Содержание к диссертации
Введение
1. Области применения и краткая история метода культуры изолированных тканей и органов растений 13
2. Предпосылки для использования культуры in vitro в процессах оздоровления и размножения плодовых и ягодных растений 22
3. Основные факторы, лимитирующие получение растений на искусственных питательных средах 25
3.1. Состав питательной среды 25
3.2. Генетические особенности растений-источников эксплантов...36 v
3. 3. Строение инициального экспланта 38
3.4. Физиологическое состояние растений-источников эксплантов ..39
3.5. Предварительная подготовка эксплантов 41
3.6. Физические условия культивирования 43
4. Основные модели и этапы клонального микроразмножения растений. 46
4.1. Модели размножения 46
4.2. Этапы клонального микроразмножения 50
5. Методы оздоровления плодовых и ягодных растений в системе производства оздоровленного посадочного материала 51
6. Использование биотехнологических приемов в селекции растений 59 ^
7. Создание коллекций ценных форм растений in vitro 65
8. Методические аспекты работы со стерильными культурами тканей и органов 70
8.1. Организация лаборатории и основные принципы работы с изолированными тканями и органами 70
8.1.1. Приготовление питательных сред 74
8.1. 2. Отбор и подготовка материала 75
8.1.3. Обеспечение стерильности при работе с изолированными тканями и органами 78
8.2. Методы статистической обработки результатов экспериментов 79
9. Практическое использование одноэтапного способа получения растений в культуре изолированных апексов 80
10. Использования двухэтапной модели для получения и размножения плодовых и ягодных растений In vitro 91
10.1. Земляника 93
10. 2. Малина красная 94
10.3. Ежевика, малина черная, малино-ежевичные гибриды 106
10.4. Смородина черная, смородина красная, крыжовник 116
10. 5. Вишня и слива 123
10.6. Яблоня и груша 133
10. 7. Другие культуры 149
И. Возможности увеличения коэффициента размножения при культивировании эксплантов на питательных средах 161
12. Повышение на этапе размножения доли побегов, пригодных к укоренению. 169
13. Контроль ризогенеза у культивируемых In vitro эксплантов..174
14. Изменение регенерационной способности эксплантов в зависимости от длительности культивирования In vitro 185
15. Адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям...194
16. Использование техники микропрививок при клональном Лі микроразмножении плодовых растений 204
17. Совершенствование биотехнологических приемов для создания новых форм растений 210
17.1. Культура семян 210^
17. 2. Культура изолированных зародышей 213
17. 3. Культура пыльников, каллусов, листовых дисков 218
18. Вопросы генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых культур 233
19. Практическое использование биотехнологических методов в системе производства оздоровленного посадочного материала
и для целей селекции 252
20. Экономические аспекты использования биотехнологических приемов 259
О б щи е в ы в о д ы 265
Рекомендации для практического использования 268
Литература
- Предпосылки для использования культуры in vitro в процессах оздоровления и размножения плодовых и ягодных растений
- Физиологическое состояние растений-источников эксплантов
- Использование биотехнологических приемов в селекции растений
- Изменение регенерационной способности эксплантов в зависимости от длительности культивирования In vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интенсификация современного сельскохозяйственного производства требует широкого использования высокотехнологичных приемов. В частности, в садоводстве прослеживается четкая тенденция повышения требований к качеству посадочного материала и его сортименту. Это ставит задачи получения оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных растений, решение которых связано с необходимостью использования высоких технологий оздоровления и тестирования. С другой стороны, сокращение сроков создания новых генотипов с хозяйственно-ценными свойствами, ускорение их внедрения в производство, создание и содержание коллекций ценных форм также являются важными задачами сельскохозяйственной науки.
Решению этих проблем может способствовать применение относительно новых биотехнологических приемов, которые до недавнего времени считались сугубо лабораторными. Среди основных преимуществ этих приемов наиболее часто называют следующие: возможность получения посадочного материала, свободного от вирусных, грибных и бактериальных болезней, клещей и нематод; быстрое размножение ценного клона растения; получение в большом количестве вегетативного потомства трудноразмножаемых в обычных условиях форм растений; работа в Лабораторных условиях круглый год и планирование выпуска растений к определенному сроку; возможность длительного хранения растительного материала без контакта с внешней средой; возможность обмена материалом в международном масштабе без риска занести карантинных вредителей, а также возможность получения форм с измененной плоидностью, сомаклональных вариантов и трансгенных растений.
Однако, для плодовых и ягодных растений отсутствовали технологии получения и размножения растений на искусственных питательных средах, не были отработаны приемы надежного получения расте-ний-регенерантов в культуре пыльников, каллусов и других эксплан-тов типа листовых дисков.
Совершенствование техники культуры изолированных тканей и органов плодовых и ягодных растений с учетом биологических особенностей и факторов культивирования, повышение их технологичности и эффективности, сочетание различных приемов оздоровления, клональ-ного микроразмножения, хранения стерильных культур и тестирования, получение растений-регенерантов из различных тканей и органов существенно расширит возможности этих методов в системе производства оздоровленного посадочного материала и в селекционном процессе.
Цель и задачи исследований. Основная цель исследований заключалась в разработке и совершенствовании технологий клонального микроразмножения и регенерации плодовых и ягодных растений из различных органов и тканей для использования в системе производства оздоровленного посадочного материала и ускорения селекционного процесса.
Для достижения поставленной цели требовалось:
- разработать надежные методы регенерации плодовых и ягодных растений из изолированных апексов на искусственных питательных средах;
- определить факторы культивирования (состав питательных сред, физические условия), обеспечивающие высокую эффективность клонального микроразмножения;
- выяснить роль сортовых и видовых особенностей в процессах регенерации растений в культуре in vitro;
- отработать составы питательных сред, последовательность операций и способы аппликации регуляторов роста, обеспечивающие высокую укореняемость микропобегов;
- разработать надежные способы адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям;
- выяснить возможность нетрадиционных комбинаций приемов оздоровления плодовых и ягодных растений с культурой in vitro;
- определить место биотехнологических приемов в системе производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур;
- проследить изменения в поведении эксплантов и растений в процессе длительного культивирования на искусственных питательных средах и после адаптации к нестерильным условиям;
- изучить возможность использования методов культуры изолированных тканей и органов для ускорения селекционного процесса и получения новых форм плодовых и ягодных растений.
Научная новизна. Проведено детальное изучение процессов регенерации и клонального микроразмножения основных видов плодовых и ягодных растений умеренного климата с учетом их биологических особенностей. Дано обоснование и показана целесообразность двухэ-тапного получения растений при использовании изолированных апек • сов при получении оздоровленного посадочного материала. Определены условия водной термотерапии изолированных апексов, на примере земляники, в сочетании с культурой in vitro, позволяющие повысить эффективность оздоровления. Прослежено изменение коэффициента размножения и потенций к ризогенезу в процессе субкультивирования, что позволило дать конкретные рекомендации по оптимальному числу субкультивирований для каждого вида растений. На этапе мик- роразмножения показана возможность использования нетрадиционных препаратов с цитокининовой активностью и комбинаций цитокининов с некоторыми препаратами негормональной природы для увеличения коэффициента размножения. Показана возможность использования микропрививок in vitro в системе производства оздоровленного посадочного материала некоторых трудноукореняемых форм плодовых рас- тений. Обосновано и доказано преимущество кратковременных обработок микропобегов индукторами корнеобразования, по сравнению с введением последних в питательную среду. Изучены роль температурных воздействий и эффект предварительного культивирования побегов на средах с пониженным содержанием регуляторов роста на процессы ризогенеза у разных видов плодовых и ягодных растений. Для ис- - пользования в селекционной практике на основе данных, полученных при изучении регенерации изолированных апексов древесных растений, разработан способ на основе оригинальной питательной среды, позволяющий получать растения из изолированных на 20-23 день после опыления зародышей косточковых пород, а также генетически идентичные копии сеянцев плодовых культур в ювенильной фазе. Изу- Ф ф чены факторы, влияющие на генетическую стабильность растений в процессе клонального микроразмножения и разработаны рекомендации снижающие риск получения уклоняющихся форм. Изучен процесс реге нерации растений в культуре комплексных эксплантов, пыльников каллусов и листовых дисков, на основании чего разработаны приемы получения растений регенерантов земляники в культуре пыльников, листовых эксплантов и каллусов земляники, листовых эксплантов и каллусов малины, ежевики, косточковых культур.
На защиту выносятся основи ыеположения концепции использования биотехнологических приемов в системе получения, ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных растений и в селекционном процессе включающей:
- разработанную модель двухэтапного получения растений плодовых культур из изолированных апексов;
- приемы эффективного клонального микроразмножения конкретных видов плодовых и ягодных растений с учетом специфических факторов культивирования (модифицированные и оригинальные питательные среды, способы индукции ризогенеза, адаптации пробирочных растений);
- использование комбинации термотерапии эксплантов и культуры in vitro для повышения эффективности оздоровления;
- способы получения растений-регенерантов в культуре пыльников, листовых эксплантов, каллусов, незрелых зародышей.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. В итоге проведенных исследований были отработаны технологические процессы получения из изолированных апексов и клонального микроразмножения основных видов плодовых растений умеренного климата, разработаны приемы микропрививок in vitro трудноукореняемых форм, методы регенерации ряда видов растений в культуре изолированных пыльников, листовых эксплантов, зародышей ранних фаз развития, получения генетических близнецов сеянцев без вывода их из ювенильной фазы, разработаны рекомендации по снижению риска появ ления уклоняющихся форм в процессе микроразмножения.
Результаты законченных исследований вошли в рекомендации Го-сагропрома РСФСР "Промышленная технология возделывания малины (1989 г.), в "Методические указания по клональному микроразмножению подвоев и сортов яблони" (ВАСХНИЛ, 1985), в "Методические указания по клональному микроразмножению красной и черной смородины" (1986), по микроклональному размножению сортов и подвоев косточковых культур (Агропромиздат, 1987), в "Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития (ВАСХНИЛ, 1988), которые служат руководством для ускоренного размножения посадочного материала перечисленных культур и использования в селекционных программах. Результаты разработок легли в основу стандарта отрасли ОСТ 10 067-95 "Посадочный материал плодовых и ягодных культур, полученный In vitro".
Ряд приемов, питательных сред и элементов технологий зарегистрированы в качестве изобретений и на них получены авторские свидетельства и патенты: А.С. N 636628 (1978 г.), N 1261587 (1986 г.), N 1279082 (1986 г.), N 1493187 (1989 г.), N 1554838 (1989 Г.), N 1591887 (1990 г.), N 1658929 (1991 Г.), N 1685323 (1991 Г.), N 1695854 (1991 Г.), N 1706481 (1991 Г.), N 1720597 (1991 г.), N 1738169 (1992 г.), N 1750492 (1992 г.), патенты РФ N 2013946 (1994 г.), N 2063681 (1996 Г. ) и N 2080059 (1997 г.).
Законченные разработки по теме были переданы в "Союзплодоп- ром" МПОХ СССР для использования при производстве оздоровленного •4 i# посадочного материала, Дальневосточному НИИ сельского хозяйства •Щ (г.Хабаровск), НИИ садоводства Сибири им. М.А.Лисавенко (г. Бар наул), Институту биофизики СО АН СССР (г. Красноярск), Россошанс кой зональной плодово-ягодной опытной станции, Донецкой опытной станции садоводства (г. Артем), Куйбышевской опытной станции, Кабардино-балкарской зональной опытно-селекционной станции (г. Нальчик), Российской научно-исследовательской хмелеводческой станции, совхозу "Победа" (г. Клин), Северо-Западному НПО "Бело-горка" (Ленинградская обл.), Селекцентру Всероссийкого научно-исследовательского института цветоводства и субтропических культур (Сочи), НПЦ биотехнологии "Фитогенетика" (г.Тула), Крымская опытно-селекционная станция Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства имени Н.И.Вавилова.
Полученный материал регулярно передавали научным учреждениям и высшим учебным заведениям по садоводству, опытным станциям и сельскохозяйственным предприятиям России и стран бывшего СССР.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на 1 Всесоюзной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1981 г.), на 4 Всесоюзной конференции "Культура клеток растений и биотехнология"(Кишинев, 1983), на международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), на 2 Международной конференции "Биология в культивируемых клеток и биотехнология"(Алматы, 1993), на 3 Между народной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на Международной научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на симпозиуме стран-членов СЭВ по регуляторам роста растений (Польша, 1983), на совещании стран-членов • • СЭВ по теме 1.10.1 "Разработка меристемных методов размножения, • обеспечивающих получение стерильного посадочного материала" (Кишинев, 1984), на Всероссийском совещании "Актуальные проблемы развития питомниководства и научное обеспечение отрасли"(Москва, 1993), на научно-методическом совещании "Достижения селекции и новые способы интенсивного размножения ягодных культур" (Брянск-Кокино, 1994), на совещаниисеминаре "Питомниководс-тво-96"(Москва, 1995) и других конференциях, совещаниях, семинарах по садоводству и питомниководству союзного, республиканского и зонального характера (1980-1995 г.г.). представлены на 7 Международный конгресс по культуре тканей и клеток растений (Амстердам, 1990).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 110 работах.
Предпосылки для использования культуры in vitro в процессах оздоровления и размножения плодовых и ягодных растений
Как известно, основные сорта плодовых и ягодных культур возникли в результате сложных скрещиваний и характеризуются высоким уровнем гетерозиготности, вследствие чего семенное размножение их с сохранением сортовой чистоты практически невозможно. Общепринятые способы вегетативного размножения (черенкование, отводки, прививка, окулировка) обеспечивают передачу потомству всех признаков исходной формы, включая системную пораженность многими вредителями и болезнями. Наличие переносчиков вирусов и фитоплазм обострило эту проблему до такой степени, что многие сорта плодовых и ягодных растений оказались полностью зараженными рядом вирусных заболеваний. Такие методы получения оздоровленного посадочного материала как термотерапия или хемотерапия не всегда позволяют избавиться от вирусной или фитоплазменной инфекции, особенно в тех случаях, когда речь идет о термостабильных патогенах. В частности, это относится к вирусу бороздчатости древесины яблони (apple stem grooving virus), который не может быть удален методами термотерапии. Хотя большинство сортов яблони не обнаруживают симптомов при заражении возбудителем этого заболевания, высокая чувствительность многих промышленно возделываемых сортов привела к тому, что правила международного карантина запрещают реализацию растений, которые не сертифицированы, как свободные от инфекции (C.P.Wilkins, J.H.Dods, 1983).
Использование минимально возможных по размеру отрезков побе гов или других органов для регенерации целых растений при определенных условиях позволяет получить здоровые экземпляры. В ряде случаев путем укоренения или прививки на здоровые растения терминальных участков побегов удалось получить безвирусные растения (F.O.Holmes, 1956).
Сходную технику использовали и для искоренения нематодной инвазии на землянике (D.G.McNamara, 1985). Прослеживается четкая закономерность: чем меньший фрагмент органа был использован для регенерации целого растения, тем выше вероятность получения здорового материала. Однако минимизация размеров инициальных органов затрудняла процессы регенерации, хотя и имела дополнительные преимущества, заключающиеся в увеличении коэффициента размножения. На практике такое ограничение размеров привело к использованию зеленых черенков размером в несколько сантиметров (Ф.Я.Поликарпова, Турецкая Р.Х., 1968) или однопочковых черенков (Ю.В.Осипов, Т.М.Морозова, 1983). Дальнейшее изменение размеров может быть осуществлено только при использовании стерильных культур и соответствующих приемов.
Поддерживаемая культура органов на искусственных питательных средах была получена в 20-х годах нашего столетия, а истинная культура тканей спустя приблизительно десятилетие. Совершенствование методов стало возможным после привлечения индолилуксусной и нафтилуксуснои кислот - препаратов группы ауксинов. Однако и в их присутствии случаи регенерации в каллусной культуре были настолько редки, что сама гипотеза о тотипотентности растительных клеток была поставлена под сомнение. И только в 1939 году Уайт (Ph.White, 1939) опубликовал результаты экспериментов, в которых было получено большое количество почек табака, развившихся в культуре каллусной ткани. Этими экспериментами была четко продемонстрирована теоретическая возможность размножения in vitro и частично подтверждена идея тотипотентности. В дальнейшем было показано, что препараты группы ауксинов, которые были известны как стимуляторы корнеобразования на черенках, являются и стимуляторами роста клеток in vitro, но сильно ингибируют инициацию почек и побегов. Поиски препаратов, индуцирующих органогенез в культуре каллусных тканей, позволили выявить положительную роль некоторых неорганических фосфатов, аденина и аденозина. а позднее и открытого в 1955 году кинетина. В 1957 году Скуг и Миллер опубликовали ставшее классическим учение о взаимосвязи ауксинов и цитокининов в контроле регенерации побегов и корней, которое стало краеугольным камнем в теории размножения in vitro. В 1958 году Тиманн (К.V.Thimann, 1958, цит. по D.F.Wetherell, 1982) показал роль цитокининов в процессе снятия апикального доминирования у латеральных почек, которые в норме находятся под влиянием апикальной почки верхушки побега. Этот факт известен сейчас как физиологическая база усиления бокового ветвления в системах размножения in vitro (D.F.Wetherell, 1982).
Перечисленные разработки стали основой для использования биотехнологических приемов в садоводстве. Первым применением этих методов стало использование несимбиотического проращивания семян орхидных (L.Knudson, 1922). В 60-х годах фитопатологи стали успешно разрабатывать методы культуры изолированных апексов для элиминации вирусов, а 70-е годы ознаменавались созданием системы клонального микроразмножения для декоративных, овощных, плодовых, ягодных, лесных и других культур.
Физиологическое состояние растений-источников эксплантов
Строение исходных эксплантов, вводимых в стерильную культуру, зависит от целей, которые при этом преследуются. Это могут быть изолированные апексы для получения оздоровленного посадочного материала или клонального микроразмножения, изолированные верхушечные или боковые почки с фрагментами стебля или без него, листовые диски или целые листовые пластинки, отрезки черешков и междоузлий для исследований, связанных с получением каллуса, отбора сомакло-нальных вариантов, получения трансгенных растений, пыльники, семяпочки, фрагменты цветка, зародыши разных фаз развития для селекционных целей и другие части растений.
Наиболее часто используют экспланты, включающие собственно меристематическии купол и один или несколько примордиальных листьев, размер которых составляет 0,1-1,0 мм (T.Murashige, J.B.Jones, 1974). Слишком маленькие экспланты некоторых культур, по-видимому, не способны к развитию (O.M.Stone, 1963), а культура истинных меристем без окружающих тканей возможна лишь для ограниченного круга растений (P.H.Smith; T.Murashige, 1970; Ю.Г.Попов, В. Г. Трушечкин, 1972; T.Murashiqe, J.B.Jones, 1974). Успешное культивирование большинства видов растений достигается только при использовании апексов с 2-3 и более примордиальными листьями (E.Ball, 1946; D.Walkey, 1968; O.P.Jones, S.J. Vine, 1968; C.Putz, 1971). Присутствие субапикальной ткани для целей оздоровления является нежелательным вследствие наличия там элементов сосудистой системы. Однако, при микроразмножении экспланты могут нести некоторое количество нижерасположенной ткани стебля, так - 39 как это положительно влияет на скорость развития изолированных апексов (G.Hussey, 1971).
Во многих случаях, когда не удавалось добиться успешного культивирования меристематических верхушек, исследователи шли по пути увеличения размера инициальных эксплантов (Т.В.Некрасова, 1964; G. Jacobs., etal., 1969; L.E. Powell, L.J. Edgerton, 1974). Эта тенденция сохранилась и до сегодняшних дней, когда при сложностях введения в культуру инициальных эксплантов некоторых видов рода Vacclnlum, проблема была решена путем увеличения размера эксплантов до нескольких сантиметров (P.M. Lyrene, J.L.Perry, 1988, R.Scorza, W. V.Weller, 1988).
Физиологическое состояние растений-источников эксплантов. Говоря о физиологическом состоянии растений-доноров, в первую очередь, имеют ввиду их возраст и сезонность развития. Было четко показано, что экспланты сеянцев легче регенерируют In vitro , обнаруживают большую способность к образованию дополнительных побегов и более склонны к корнеобразованию (D.G.Walkey, 1972; A.J. Abbott, E.Whiteley, 1976). Причем, в случае древесных видов растений способность к регенерации культивируемых тканей и органов снижалась с каждым годом, хотя признаки ювенильности у сеянцев еще сохранялись (Т.-Y.Cheng, 1975). У травянистых видов растений экспланты, взятые от недавно развившихся органов также оказались более способными к регенерации по сравнению с эксплантами от более старых частей (T.Murashige, R.Nakano, 1967). Даже в случае использования тканей зародышей, экспланты, взятые на ранних фазах развития эмбрионов, обладали большим морфогенетическим потенциа - 40 лом, по сравнению с тканями зрелых зародышей (T.Murashige, 1974; C.E.Green, R.L.Phillips, 1975).
Эксперименты, проведенные с земляникой, крыжовником и некоторыми другими культурами, показали преимущество использования экс-плантов из терминальных почек по сравнению с боковыми. Возможно, это объясняется специфическим содержанием эндогенных регуляторов роста, в частности, обогащением ауксиноподобными веществами терминальных почек. Известен также факт повышенной способности к регенерации апексов подземных побегов малины (С.Е.Щелкунова, Ю.Г.Попов, 1970), который можно отчасти объяснить этиоляцией, обуславливающей особое физиологическое состояние источников экс-плантов. С другой стороны, выживаемость и число развившихся побегов было больше у эксплантов винограда из боковых почек, по сравнению с верхушечными (Yu Dan-hua, C.P.Meredith, 1986). Кроме того, экспланты из затененных верхушек побегов имели преимущество перед эксплантами из побегов, выросших на солнце.
Что касается сезонных фаз развития, то в подавляющем большинстве случаев изоляция эксплантов после прохождения растениями органического покоя в фазы начала активного роста - активный рост побегов давала лучшие результаты, по сравнению с фазами окончания активного роста и физиологического покоя (В.А.Высоцкий, 1978). Имеются наблюдения, что ризогенез лучше идет у эксплантов из покоящихся почек, в то время как развитие надземной части более выражено у эксплантов, взятых в фазу активного роста.
Использование биотехнологических приемов в селекции растений
В настоящие время необходимость сохранения генофонда культурных и дикорастущих видов растений-сомнений не вызывает. Для многих культур эту проблему можно решить с помощью создания своеобразных банков семян, однако для вегетативно размножаемых растений, к которым относится подавляющие большинство плодовых и ягодных растений, а так же для растений, семена которых не переносят высыхания, банки семян являются неприемлемыми (Р.Г.Бутенко, 1983). В этом случае для сохранения генофонда таких растений идеальным решением могло бы стать создание биосферных заповедников или закладка коллекционных насаждений. Но и эти меры, помимо того, что они являются крайне дорогими, не могут обеспечить надеж - 66 ного сохранения уникальных генотипов (C.P.Wilkins, J.H.Dodds, 1983). В случае необходимости обеспечения репрезентативности генетического разнообразия, главной трудностью является большое число индивидуальных требований для сохранения каждого коллекционного образца. Подсчитано, что число экземпляров, необходимых для обеспечения адекватного образцу генетического разнообразия древесных видов будет варьировать от 20-30 для маленькой единич-ной популяции до нескольких сотен для сохранения пула генов и до 5000 для сохранения гетерозиготности. Например, для миндаля выделение только одного дерева в каждой тысячи из существующих трех миллионов составит 3000 экземпляров, подлежащих хранению, что займет площадь в 15 га (J.T.Sykes, 1975). Аналогично этому, площадь для сохранения коллекции диких типов, экотипов и сортов фис-ташки составит не менее 21 га (D.H.Maggs, 1973). Частично площади коллекций могут быть сокращены за счет использования карликовых подвоев и использования одного подвоя для прививки нескольких сортов. Так, в Бельгии для сохранения старых сортов яблони и груши была использована посадка в виде кордонов (0,5 х 2,0 м), что позволило на площади 0,2 га содержать до 1000 сортообразцов (по 2 # дерева каждого сорта). Однако, такие насаждения крайне уязвимы с фитосанитарной точки зрения и генетической эрозии (C.Populer, 1955). Подобная ситуация складывается и при создании коллекций ягодных культур.
Еще большие проблемы возникают при необходимости создавать коллекции оздоровленных экземпляров (репозитории), в которых не # # обходимо предусмотреть меры зашиты от возможного повторного зара жения. Все это заставляет искать альтернативные способы содержа ния коллекций. В последние годы для этих целей все шире привлека - 67 ются методы культуры изолированных тканей и органов. В основу таких способов положена возможность поддержания жизнеспособности пробирочных растений или их отдельных органов в течение длительного времени (Ph.Boxus, 1974 a,b; G.Morel, 1975; P.H.Mullin, G.E.Shlegel, 1976; В.А.Высоцкий, 1982; В.И.Деменко, В.Г.Трушеч-кин, 1988).
Возобновление растений идет через меристемы. Меристемы можно рассматривать как хранилища генетической информации. Именно здесь у большинства покрытосеменных растений в слое L находятся клетки, ответственные за формирование гамет (генетически эффективные клетки) и условием, обеспечивающим стабильность половых линий растений является генетическая стабильность меристематических клеток (F.D.Amato, 1975). Благодаря высокому уровню восстановительных процессов в меристематических клетках их генотип находится в более стабильном состоянии (Р.Г.Бутенко, 1985; А.М.Гродзинс-кий, 1986).
Существует три основных возможности хранить растительный материал In vitro: 1) хранение постоянно растущих культур при нормальной скорости роста, 2) хранение культур в условиях минимального роста, 3) хранение в условиях сверхнизких температур (крио-консервирование). Каждый из этих способов характеризуется своими особенностями и выбор осуществляется для конкретных видов растений, целей и наличии условий. Рассмотрим кратко основные аспекты каждого метода.
Хранение в условиях нормального роста. Этот метод ничем не отличается от обычного культивирования и требует постоянного внимания. Поскольку частота мутаций, по-видимому, прямо зависит от скорости клеточных делений, при этом способе риск генетических изменений может быть максимальным. В то же время этот способ может быть полезен для поддержания культур тех видов растений, для которых отдельные этапы получения растений (укоренение, адаптация к нестерильным условиям) вызывают затруднения. Такие поддерживаемые культуры могут стать основой для разработки методов хранения в условиях минимального роста и составной частью программ для криосохранения. В частности, таким образом в течение уже многих лет поддерживается коллекция различных видов рода Mallus (C.P.Wilkins, G.H.Dodds, 1983).
Хранение в условиях минимального роста. Эта группа методов базируется на хранении культур побегов или пробирочных растений, полученных из меристем в условиях которые обеспечивают только минимальный рост. Эти методы имеют ряд неоспоримых преимуществ, поскольку хранящийся материал всегда готов для дальнейшего использования, визуальный контроль позволяет оценить его жизнеспособность, а хранящиеся культуры могут легко заменяться при необходимости.
Обеспечение минимального роста может быть достигнуто несколькими путями. Прежде всего это изменение физических условий культивирования (температура, состав газовой среды, спектральный состав света и т.д.). Другим способом является изменение основной культуральной среды за счет удаления или снижения уровней факторов, существенных для нормального роста.
Изменение регенерационной способности эксплантов в зависимости от длительности культивирования In vitro
Вопросы длительности культивирования эксплантов in vitro представляют большой интерес, как с точки зрения сохранения генетической стабильности, так и в отношении изменения физиологического состояния растений, следствием чего может стать изменение коэффициента размножения и ризогенной способности эксплантов. Существующие в литературе данные по этому вопросу далеко не однозначны. Так, для эксплантов вишни, сливы, яблони, алычи отмечено постепенное увеличение коэффициента размножения к пятому-седьмому пассажу, а затем некоторое его снижение (В.Г.Трушечкин и др., 1987; B.H.Howard et а!.. 1989; C.A.Webster, O.P.Jones, 1989; Н. П. Заузолкова, Л. С.Михальчик, 1990; С. А.Корнацкий, 1991). С другой стороны, коэффициент размножения у эксплантов ежевики снижался уже после третьего пассажа (O.C.Broome, R.H.Zimmerman, 1978), а при культивировании эксплантов ряда сортов малины на протяжении шести субкультивирований отмечено лишь незначительные изменения в степени пролиферации (Туровская Н. И., Стрыгина О.В., 1990).
Многие исследователи отмечали увеличение потенции к корнеоб-разованию с числом пассажей. Параллельно установлено существенное влияние генотипа на проявление способности к ризогенезу. Так, если экспланты яблони сорта Джонатан уже в девятом пассаже давали побеги, укоренявшиеся на 90%, то у сорта Ред Делишес даже после 31 пассажа побеги укоренялись только на 79% (S.Sriskandarajan et al., 1982). Эксперименты по микроразмножению сорта яблони Гринс-ливз и подвоя М 7 также показали, что для достижения одинакового процента укоренения эксплантам подвоя требовалось гораздо меньшее число пассажей (O.P.Jones et al., 1982). Длительность культивирования оказывает существенное влияние и на каллусогенную способность (V. T.Stontemyer, O.K.Brltt, 1965).
Наблюдения, проведенные в процессе микроразмножения различных культур показали, что темпы развития эксплантов могут существенно изменяться в процессе культивирования. На этапе введения в стерильную культуру и в первом субкультивировании коэффициент размножения и длина образуемых побегов были ниже, чем в последующих пассажах (табл. 38, 39).
Наибольшие коэффициент размножения и длина побегов у всех испытанных представителей рода Rubus были отмечены после второго субкультивирования, а в дальнейшем наблюдалась тенденция к их снижению, более выраженная у ежевики и малины черной. Вместе с тем в шестом субкультивировании снова отмечали увеличения темпов роста побегов и увеличение коэффициента размножения, что свидетельствует в пользу определенной цикличности процессов при кло-нальном микроразмножении. Этот факт хорошо согласуется с результатами, полученными на других культурах (В.Г.Трушечкин и др., 1987; В.А.Высоцкий, С.А.Корнацкий, 1992).
Необходимо отметить, что потребность эксплантов в регуляторах роста может также меняться в зависимости от числа проведенных субкультивирований. Так, например, если после первого пассажа экспланты ежевики сорта Торнфри формировали максимальное число побегов и листьев при концентрации 6-бензиламинопурина в среде 3,0 мг/л, то уже в третьем и последующих субкультивированиях Число субкультивирований оказывало также существенное влияние на укореняемость побегов и параметры корневой системы. Так при высадке побегов ежевики сорта Торнфри на среду для укоренения без регуляторов роста, после пятого пассажа укореняемость возрастала приблизительно в четыре раза, а число корней увеличивалось в 3, 2 раза по сравнению с таковым у побегов, высаженных на среду для укоренения после второго пассажа (табл. 40). У побегов малины
черной с увеличением числа субкультивирований от трех до пя-ти-шести укореняемость возрастала в 1,5-1,8 раза как на средах, содержащих в качестве индуктора ризогенеза индолилмасляную кислоту, так и на средах, лишенных регуляторов роста. Изучение процессов ризогенеза у 8 сортов сливы показало, что эффективное укоренение может быть осуществлено, начиная с четвертого субкультиви рования. Анализ полученных результатов позволил отметить тенденцию снижения оптимальной концентрации индуктора ризогенеза для побегов из более поздних субкультур. Повышение процента укореняе-мости микроразмноженных побегов имело место и при их высадке после обработки индукторами ризогенеза непосредственно в стерильные почвенные субстраты (С.А.Корнацкий, В.А.Высоцкий, 1992).
Как известно, любое растение, в том числе и выращиваемое In vitro, проходит определенный цикл развития с постеленным старением тканей и затуханием ростовых процессов. При периодической смене питательных сред и рекультивирования вновь образующихся молодых побегов процессы старения тканей замедляются, так как происходит постоянное обновление культуры. В настоящее время нарастание вегетативной продуктивности и повышение укореняемости побегов в процессе культивирования на питательных средах чаще всего объясняют процессами реювенилизации, связанными с увеличением в экс-плантах доли молодых клеток, изменениями биохимического состава, а также анатомо-морфологической подготовленностью тканей к регенерации (С.А.Острейко, 1985; P.F.Warelng, 1987; А.Г.Юсуфов, 1988). Однако,такое объяснение, на наш взгляд , правомерно не во всех случаях, так как иногда растения, полученные методом культуры тканей вступают в фазу плодоношения раньше, чем выращенные по традиционной технологии.
