчиками вирусов, и оно обеспечит выполнение всех агротехнических мероприятий. Большую опасность представляет бесконтрольный завоз посадочного материала из других регионов и зарубежных стран частными фирмами.
Так, в Самарскую область с Алтайского края завезен трудно искореняемый облепиховый почковый клещ, с саженцами смородины -рябуха. В Московскую область с Украины - корневой рак, с Мордовии -почковый клещ смородины, фитофтора малины, в Северокавказский регион -шарка (МСХ РФ, 1998).
Контролировать качество, сортовую принадлежность, фитосанитарное состояние посадочного материала призвана государственная семенная инспекция. Не имея в своем штате достаточного количества высококвалифированных специалистов, она не в состоянии осуществить контроль за производством и перемещением посадочного материала на необходимом уровне.
Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов
Культура изолированных органов и тканей растений в начале использовалась как метод исследований физиологии растений. Он позволил понять такие явления как полярность, дедифференциация и сделать предположения о тотипотентности клеток. Довольно длительный период характеризуется многочисленными попытками подобрать подходящую среду и создать благоприятные условия для выращивания отделенных от цельного растения органов, тканей и клеток. Большинство авторов этих работ ставили своей задачей получить неограниченный рост эксплантов. Поэтому составы большинства сред, созданных в начале исследований по культуре тканей и клеток, стимулируют развитие каллуса. Однако, некоторые из них послужили основой для разработки питательных сред, удовлетворяющих требованиям микроклонального размножения. Это минеральный раствор Кнопа, среды Уайта, Хеллера, Нича, Мурасиге и Скуга, которые в свою очередь были созданы на основе вегетационных опытов, изучающих питание в водных и песчаных культурах для выращивания различных растений (Бутенко Р.Г., 1964; Смирнов A.M., 1970).
Состав питательных сред можно подразделить на неорганический, органический и природный комплексы. Неорганический комплекс делится на макро- и микроэлементы. К органическому комплексу относится витамины, аминокислоты, регуляторы роста, фенольные соединения, сахара.
Из данных таблицы 1 можно заключить, что лизоцимная активность обнаружена у сенной палочки, лактобацилл, сарцин, листерий, коринебактерий, стафилококков и стрептококков. В доступной нам литературе отсутствовали публикации о наличии лизоцимной активности у других представителей грамположительных бактерий (спирохет, менингококков).
Данные литературы о частоте распространения лизоцимактивных штаммов среди различных видов грамположительных микроорганизмов представлены в таблице 2. Таблица 2 Частота распространения лизоцимактивных штаммов среди различных видов грамположительных микроорганизмов.
Таким образом, из вышесказанного можно заключить, что с наибольшей частотой лизоцимный признак встречается среди кокков, в основном, патогенных, что может свидетельствовать о значительной роли микробного лизоцима в физиологии этих видов. Причем, среди патогенных кокков первое место по частоте распространения лизоцимного фактора занимает золотистый стафилококк. Среди стрептококков лизоцим чаще продуцировали штаммы гемолитического стрептококка (75,7%) по сравнению с зеленящим (4,9%). положительно влияет на рост и развитие эксплантов in vitro. Выращивание маточных растений под красным светом, либо в условиях термотерапии увеличивало коэффициент размножения и укореняемость побегов (Economon А.Р., 1987). Следует отметить, что состав среды не может быть предсказан на основании знания происхождения сорта и реакции родительских форм на ту или иную питательную среду. Для каждого сорта оптимальная питательная среда должна подбираться индивидуально (David W., 1989).
В настоящее время на разных этапах микроклонального размножения применяют среды Мурасиге и Скуга (1962), Уайта (1963), Надсона (1946), Линсмайера и Скуга (1965), Морреля и Миллера (1964), Гамборга (1968), Кнопа и Бертелота (1974), Барата и Рао (1977), Филлипса и Коллина (1979), Андерсона (1980), Мак-Коуна (1981), Грешофа и Дау (1982).
Состав питательной среды на каждом этапе размножения in vitro должен обеспечивать оптимальные условия как в химическом, так и физическом отношении. Опыты с японской вишней подтверждают предположение о том, что солевой состав питательной среды иногда является более важным фактором при микроклональном размножении, чем регуляторы роста (Manatu Katano, 1987).
Большинство процессов роста и развития как у целых растений, так и у их отдельных органов in vitro могут нормально осуществляться лишь при участии в них физиологически активных веществ (Шевелуха B.C., 1998; Полевой В.В., 1964; Чайлахян М.Х., 1974; Overbeck V.J., 1954; Кефели, 1974). Без регуляторов роста невозможно получить достаточный коэффициент размножения и прохождение отдельных этапов морфогенеза.
В питательных средах используют отдельно или в сочетаниях: ауксины (индолилуксусную, индолилмасляную, нафтилуксусную, индолил-3-пропионовую кислоты), цитокинины (кинетин, 6-бензиладенин, зеатин, 2 31
Род стафилококков характеризуется самой высокой лизоцимной активностью по сравнению с другими видами грамположительных микроорганизмов. Welsch (1959), в числе первых изучивший лизоцимную активность микроорганизмов, обнаружил лизоцимный признак у 100% исследованных штаммов стафилококков S. aureus. О 100% лизоцимной активности у всех 354 штаммов S. aureus сообщили в своих исследованиях Акатов А.К. и Журавлев И.А. (1975).
Качественный метод определения лизоцимной активности у клинических изолятов S. aureus, Lactobacillus fermentum, В. subtilis
В работе использовали три способа определения лизоцимной активности стафилококков: чашечный с убитой индикаторной культурой (Hawiger, 1968), чашечный с живой индикаторной культурой (Смолягина А.И., 1974) и метод отсроченного антагонизма в агаре (Muriana, IClaenhammer, 1987). При использовании чашечного метода с убитой индикаторной культурой суточную культуру М. lysodeikticus 2669 смывали 0,5% раствором и убивали в автоклаве при 1 атм. в течение 15 минут. Взвесь убитого нагреванием микрококка вносили в L-arap из расчета создания концентрации микрококка 108 клеток на 1 мл среды. После застывания агара чашки подсушивали в термостате при t=37C в течение двух часов. Затем на поверхность подсушенного агара с микрококком вносили каплями исследуемые культуры микроорганизмов по 20-25 капель на чашку. Результаты учитывали через 24-48 часов инкубации. Вокруг макроколоний выросших лизоцимактивных штаммов образовывались зоны лизиса клеток М. lysodeikticus, внесенного в агар. Определение лизоцимной активности по Смолягину А.И. отличалось от предыдущего метода тем, что использовали живую культуру М. lysodeikticus. При этом брали 0,2 мл 2-х миллиардной взвеси суточной агаровой культуры М. lysodeikticus и засевали на чашки Петри с 0,7% питательным агаром. На поверхность подсушенного агара с микрококком наносили в виде капель суточные бульонные культуры исследуемых штаммов (по 8-10 штаммов на чашку). Результаты опытов учитывали через 24 часа инкубации при t=37C по наличию зон лизиса микрококка вокруг макроколоний исследуемой культуры.
Вместе с тем, ингибирование синтеза эндогенного гибберилина триадимефоном стимулировало развитие зачатков корней больше, чем в варианте с ИУК и путресцином. Усиление образования корней сопровождалось ослаблением биосинтеза этилена и увеличением содержания полиаминов. Экзогенный гиббереллин полностью снимал стимулирующее действие триадимефона (Hetcher Р. А., 1988).
В отличие от черенков, где положительное действие гиббереллина проявляется только на первом этапе, для соматических зародышей его действие должно быть более продолжительным, особенно в сочетании с аденином (Kochba Y., Button Y., 1974). По данным авторов, гиббереллин действует в основном на инициацию меристематическои зоны корня, а аденин стимулирует к развитию уже существующие зачатки. Согласно работам Скуга и Миллера, формирование корней определяется отношением ауксинов к цитокининам. Их содержание в зоне укоренения изменяется в процессе корнеобразования. В первые 24 часа содержание цитокининов резко уменьшается и сохраняется на низком уровне 3-4 дня. В момент растяжения корневых зачатков уровень цитокининов повышается. Обработка черенков фасоли ауксином увеличивает содержание цитокининов, особенно к 7 дню после черенкования (Панин А. П., 1986; Тхи Муой, 1984). Очевидно, влияние цитокининов зависит от их концентрации и отношения с ауксином. Если соотношение не оптимально, то цитокинины ингибируют ризогенез, задерживая превращение ИУК в ацетиласпарат (Michael О., Mulline, 1970; Bollmark Marie, 1988). Вместе с тем, Кристиансон (1988) считает, что среды для пролиферации побегов богатые цитокинином, развивают у побегов способность реагировать на среду для укоренения. «Возможно, -пишет он,-трудно укореняемые виды были способны к укоренению не с синергистами ауксина, а в результате предворительного культивирования на среде с высоким содержанием цитокинина» (Christianson М.Ь.,1988).Однако, введение в питательную среду 6БАП хотя и уменьшало развитие некрозов активности этого штамма. Порошок индикаторного штамма М. lysodeikticus предварительно проверяли на способность лизировать яичным лизоцимом. Для этого готовили микробную взвесь, содержащую 1 миллиард (109) микробных тел в 1 мл и разливали ее в две пробирки (опыт и контроль). В опытную пробирку добавляли 10 мкг яичного лизоцима (фирма «Sigma»), растворенного в 1 мл физиологического раствора. В контрольную пробирку добавляли равное количество физиологического раствора. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. Культура микрококка считалась пригодной для работы, если за указанный период времени в опытной пробирке происходил полный лизис находящихся в ней клеток.
Качественный метод определения лизостафиновой активности (Суровцев В.И., Гусев В.В., 1999) отличался от определения лизоцимной активности по Hawiger только тем, что в качестве индикаторного штамма использовали не микрококк, а чувствительный к лизостафину штамм S. aureus 59. Суточную культуру S. aureus 59 смывали 0,5% раствором NaCl и убивали в автоклаве в течение 15 минут. Взвесь убитого нагреванием стафилококка вносили в слой МПА из расчета создания концентрации стафилококка 109 клеток на 1 мл среды. На поверхность подсушенного МПА с S. aureus 59 наносили в виде капель исследуемый штамм S. simulans RN 3239 (по 20-25 капель на чашку). Результаты учитывали через 24-48 часов инкубации. Вокруг макроколоний выросшего лизостафинактивного штамма образуется зона лизиса S. aureus 59, внесенного в слой агара. Balchin, 1988). Кроме веществ из группы ауксинов, отмечают стимулирующее влияние ретардантов на укоренение черенков и характер развития корней (Wang S. L., Faust М, 1986; Geneve R. L, 1990;Аладина О. Н, 2004). Основное действие ретардантов связано с их влиянием на содержание в тканях гиббереллина (Шаин С. С, 1993; Wang S. L., Faust, 1986). Некоторые ретарданты активируют транспорт ИУК и ее накопление в базальной части черенка (Wases М., 1987). Стимулирующее влияние ретардантов на корнеобразование зависело от степени ингибирования роста побегов в длину. Уменьшение роста растяжением повышало перемещение ассимилянтов к заложившимся корням. Повышение интенсивности ризогенеза под влиянием некоторых ретардантов связывают с увеличением полиаминов. Некоторые авторы утверждают, что ключевым фактором в развитии адвентивных корней следует признать содержание спермина (Wang S. L., Faust 1986). Введение его в питательную среду стимулировало, а использование ингибиторов синтеза полиаминов уменьшало корнеобразование. Ингибитор синтеза этилена АВГ увеличивал синтез путрецина и укоренения. Сделано предположение, что между биосинтезом этилена и полиаминов существует конкуренция, что и сказывается на способность черенков к укоренению (Biondi S. 1990, Sanchercale J. М., 1989.). Результаты совместного действия культара с ИМК на укоренение зависели от очередности применения. При одновременном применении они выступали как антагонисты в процессе ризогенеза (Tim D. Davis, 1986).
Определение спектров лизоцимнои активности Staphylococcus aureus 118 и лизостафиновой активности Staphylococcus simulans RN3239
Каждый побег земляники имеет ряд листьев, находящихся на разных стадиях развития (Darrow С. W., 1966). Образуются листья из боковой зоны верхушечной меристемы конуса нарастания (Черятьева В. 3., 1965). На протяжении вегетации периферическая меристема образует листовые примордии. По мере заложения новых, более старшие из них дифференцируются в листья. В течение вегетационного периода возникают три-четыре генерации листьев, различающиеся продолжительностью жизни, характером образования пазушных почек, интенсивностью фотосинтеза и другими признаками. В пазухах весенних листьев закладываются почки, развитие которых при обычных климатических условиях заканчивается образованием новых побегов. Почки в пазухах летних листьев развиваются в плети. После плодоношения развиваются августовские листья, в их пазухах закладываются почки, которые на молодых маточных растениях развиваются в плети либо остаются спящими. Четвертая группа листьев появляется в период закладки цветочных почек и сохраняется весь зимний период. Таким образом, процесс усообразования земляники, а, следовательно, и коэффициент размножения будет зависеть от интенсивности образования листьев на маточном и дочерних растениях, а также от того, насколько мы в состоянии создать условия, чтобы в пазухах листьев всех генераций меньше оставалось спящих почек.
В опытах Арней (Arney S. А., 1968) было показано, что молодые весенние листья ингибируют появление новых с помощью ауксина. А ранее Гудвин (Goodwin С. Н., 1937) отмечал, что количество ауксина уменьшается по мере достижения листьями нормальных размеров. Ауксин, синтезируемый молодыми листьями ингибирует появление не только новых листьев, но развитие латеральных почек (Snow R., 1929). из пищевых продуктов (ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов) и Е. coli К12. Результаты исследования показали, что лизоцим, образуемый S. aureus 118, помимо Micrococcus lysodeicticus задерживает рост у 6 штаммов Е. coli. Особенно значительная задержка роста наблюдалась у Е. coli К12 (диаметр зоны лизиса составлял 10-15 мм). Также наблюдали задержку роста у 8 штаммов S. epidermidis и у 6 нелизоцимактивных штаммов S. saprophyticus. Таким образом, лизоцим S. aureus 118 задерживал рост только у коагулазоотрицательных видов стафилококков и не действовал на коагулазоположительные.
Все остальные виды бактерий, такие как Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, В. subtilis, Yersinia pseudotuberculesis, были не чувствительны к стафилококковому лизоциму. Определение спектра лизостафиновой активности штамма S. simulans RN3239 показало, что он лизирует или задерживает рост практически у всех штаммов стафилококков, как коагулазоположительных, так и коагулазоотрицательных, но не действует на другие виды бактерий (Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, В. subtilis, Yersinia развертывания листа, а плеть, заложившаяся в пазухе июльского листа -через 20-25 дней. Биология земляники такова, что побеги и плети могут возникать из одних и тех же почек (Guttridge С. G., 1955). Однако различия между ними возникают очень рано, уже во время формирования двух междоузлий. Определяющим фактором дифференциации почек являются внешние условия (Воронова Т. Г., 1953). Таким образом, земляника обладает большим потенциалом к вегетативному размножению, который может быть реализован на основании знаний ее биологических особенностей и влияния на них различных факторов.
В целях увеличения коэффициента размножения обычно стремятся создать оптимальные условия выращивания и использовать физиологически активные вещества. Условия окружающей среды могут значительно изменить характер роста и развития земляники и, в частности, характер заложения и развития почек. Замечено, что любой фактор или мероприятие, увеличивающие мощность растения в начале весны способствуют расходованию запасных веществ на образование плетей, чем ягод (Малток Д. А., 1960). Такими факторами являются сроки посадки маточников, орошение, мульчирование, система удобрений (Darrow G. М., 1929; Collins W. В., 1961; Сооге I. J., 1969; Кондакова Л. С, 1953; Handelmann W., 1963; Кривоногова А. А., 1974; Пехото Л. Т., 1970).
Однако решающее значение на сезонный цикл роста земляники оказывает длина светового дня и температура (Guttridge С. Т., 1959; Bailey J. S., 1964; SmeetsL., 1956,1966).
На основании реакции земляники на фотопериод, сорта плодоносящие в июле относятся к короткодневным растениям (Darrow G. М., 1934). Образование плетей у таких сортов земляники ускоряется длинным днем и обратно пропорционально степени цветения (Dennis F. G., 1970).
Высокие температуры и длинный день изменяют характер развития растений: закладываются плети и не закладываются генеративные почки (Darrow G. М., 1937). Многие исследователи считают процесс цветения и плетеобразования у земляники антагонистическими процессами (Sancher L., 1975; Bell Н. К., 1962; Пехото Л. Г., 1975).
Большинство авторов объясняют этот корреляционный эффект гипотезой Клебса о роли питательных веществ в зацветании растений. Однако, с открытием фитогормонов стало очевидно, что ведущая роль в росте и развитии растений играют именно соединения этого класса (Luckwill L. С, 1969; Гамбург К. 3., 1970).
Увеличение усообразования у земляники в результате удаления цветоносов очевидно связано со снятием апикального доминирования генеративной структуры и изменением центров притяжения метаболитов в растении. Воздействуя на землянику различными факторами, можно усилить или ослабить усообразовательную способность материнского растения. Однако, даже оптимальные условия не в состоянии вскрыть все потенциальные возможности растения в силу своего ограниченного и замедленного действия. Кроме того, влияние внешних условий сопровождается изменением биосинтеза веществ, оказывающих специфические регуляторные действия на развитие растений (Сабинин Д. А., 1971). В настоящее время известно, что разные стороны роста растений находятся под контролем гормональной системы. К классу гормонов относятся ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кислота, этилен (Леопольд А. С, 1968; Кефели В. И., 1973,1964). использовали те же методики, которые мы применяли для определения лизоцимной и лизостафиновой активности золотистого стафилококка. Основное отличие экспериментов по определению лизоцимной активности у В. subtilis AJ73 от аналогичных опытов по определению лизоцимной активности у золотистого стафилококка заключалось в том, что были использованы различные более разнообразные условия и среды для культивирования В. subtilis AJ73.
