Содержание к диссертации
Введение
1.1 Видовой состав и распространенность возбудителей рода Xanthomonas на растениях семейства Мятликовые 10
1.2. Биологические особенности возбудителей бактериальных заболеваний злаковых культур 18
1.2.1 Культурально-морфологические свойства возбудителей 18
1.2.2 Симптомы проявления бактериозов 20
1.3.Методы диагностики фитопатогенных бактерий 29
1.4. Методы защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах 35
ГЛАВА II. Материалы и методы 38
ГЛАВАIII. Изучение видового разнообразия фитопатогенных бактерий рода xanthomonas, поражаюжих злаковые культуры 49
3.1.Видовой состав возбудителей рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые 50
3.2. Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST) 58
3.3. Оценка вирулентности штаммов 65
ГЛАВА IV. Усовершенствование методов диагностики фитопатогенных бактерий рода xanthomonas, поражаюжих злаковые культуры 68
4.1 Оптимизация метода выделения бактерий из семян ячменя и риса 68
4.2. Идентификация возбудителей бактериозов методом классической ПЦР
и прямого секвенирования 72
4.3. Разработка методов выявления и идентификации Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». 78
4.4. Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа 88
ГЛАВА V. Поиск эффективных приемов защиты от возбудителя бактериального ожога листьев риса 93
Заключение 97
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список литературы 100
- Культурально-морфологические свойства возбудителей
- Методы защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах
- Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST)
- Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа
Культурально-морфологические свойства возбудителей
Как уже было отмечено, рисосеющие районы нашей страны расположены в зоне умеренного климата на 40-47 градусах с.ш., то есть значительно выше фактического ареала X. oryzae pv. oryzicola. Маловероятно, что рассматриваемый вредный организм сможет акклиматизироваться в более северных широтах, чем его фактический ареал, так как он очень требователен к теплу и влаге (80-90% влажность и температура воздуха 26-30 градусов по Цельсию) в течение вегетационного сезона. В литературе не описано случаев интродукции вредного организма в умеренные широты. Таким образом, рисосеющие зоны нашей страны не могут считаться зонами, подверженными опасности в отношении X. oryzae pv. oryzicola (Шнейдер, 2006).
Среди наиболее вредоносных бактерий-возбудителей бактериозов зерновых культур также выделяют бактериальную штриховатость листьев (Bacterial leaf streak, BLS), вызываемую различными патотипами Xanthomonas translucens (Jones, 1917, Vauterin, 1995). Эта болезнь при поражении колоса носит название черный бактериоз (black chaff) и чаще поражает зерновые культуры в странах с влажным и теплым климатом (Duveiller, 1989, 1994, 1997). Существует много специализированных форм этого патогена, различающихся по кругу растений-хозяев, а именно: X. translucens pv.undulosa (патоген пшеницы), X. translucens pv. secalis (патоген ржи), X. translucens pv. hordei (патоген ячменя), но в последнее время их объединяют в один вид X. translucens. В последние годы появились сообщения о переходе данного патогена к поражению других растений вне семейства Мятликовые (Taylor et al., 2005).
Информация о заболевании появилась в конце прошлого века; однако, иногда данные были противоречивы, так как симптомы на ранних стадиях часто путают с проявлениями абиотического стресса известного как псевдо черный бактериоз (Broadfoot and Robertson, 1933; Hagborg, 1936).
Возбудитель был впервые выявлен на ячмене (Jones et al., 1917), позже на пшенице (Smith et al., 1919), ржи (Reddy et al., 1924), многолетних травах (Wallin, 1946a) и, наконец, на тритикале (Zillinsky and Borlaug, 1971).
Бактериальная штриховатость листьев широко распространена по всему миру (Duveiller et al., 1997) (приложение 3). В Северной Америке бактериальная штриховатость листьев была зарегистрирована в нескольких штатах США (Heald, 1906; Jones et al., 1916; Smith, 1917; Johnston, 1929; Melchers, 1930; Milus and Kirkpatrick, 1990; Murray and Malloy, 1990). В последнее время вспышек заболевания в Канаде не наблюдалось (Hagborg, 1934; 1968; 1974). В Мексике болезнь была зарегистрирована на северо-востоке в 1931 (Bamberg, 1936) и на сегодняшний день отмечена в районе умеренного и влажного центрального нагорья Толука (2650м над уровнем моря) (Duveiller, 1989). В Южной Америке, черный бактериоз чаще всего встречается на пшенице, хотя также его отмечали на злаковых сорняках (Mehta, 1990; Duveiller et al., 1991). Болезнь также встречается в Аргентине, Боливии, частично в Бразилии, Парагвае, Перу и Уругвае (Mehta, 1990; Duveiller, 1989; Pereira et al., 1983; Luzzardi et al., 1983; Mohan and Mehta, 1985; Duveiller et al., 1991; Frommel, 1986; Tessi, 1949; Abadie, 1988).
В Азии, болезнь была отмечена на пшенице в Китае (Chen and Ding, 1981; Sun and He, 1986), Пакистане (Akhtar and Aslam, 1985 and 1986) и Иране (Alizadeh and Rahimian, 1989; Alizadeh et al., 1995); и на тритикале в Индии (Richardson and Waller, 1974).
На Ближнем и Среднем Востоке, патоген поражает твердые сорта пшеницы на орошаемых землях Сирии (Mamluk et al., 1990), Израиля (CIMMYT, 1977) и Турции (Sands and Fourest, 1989; Demir and stn, 1992). В Европе первые сообщения о черном бактериозе были получены из Франции, Бельгии и России (Millasseau, 1928; Hocquette, 1929; Marchal, 1930 и 1932, Горленко и др., 1939). Тем не менее, позже Маршаль Е. (1948) отрицал, что черный бактериоз был отмечен в Бельгии.
В 1960 году Горленко В.М. отметил появление X. translucens and X. secalis в Омской области (Россия), также очаги отмечались в Красноярске (Добрецов, 1963) и Новосибирской области (Бушкова, 1966). Черный бактериоз распространен во всех регионах Российской Федерации, где культивируют пшеницу, и считается наиболее вредоносным бактериозом этой культуры.
В настоящее время болезнь отсутствует в Западной Европе (Paul and Smith, 1989), вероятно, из-за неблагоприятных условий окружающей среды, в частности, низких температур. Тем не менее, встречаются периодические вспышки заболевания на ячмене в Испании (Noval, 1989), на тритикале и пшенице в Польше, что указывает на то, что риск эпифитотии в Западной Европе не следует недооценивать.
В Африке, бактериальная штриховатость листьев была обнаружена в Кении (Burton, 1930), Эфиопии (Korobko et al., 1985), Южной Африке (Vervoerd, 1930; Smit and Van A, Bredenkamp, 1988), Танзании (Bradbury, 1986), Ливии и на Мадагаскаре (Bragard et al., 1995) и Марокко (Sands and Fourest, 1989). В Австралии заболевание было зарегистрировано на пшенице и ржи (Moffett, 1983) в Новом Южном Уэльсе (Noble, 1935).
Сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2001-2008 гг. впервые был выделен и изучен новый для Российской Федерации патоген Xanthomonas arboricola, вызывающий поражение пшеницы, ржи, ячменя, овса, подсолнечника и крестоцветных культур (Игнатов и др., 2010). Данный возбудитель стал главной причиной низкого урожая подсолнечника в Ростовской области в 2011 году. Из-за Xanthomonas arboricola средняя урожайность культуры составила 8-9 ц/га (при обычном урожае 24-28 ц/га) (Харченко, 2012).
Бактериальная пятнистость, вызываемая патогеном Xanthomonas arboricola, является наиболее вредоносным заболеванием растений таких семейств, как молочайные, розоцветные, березовые, ореховые, ивовые и банановые.
X. arboricola pv. pruni вызывает бактериальные пятнистости косточковых культур рода Prunus, как культурных и декоративных, так и дикорастущих. Симптомы данного заболевания проявляются на листьях, почках, ветвях и фруктах растений (EPPO, 1997). Бактериальная пятнистость впервые была зарегистрирована в Северной Америке (Мичиган) на японской сливе (P. salicina) в 1903г. (Smith, 1903). В настоящее время болезнь зафиксирована во многих европейских странах, где произрастают косточковые культуры рода Prunus spp: Италии, Словении, Франции. Если вначале XX в. бактериальные пятнистости, вызванные X. arboricola pv. pruni, были широко распространены преимущественно в южных регионах, то в последнее время, бактерии данного вида стали поражать культуры и в странах умеренного климата (Венгрия, Швейцария) (EPPO, 1997). Впервые бактериоз сливовых был обнаружен в центральной части России в конце 1970-х гг.. (EPPO, 1997).
Методы защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах
Отличительным признаком бактериального ожога от физиологического нарушения, сопровождающегося пожелтением листьев, является выделение вязкой жидкости желтого цвета (экссудата) при срезе пораженного листа или растения.
В странах тропической Азии потери от бактериального ожога риса достигают в зависимости от сорта от 60 до 81% урожая, в странах умеренного климата - до 30% (Ои, 1972).
На Филиппинах потери составляют до 22,5% во влажные сезоны и до 7,2% - в сухие на чувствительных сортах, и 9,5 и 1,8% соответственно на устойчивых (Ои, 1985; Reddy et al., 1979). Азотное питание, как считают, увеличивает чувствительность растений. Потери обычно менее значимы на менее плодородных почвах и на урожаях, выращиваемых в летнее время (декабрь - апрель). Культуры, посаженные осенью (май - сентябрь) и зимой (июль - декабрь), испытывают более значительные потери. Больные растения содержат высокий процент пустых зерен (Ои, 1985; Reddy et al, 1979).
Бактериальный ожог риса представляет серьезную угрозу для региона ЕОКЗР. Xanthomonas oryzae pv. oryzae - один из наиболее важных объектов в Списке А1 Перечня карантинных объектов для европейских стран.
Есть сведения, что заболевание было зарегистрировано на территории бывшего СССР (Краснодарском и Приморском краях, Узбекской и Казахской ССР, Дагестанской АССР, на Украине в Крымской, Одесской и Херсонской областях, на Дальнем Востоке), но точного подтверждения не было (EPPO/CABI, 1997).
Важными факторами для развития болезни являются климатические, почвенные условия и агротехнология рисоводства. Наиболее благоприятными для развития бактериоза являются районы с кислой почвой и высоким уровнем грунтовых вод. Повышенная температура (24-30) и до 200 мм осадков в месяц, дефицит фосфора, калия, а также высокий уровень азота благоприятно действуют на развитие болезни и способствуют быстрому распространению бактериального ожога риса. В основном бактериальная полосчатость риса - менее значимое заболевание, чем бактериальный ожог риса.
Вредоносность бактериальной полосатости риса гораздо ниже, чем ожога, однако в очень влажные сезоны при использовании высоких норм азота в Индии потери достигали 5-30% урожая.
Бактерии проникают в лист через устьица или поранения. Распространение в поле происходит при механическом контакте с дождевой или ирригационной водой. Роль семян в переносе и сохранении бактерий известна, но роль сорных растений мало изучена. Бактерии могут сохраняться от сезона к сезону на зараженных листьях или их остатках, но не могут выжить в нестерильной почве (Devadath, 1970). Не описано различных рас или различной специфичности бактерий.
X. oryzae pv.oryzicola вызывает появление на листьях между жилками узких темно-зеленых водянистых штрихов различной длины, которые с развитием болезни удлиняются, распространяясь по всей длине листа параллельно жилкам (рис.1.2.1б). Постепенно повреждения расширяются и могут сливаться, цвет меняется от оранжево-желтых до коричневых, в зависимости от сорта. На поверхности листьев может выступать экссудат.
На последней стадии развития обе болезни трудно различить между собой, но главным отличительным признаком болезней является внешний вид повреждений. При бактериальном ожоге края листьев бывают волнистыми, в отличие от прямых краев при бактериальной полосчатости риса. Кроме того, возбудитель бактериального ожога риса поражает в основном сосудистую систему и листовые влагалища, а возбудитель бактериальной полосчатости риса - паренхимные ткани листа.
Заражение бактериальной штриховатостью листьев, вызываемое X. translucens, происходит в разных условиях: на орошаемых полях в умеренном климате, при большом количестве осадков в субтропическом высокогорье, а также при часто изменяющемся температурном режиме ирезком перепаде температур. Бактерии передаются через семена. Скорость передачи довольно низкая, но при оптимальных условиях является первооисточником серьезных вспышек. Распространение происходит ветром и дождем, а также при контакте здорового растения с больным (Boosalis, 1952). Бактерии могут сохранять жизнеспособность в семенах более 36 месяцев. Опыты показали (Sands et al., 1986), что растения во влажных условиях сильнее подвержены заражению. Бактерии сохраняют свою жизнеспособность в диапазоне температур от 15 до 300С (Duveiller et al., 1991), оптимальной является температура около 220С. Распространению патогена благоприятствует высокая относительная влажность.
Бактериоз поражает листья, стебли и колосья. На первой стадии болезни на листьях появляются маленькие продолговатые водянистые, просвечивающиеся пятна светло-зеленого цвета. Затем эти пятна разрастаются и меняют окраску от желтой до коричневой (даже черной). На пятнах выступает клейкая слизь (экссудат). При высыхании экссудата образуется желтоватая пленка (рис.1.2.2а, б). При сильном поражении листья могут отмирать. На стеблях образуются черные или коричневые полосы, под колосом может возникнуть сплошное побурение. На колосьях отмечают почернение верхней части чешуй. Позднее появляются коричневые боковые полосы вдоль чешуй (рис.1.2.2в). Сильно пораженные растения не выколашиваются. Больные растения дают только щуплое зерно, на котором заметны желтые полосы (Sands and Fourest, 1989). У некоторых растений колос вообще может отсутствовать. При поражении грибной инфекцией, вызывающей схожие симптомы, нет резкой границы в изменении цвета больной ткани, а пигментация захватывает также и цветочные пленки.
Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST)
В настоящее время существует множество разнообразных молекулярно–генетических методов диагностики, позволяющих идентифицировать возбудителей болезней растений. Данные методы основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов, которые являются наиболее стабильным признаком организма в течение его жизни и жизни его потомства и обеспечивают точную диагностику. Такие методы информативнее других видов анализа, хотя они более сложны и трудоемки. В практической диагностике данные методы позволяют выявить наличие патогена в латентной форме в практической диагностике.
В настоящее время, наряду со всеми известными методами для фундаментального изучения таксономии бактерий, применяется метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing - MLST), который является альтернативой, среди используемых в настоящее время методов диагностики. Мультилокусный анализ позволил качественно улучшить идентификацию и диагностику бактериальных штаммов.
Данный метод был предложен в качестве доступного, подходящего и универсального метода для диагностики бактерий в 1998г. (Maiden et al., 1998). Более тридцати работ опубликовано к настоящему моменту, в основном для патогенных грибов и бактерий, необходимых в изучении популяционной биологии, эволюции и патогенности бактерий и в дальнейших эпидемиологических исследованиях (Maiden, 2006).
Важнейшим преимуществом метода мультилокусного сиквенс типирования является наличие международной базы данных (http://www.mlst.net), позволяющей хранить информацию обо всех известных сиквенс-типах, пополнять ее и в режиме on-line сравнивать собственные данные с накопленными ранее. На их основе возможно изучение генетического полиморфизма изучаемых генов патогена и выявление родственных связей.
Метод заключается в секвенировании 6-7 фрагментов генов длиной от 450 до 800 п.о. или целых генов «домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллелей (более 10), характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных.
Настоящая глава, посвящена расшифровке последовательностей ДНК имеющейся у нас коллекции штаммов бактерий рода Xanthomonas, выделенных из растений семейства Мятликовые, а также установлению родственных связей и изучению изменчивости на основе нескольких хозяйственно-важных (house-keeping) генов.
Для изучения генетического полиморфизма и проведения секвенирования бактерий рода Xanthomonas была использована коллекция штаммов, выделенных нами из растений и семян семейства Мятликовые, а также коллекция штаммов ВКФПМ и типовые штаммы из коллекции NCPPB (табл. 2.1). Коллекцию бактериальных штаммов хранили при -700С в 15% глицерине. Для получения биомассы бактерии высевали на среду YDC и выращивали в течение 48 часов. Выделение ДНК из бактерий проводили с помощью набора «Проба-ГС» («ДНК-технология», Москва), согласно рекомендациям производителя.
Для анализа штаммов методом MLST были использованы ранее опубликованные праймеры (приложение 5) (Young et al., 2008). Для гена Тау и гамма субъединиц ДНК полимеразы 3 (DNA polymerase III tau and gamma subunits - dnaX), были использованы праймеры dnaXF/dnaXR. Для последовательности гена -субьединица ДНК (gyrB) были использованы праймеры XgyrB1F/ XgyrB1R. Для последовательности гена -фактор РНК-полимеразы (rpoD) были использованы праймеры XrpoD1F/ XrpoD1R. Для последовательности гена TonB-зависимый рецептор fyuA были использованы праймеры XfyuA1F/ XfyuA1R (приложение 5). Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных Генбанка проводили с помощью программы NCBI Blast (Altschul et al., 1997). Проверку и редактирование последовательностей вручную проводили с помощью редактора «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLAST. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате проведенного анализа секвенирования были расшифрованы последовательности ДНК бактерий рода Xanthomonas, (см. табл. 2.1) по четырем изучаемым генам. Все последовательности были выровнены и проанализированы на сходство с использованием сервер BLAST.
Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа
Определение чувствительности ПЦР «в реальном времени» при диагностике X. oryzae и X.arboricola. При постановке ПЦР «в реальном времени» чувствительность каждого из подобранных зондов определяли путем внесения известного числа клеток возбудителя с последующей постановкой ПЦР в «реальном времени». Готовили суспензию клеток X. oryzae и X.arboricola. Определение концентрации бактериальной суспензии проводили методом серийных разведений. Подсчет колоний проводили через сутки и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл). Образцы ДНК каждого разведения возбудителей ставили с подобранными видоспецифичными зондами. Результаты исследования представлены в таблице 4.3.4.
Примечание: Ct-значение порогового цикла, N/A - отсутствие сигнала флуоресценции Из таблицы видно, что концентрация бактериальной суспензии влияла на значение порогового цикла Ct. С уменьшением концентрации, увеличивалось значение порогового цикла, что указывало на снижение содержавшейся ДНК в образце. Таким образом, чем ниже был предел обнаружения возбудителей, тем выше была чувствительность подобранного зонда.
В результате проведенных исследований были определены оптимальные условия для проведения ПЦР в режиме реального времени для видов X. oryzae и X.arboricola: выбран наиболее оптимальный температурный режим отжига специфичных зондов - 61С и 55С соответственно, и определены оптимальные концентрации праймеров и зондов, подобранных к гену gyr B, которые составили 7,5 и 5 пмоль для X.oryzae и 20 и 5 пМ для X.arboricola на реакцию. Применение таких условий при постановке ПЦР «в реальном времени» делают метод более чувствительным и специфичным для выявления X. oryzae и X.arboricola. Была также показана высокая специфичность разработанных методов, при которых только в положительных образцах наблюдалась детекция по соответствующему красителю. Чувствительность ПЦР в реальном времени составила не менее 5,2х100 клеток/мл для идентификации X. oryzae и 4,3х101 клеток/мл для X.arboricola.
Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа
В отличие от прямой ПЦР, в БИО-ПЦР анализируемый образец высевают на питательную среду и инкубируют, при температуре оптимальной для роста целевой бактерии (рис. 4.4.1). При этом повышается чувствительность диагностики, во-первых, за счет снижения ингибирующего действия веществ растительного экстракта на процесс амплификации, во-вторых, за счет селективного размножения целевой бактерии. Кроме того, за счет селективности питательной среды подавляется развитие сапротрофной микробиоты.
В работе использовали партию семян риса сорта Дарий 23, которая была получена из Приморского края, урожай 2011 года, свободный от бактерий рода Xanthomonas. Семена искусственно заражали типовым штаммом X. oryzae pv. oryzae NCCPB 3002Т в условиях вакуума.
Сравнение чувствительности прямого и БИО-ПЦР анализа проводили путем внесения известного числа клеток возбудителя в семенной экстракт с последующей постановкой ПЦР. Готовили суспензию клеток Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Определение концентрации бактериальной суспензии проводили методом серийных разведений. Подсчет колоний проводили через сутки и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл). Далее проводили экстракцию бактерий по оптимизированной методике (глава IV). Из каждого разведения бактериальной суспензии вносили по 100 мкл к 1 мл семенного экстракта. Таким образом, формировали различные варианты семенных экстрактов с известным количеством клеток возбудителя. На первоначальном этапе была выбрана оптимальная среда, для роста и размножения целевой бактерии. Из 5 предложенных сред (описаны в главе II) была выбрана среда YPGA, рост бактерий был обнаружен через 17 часов. На средах YDC и КАА примерно через 48 часов, на средах КАА модифиц и XAS на 4 сутки, поэтому для дальнейшей работы была предложена среда YPGA.
Далее подбирали антибиотики разных групп в различных концентрациях для использования их в качестве селектирующего фактора для разработки BIO-PCR.
Семенной экстракт высевали на чашки со средой YPGA с антибиотиками разных групп и наблюдали за ростом целевой бактерии, а также сапротрофной микробиоты. Только в варианте с использованием комбинации антибиотиков: циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л был виден рост целевой бактерии через сутки. Гентамицин в концентрации больше 2 мг/л подавляет рост всей микрофлоры. На среде с использованием циклогексимида 25 мг/л + цефазолина 15 мг/л также наблюдали рост целевой бактерий, но загрязненной сапротрофной микробиотой, что приводило к снижению чувствительности диагностики. Поэтому, на основе полученных данных, была предложена среда YPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л (рис.4.4.2).