Введение к работе
Актуальность темы. Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.
Значительный прогресс в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых к пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [Behura, 2006].
Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых
маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов и позже ДНК-маркеров,
во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономер
ностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров, используе
мых сегодня - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-марке
ры позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы там, где
этого не могут сделать никакие другие методы исследований. Использование
ДНК-маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных на
секомых - паразитов и хищников, так и вредителей. Кроме того, они могут ис
пользоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993;
Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е.
биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды,
которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом
[Mitchell et al, 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].
Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, в нашей стране в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].
Несмотря на то, что фенетические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за
существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, как правило, весьма значительна, что затрудняет оценку и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.
Использование для этих целей современных методов молекулярно-генети-ческого анализа, в частности ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров, может во многом способствовать решению этих проблем. Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство популяций непосредственно на генетическом уровне и другие параметры, которые невозможно оценить с помощью морфологических критериев.
Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты. Существует также недостаток знаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики защиты растений от вредных насекомых.
В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК-технологий и в частности генной инженерии. Генетическая инженерия по сути продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает той же цели более эффективным и быстрым путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР) и некоторые виды ГМ-насекомых, которые нашли применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Однако их использование в нашей стране и в частности ГМ-растений сдерживается недостаточным изучением вопросов их экологической безопасности.
В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое
отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных ис-
пытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.
Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось теоретическое обоснование применения молекулярно-генетических методов в
практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных Zft-защищенных растений на экологическую безопасность и на этой основе разработка новых методов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.
Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:
-
Разработать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.
-
Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.
-
Изучить влияние инсектицидов, географического положения и условий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций насекомых-вредителей.
-
Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и Zft-картофелю и на этой основе разработать новые методы мониторинга резистентности вредных насекомых.
-
Усовершенствовать методы детекции и количественной оценки трансгенов в биоматериале.
-
Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.
-
Оценить пролонгированное влияние трансгенного (Bt) картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а именно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции картофельной минирующей моли, а также на жизнеспособность насекомых.
Научная новизна.
Разработаны новые системы описания рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.
Выявлены закономерности изменчивости фенетической структуры популяций насекомых под влиянием инсектицидов и других стрессовых факторов внешней среды. Показано, что чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций, как считалось ранее, но в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.
Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка, что ограничивает возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности этого вредителя к инсектицидам.
По данным молекулярно-генетических исследований показано генетическое сходство клопа вредная черепашка с другими представителями семейства Pentatomidae, что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.
Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса се-
лекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-мар
керы резистентности клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58
Новый.
Разработана математическая модель, позволяющая проводить прогноз развития резистентности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.
Разработан метод полуколичественной оценки содержания генетически модифицированных источников в зерне сои и соевой муке.
Разработан новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и метод оценки влияния ^/-картофеля на картофельную моль в ряду нескольких генераций насекомых.
Практическая значимость результатов исследований.
-
Разработаны системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.
-
Разработана методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.
-
Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, постоянно взаимодействующей с инсектицидом.
-
Разработаны новые методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале, которые предлагается использовать в целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов.
-
Разработан новый метод мониторинга резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.
-
Предложен подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки влияния Bt-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на этапе предрегистрационных испытаний 5/-картофеля.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Новые системы описания феноформ рисунка и окраски колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более эффективно проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, нежели традиционные. Фенетическая структура популяций насекомых определяется не столько пестицидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.
-
Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с использованием предлагаемой нами формулы расчета. Использование для этих целей фенетических маркеров необходимо рассматривать только в качестве предварительной, грубой оценки.
-
Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на обработке инсектицидом выборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей создания новых методов мониторинга и прогноза развития резистентности.
-
Новый подход для оценки пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки влияния трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на основе использования сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости моле-кулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.
-
Метод полуколичественной оценки на основе ПЦР по целевому гену устойчивости к гербициду раундап (СР4 EPSPS) для целей мониторинга генетически модифицированных источников в зерне и зернопродуктах сои.
Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг. «Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов» по этапу «Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на основе оптимизации их по экономической эффективности, биологической и экологической безопасности».
Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, а также научно-практических конференциях: Международной конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (КубГАУ, Краснодар, 2001); Международной конференции «Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг», (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи, 2003); VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); 2-м Московском международном конгрессе: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КубГАУ, 2003); Международной конференции «Биологическая защита растений -основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи,
2004); IV Семинаре-совещании «Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2005); международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005); 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес» «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность» (2006,Пущино); Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агро-экосистем» (Краснодар.2006); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (пос. Агой туапсинского р-на-2006, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона» (Ставрополь, 2007); 13 съезде Русского энтомологического общества (Краснодар.2007); международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2008); II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2009); X сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроценозах» (Киев, 2009).
Работа поддержана субвенциями Миннауки: "Оценка биологической эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и разработка методов оценки их биоценотической безопасности", а также РФФИ и администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644,09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТЦ №3768.
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях - в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций, списка литературы и четырех приложений; содержит 48 таблиц и 60 рисунков. Список литературы содержит 404 источника, из них 66 на русском языке.
