Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Современные представления о нарушении микробиоценоза кишечника у новорожденных детей 12
1.2 Роль факторов иммунной защиты в развитии дисбиоза кишечника в неонатальном периоде 16
1.3 Функции протеолитических ферментов в регуляции кишечной микробиоты 21
Глава 2. Материал и методы исследования 24
Глава 3. Характеристика микробных IG-протеаз (тиоловых, металлзависимых, сериновых) копрофильтратов и их значение в оценке состояния микробиоценоза кишечника у новорожденных детей контрольной группы 28
Глава 4. Оценка состояния микробиоценоза по спектру активности Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией 35
4.1. Особенности протеазной активности копрофильтратов у недоношенных новорожденных детей с бактериальной пневмонией, осложненной дисфункцией кишечника (синдром срыгивания и рвоты) 36
4.2 Состояние функциональной активности протеаз копрофильтратов у детей с бактериальной пневмонией, осложненной парезом кишечника 46
4.3. Показатели активности Ig-протеаз копрофильтратов и микробиоценоза кишечника у недоношенных новорожденных с бактериальной пневмонией, осложненной некротизирующим энтероколитом (НЭК) 52
4.4. Состояние активности микробных Ig-протеаз у новорожденных с пневмонией, находившихся на энтеральном зондовом и парентеральном питании 60
Глава 5. Взаимосвязь оценки состояния микробиоценоза кишечника бактериологическим методом и по показателям активности Ig-протеаз копрофильтратов у наблюдавшихся пациентов 65
Обсуждение полученных результатов 68
Выводы 77
Практические рекомендации 79
Библиография 80
- Роль факторов иммунной защиты в развитии дисбиоза кишечника в неонатальном периоде
- Характеристика микробных IG-протеаз (тиоловых, металлзависимых, сериновых) копрофильтратов и их значение в оценке состояния микробиоценоза кишечника у новорожденных детей контрольной группы
- Состояние функциональной активности протеаз копрофильтратов у детей с бактериальной пневмонией, осложненной парезом кишечника
- Взаимосвязь оценки состояния микробиоценоза кишечника бактериологическим методом и по показателям активности Ig-протеаз копрофильтратов у наблюдавшихся пациентов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблемы, связанные с ухудшением здоровья новорожденных детей обусловливают высокие показатели заболеваемости и формирование хронических форм патологии с раннего возраста (28). Заслуживают особого внимания неонатальные инфекции, являющиеся причиной высокой смертности новорожденных, особенно, недоношенных детей (85). У преждевременно родившихся детей высок риск первичной патологической колонизации кишечника, а присоединяющаяся неонатальная инфекция способствует нарушению микробиоценоза кишечника и развитию дисбиотических состояний, которые качественно влияют на характер клинического течения и исход болезни (116,120).
Известно, что новорожденные, находящиеся в условиях реанимационного отделения, имеют серьезные нарушения микробиоценоза кишечника. В общеклинической практике при нарушениях биоценоза кишечника используется рутинное бактериологическое исследование кала, что в современных условиях в полной мере не удовлетворяет практического врача: слишком много времени уходит от момента забора кала до получения результата, нет характеристики условно-патогенной микрофлоры, не указывается, в какой степени снижено содержание микрофлоры (111).
Особый интерес представляют инфекционно-воспалительные заболевания периода новорожденности и их влияние на здоровье детей. Они отличаются своеобразием течения, что приводит к возникновению серьезных проблем, связанных со своевременной диагностикой, лечением и прогнозом этой патологии. У преждевременно родившихся детей повышается риск первичной патологической колонизации кишечника, а присоединение неонатальной инфекции способствует развитию дисбиотических состояний, которые качественно влияют на характер клинического тече- ния болезни (49, 70). Особого внимания заслуживает развитие дисбиоти-ческих состояний у недоношенных с низкой массой тела, так как при этом имеется высокий риск развития некротизирующего энтероколита с серьезными последствиями. Последнее представляет значительный интерес для практической работы в неонатологии в плане превентивных мероприятий потому, что имеются предложения рассматривать определенные нарушения микробиоценоза кишечника у недоношенных новорожденных как начальную фазу развития некротизирующего энтероколита (1, 49, 86).
В настоящее время идентифицирован ряд факторов кишечной микрофлоры, которые непосредственно обеспечивают персистенцию и колонизацию симбионтной и условно-патогенной микофлоры. К этим факторам относятся различного рода ферменты, которые формируют устойчивость некоторых представителей кишечной микрофлоры к действию секреторных антител. Накоплены данные о том, что ферменты, способные расщеплять секреторные иммуноглобуллины слизистых оболочек, способствуют колонизации эпителия условно-патогенными бактериями (97).
В ходе экспериментальных и клинических исследований рядом авторов (155) были разработаны методы определения нарушения микробиоценоза кишечника по спектру активности специфических ферментов — Ig-протеаз — микробных факторов патогенносте, которые представлены следующими основными классами: сериновые, металлзависимые, тиоловые (148). При комплексном воздействии ферментов патогенности, выделяемых протеаз-положительными микроорганизмами кишечника, создаются условия для возникновения и поддержания воспалительного процесса и развития эндогенной инфекции (102, 103).
В последние годы особое внимание исследователей привлекают ферменты, обладающие функцией Ig-протеаз, которые способны деградировать секреторные и плазменные иммуноглобулины, компоненты комплемента, белки межклеточного матрикса, воздействующие на эндотелий
7 сосудов, активирующие компоненты свертывающей системы крови и фибринолиза. По-видимому, Ig-протеазы способны запускать и поддерживать воспалительные реакции в слизистой кишечника, снижать уровень специфической и неспецифической резистентности слизистых, приводя, в конечном итоге, к снижению колонизационной резистентности кишечника. Многие из изученных Ig-протеаз, входящие в состав «экзотоксиновых комплексов», продуцируются только штаммами микроорганизмов, способными вызвать развитие инфекционного процесса. При комплексном воздействии факторов патогенности, выделяемых протеазоположитель-ными микроорганизмами кишечника, создаются условия для возникновения и поддержания воспалительного процесса и развития эндогенной инфекции (126).
Состояние микрофлоры кишечника (микробиоты) — это один из важнейших показателей физиологического гомеостаза организма, и исследование его раскрывает новые механизмы формирования иммунитета и факторов неспецифической защиты у ребенка раннего возраста (49,158, 159).
В доступной литературе не найдено работ, касающихся определения состояния микробиоценоза кишечника биохимическим методом у новорожденных в сравнении с рутинным бактериологическим, как не обнаружено сведений об исследовании протеаз — факторов микробной патогенности у недоношенных новорожденных, больных неонатальной бактериальной инфекцией.
Цель и задачи исследования.
Оценить состояние микробиоценоза кишечника по спектру протео-литических ферментов копрофильтратов у недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией для оптимизации тактики лечения.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Изучить состояние активности Ig-протеаз (общих, сериновых, ме-таллзависимых, тиоловых) микрофлоры копрофильтратов у недоношенных новорожденных без признаков бактериальной инфекции и сопоставить их параметры с микробиологическими результатами оценки биоценоза кишечника.
Выявить изменения микробиоценоза кишечника по активности Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией - пневмонией, протекавшей: а) с синдромом срыгивания и рвоты, б) с явлениями пареза кишечника, в) осложненной некротизирую-щим энтероколитом (НЭК), а также на фоне энтерального зондового и парентерального питания пациентов.
Определить пороговые значения уровней активности микробных Ig-протеаз копрофильтратов для прогноза осложнений и оптимизации лечебной тактики больных новорожденных недоношенных с бактериальной инфекцией.
Оценить взаимосвязь изменений биоценоза кишечника по бактериологическому и Ig-протеазному методам у наблюдавшихся пациентов.
Научная новизна.
Научная новизна полученных результатов состоит в следующем: получены новые данные о состоянии микробиоценоза кишечника по Ig-протеазной активности сериновых, металлзависимых и тиоловых ферментов копрофильтратов у недоношенных новорожденных, которые коррелируют с бактериологическими результатами исследования биоценоза кишечника; выявлены различия уровней активности микробных Ig-протеаз копрофильтратов в зависимости от вариантов осложненного течения пневмонии (парез кишечника, некротизирующий энтероколит) и типа питания больных новорожденных недоношенных детей; определены пороговые значения уровней активности спектра Ig-протеаз ко-
9 профильтратов для прогноза осложнений и оптимизации интенсивной терапии недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией. Научно-практическая значимость работы.
Результаты проведённого исследования позволяют углубить современные представления о нарушениях микробиоценоза кишечника (микро-биоты) у недоношенных с неонатальной бактериальной инфекцией.
В клиническую неонатальную практику может быть рекомендован новый, иммуноферментный, специфический и неинвазивный метод диагностики дисбиоза кишечника - скрининговое определение активности Ig-расщепляющих протеаз (сериновых, металлзависимых и тиоловых классов) копрофильтратов.
Данный метод позволяет проводить оценку нарушений микробиоценоза кишечника и его осложнений, оптимизировать интенсивную терапию недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией (пневмония, некротизирующий энтероколит).
Внедрение результатов исследования.
Основные результаты исследования внедрены в практическую деятельность детской клинической больницы №1 г. Казани, а также используются в учебном процессе кафедр педиатрии и неонатологии Казанской Государственной медицинской академии.
Материалы работы отражены в учебном пособии для врачей «Диагностика нарушений микробиоценоза кишечника по спектру протео-литических ферментов копрофильтратов у недоношенных новорожденных», Казань, 2009.
Апробация работы.
Положения работы доложены и обсуждены на региональной научно-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском регионе» (Казань, 2005, 2008, 2009), научно-практической конференции молодых ученых ГОУ ДПО КГМА (Казань, 2005), в материалах
10 ХиХІиХШ Конгресса педиатров России (Москва, 2006, 2007, 2009), конференции по неотложной педиатрии (Санкт-Петербург, 2006), в материалах Конгресса Europaediatrics (Барселона, 2005), на совместном заседании кафедр педиатрии и перинатологии, акушерства и гинекологии Казанской государственной медицинской академии и сотрудников МУЗ «Детская больница №1 г. Казани» (Казань, 2005, 2006), на совместном заседании кафедр педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, педиатрии и неонатолгии ГОУ ДПО КГМА, ЦНИЛ ГОУ ДПО КГМА, кафедр пропедевтики детских болезней, факультетской педиатрии и детских болезней лечебного факультета, госпитальной педиатрии с курсами ПДО и поликлинической педиатрии, детских инфекций ГОУ ВПО КГМУ ( Казань, 2007,2010).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Положения, выносимые на защиту.
Определение активности Ig-протеаз (сериновых, металлзависи-мых и тиоловых) копрофильтратов у недоношенных новорожденных может рассматриваться как объективный показатель микроэкологических изменений в нижнем отделе кишечника.
Активность микробных Ig-протеаз копрофильтратов отличается при различных вариантах течения, и осложнения неонатальной бактериальной инфекции (пневмония, некротизирующий энтероколит) зависит от типа питания недоношенных новорожденных (зондовое энтеральное и парентеральное), что коррелирует с клиническими проявлениями нарушения микробиоценоза и его бактериологической оценкой.
3. Пороговые уровни активности микробных протеаз копрофильтра тов, полученные на пике II стадии НЭК могут служить для оценки прогно за течения заболевания и оптимизации тактики лечения больных но ворожденных детей с бактериальной инфекцией.
Роль факторов иммунной защиты в развитии дисбиоза кишечника в неонатальном периоде
С инициированием бактериальной колонизации изменения в иммунной системе происходят с расширением дифференцирования определенных клеточных элементов иммунной системы слизистой оболочки (42,90,105,181). Последствия этого раннего послеродового программирования сохраняются всю жизнь и значительно влияют на здоровье человека (83,141,190). Важно, что микробиоты отличаются по их способности потенцировать развитие лимфатических элементов кишечника и поддержание этих функций (98,210). Молекулярное основание для этого функционального различия в настоящее время неизвестно, «гигиеническая гипотеза », учитывающая подверженность связывания бактериальных агентов кишечника и повышающейся сферой действия человеческих аллергенов и аутоиммунных патогенов, подтверждает эту точку зрения (10,84,112). Таким образом, постулируется, что функционально значимые бактерии нормальной микрофлоры поддерживают гомеостаз и симбиони-руют в кишечнике, обозначая связь, существующую между этими бактериями и кишечником ребенка, что может применяться в диагностике болезней, например, болезней кишечника, при которых идет иммунный ответ на компоненты нормальной флоры (59,58, 69,100).
Выявление функциональной роли бактериальных генов, вовлеченных в метаболизм, были результатом исследований: идентификация генов в бактериях, свободно моделирующихся, обеспечивает значительный эффект (72,85,171). Гипотетически, например, иммуномодулирующий эффект бифидобактерий мог бы реализовать ингибитор протеазы серина эукариотического типа (сергин), найденный в его последовательности генома (36,88,132). Альтернативно, деятельность муциназы и полисахаридов, обогащенных фукозой, и гликопротеины бактероидов могли бы разрешить тесный контакт между жизнеспособными бактериями и принять агентов в эпителиальных клетках, и могли быть важны для иммуносу-прессивных эффектов этой бактерии (12,24,62,96,113,208). Выражение определенных поверхностных структур типа «фактора удлинения Турция» в лактобациллах и флагеллина в сальмонеллах могло быть важным для контактирования, облегчая процессы активации и модулирования (191). В достаточном количестве аутоиндукторы, которые являются молекулами коммуникации, выпущенными бактериями в высоких концентрациях, могли бы также колонизировать и систему сигнализации организма (84,99,192,211). Недавно были открыты гормоны кишечника, которые подражают сигнальным молекулам А1, усложняющие основные моменты этой перекрестной связи (71,92,201).
Например, долго устанавливалась защитная роль секреторного Ig А, который продвигает бактериальное формирование в пределах нормальной флоры кишечника, но так же и ограничивает расширение и перемещение нежелательных патогенных колоний (52,98). Функционирующие совместно с Ig А структурно разнообразные эпителиальные антибактериальные пептиды нейтрализуют патогенные микроорганизмы (34,166). Клетки Панета ограничивают основу кишечных крипт, где находятся антибактериальные пептиды, производящие кристдин или его а-форму (13,161). Отличительное распределение этих клеток по кишечнику или их отсутствие может быть ближайшим или отдаленным от центра градиентом бактериального разнообразия и плотности. Относительно функции Панет-клетки: бактероид, распространенная бактерия в кишечнике человека, приводит к накоплению в клетке ангиогена. Ангиогены представляют новый класс антибактериальных пептидов, которые выборочно уничтожают патогенные микроорганизмы, в том числе и бактероид, защищая кишечные крипты (127,139). Механизм сигналов бактероида к клеткам Панета, обладающих антибактериальным свойством пептидов, является неизвестным. Недавние работы показали, что крипты клеток Панета мо гут быть заполнены бактериальным мурамилдипептидом (MDP) через закрепленный активацией нуклеотид олигомерной области (NOD2) (66,71,173).
В последние годы особое внимание исследователей привлекают ферменты, обладающие функцией Ig-протеаз, которые способны деградировать секреторные и плазменные иммуноглобулины, компоненты комплемента, белки межклеточного матрикса, воздействующие на эндотелий сосудов, активирующие компоненты свертывающей системы крови и фибринолиза (28,57,187). По-видимому, Ig-протеазы способны запускать и поддерживать воспалительные реакции в слизистой кишечника, снижать уровень специфической и неспецифической резистентности слизистых, приводя, в конечном итоге, к снижению колонизационной резистентности кишечника (89,124,197). Многие из изученных Ig-протеаз, входящие в состав «экзотоксиновых комплексов», продуцируются только протеазопо-ложительными штаммами микроорганизмов, способными вызвать развитие инфекционного процесса (87,148,202). При комплексном воздействии ферментов патогенности, выделяемых протеазоположительными микроорганизмами кишечника, создаются условия для возникновения и поддержания воспалительного процесса и развития эндогенной инфекции (4,5,7,76).
При гистологическом исследовании установлено, что ранее всего признаки некротических изменений в ишемизированной стенке кишки возникают на верхушках ворсинок слизистой оболочки (17,40). По мере прогрессирования ишемических изменений в кишке энтероциты, выстилающие дистальные отделы ворсинок, как бы отходят от подлежащих отделов собственной пластинки (lamina propria) из-за увеличивающегося отека тканей (43,165). Затем энтероциты слущиваются (отторгаются) в просвет кишки, в результате чего подлежащие ткани подвергаются воздействию кишечного содержимого, при этом, за счет нарушения эпители 19 альной целостности, происходит всасывание токсического содержимого из просвета кишки и потеря жизненно важных тканевых элементов в просвет кишки (77,180). В просвете кишки содержится достаточно много вредных (токсичных) веществ, которые вследствие нарушения эпителиальной целостности легко проникают в кровь (73,160). К таким веществам относятся различные патогенные бактерии и их экзо - и эндотоксины; пищеварительные ферменты (протеазы и липазы), продукты некроза и разрушения тканей, образующиеся при отторжении эпителиальных клеток лизосомальные катепсины, гидролазы и электролиты (146). Транслокация бактерий и других токсичных веществ, содержащихся в просвете кишки, в слизистую оболочку и в кровь приводит к прогрессированию некротических изменений в стенке кишки и развитию септического шока (114).
Характеристика микробных IG-протеаз (тиоловых, металлзависимых, сериновых) копрофильтратов и их значение в оценке состояния микробиоценоза кишечника у новорожденных детей контрольной группы
В контрольную группу вошло 30 новорожденных с гестационным возрастом от 28 до 33 недель - 31,2 ±1,5 нед. Вес детей варьировал от 1950 г. до 2 360 г. Дети поступали из родильных домов на 6-7 сутки жизни в отделение патологии новорожденных. Это были дети с соматической патологией — коньюгационной желтухой без токсических проявлений, патологией ЦНС без органических отклонений, нарушений периода адаптации - т. е. без клинических и микробиологических данных бактериальной инфекции.
Все недоношенные новорожденные контрольной группы поступали из родильных домов на 5-6 сутки жизни и находились в отделении патологии новорожденных. Состояние всех детей контрольной группы оценивалось как среднетяжелое.
Дети из группы сравнения получали комплексную терапию по поводу выявленной патологии и по окончании курса лечения они были выписаны из профильного отделения под наблюдение участкового педиатра в удовлетворительном состоянии.
Данные полного (клинико-лабораторного) обследования недоношенных новорожденных контрольной группы проводились при поступлении детей в стационар; результаты и выявленные изменения представлены в таблице 2.
Всем новорожденным в данной группе наблюдения проводилось исследование ферментного спектра микробной флоры кишечника. Забор фекалий проводился по мере поступления детей в отделение патологии новорожденных и при выписке, и совпадал по времени с микробиологическим (бактериологическим) исследованием кала.
Бактериологически были выделены следующие микроорганизмы: бифидобактерии в 16 случаях (53,4 %), лактобактерий в 18 (69,2%), кишечная палочка у 14 новорожденных (48,2%) , энтерококки у 1 больного (3,3%), протей у 4 (13,1 %) детей.
Количественный состав кишечной микрофлоры выглядел следующим образом: среднее содержание лактобактерий в фекалиях составляло 10x107 КОЕ/г; бифидобактерии в среднем выделялись в количестве 100x107 КОЕ/г; E.coli в среднем 20х107КОЕ/г; энтерококки в среднем 1,5х107КОЕ/г; содержание протея в фекалиях составило 0,5x106КОЕ/г (рисунок 1).
Ниже, в соответствующей главе (5), будут представлены результаты корреляционного анализа между бактериологическими показателями фекалий и параметрами Ig-протеазной активности копрофильтратов у детей контрольной группы. Результаты обследования детей контрольной группы по данным исследования ферментного спектра микробной флоры представлены в таблице 3, рисунках 2 и 3.
Полученные данные характеризуют средний уровень активности Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных без клинико-лабораторных проявлений бактериальной инфекции: у всех 30 детей группы сравнения выявлена определенная активность сериновых, металлзави-симых и тиоловых Ig-протеаз, которая не претерпела изменений с момента поступления до выписки из отделения, кроме снижения уровня активности тиоловых протеаз.
Ниже будут приведены данные корреляционного анализа между показателями кишечной микрофлоры анализа фекалий на дисбиоз и показателями Ig-протеазной активности.
Наряду с определением средних показателей активности Ig-протеаз, был проведен анализ диапазона колебаний протеазной активности по изучаемым классам у недоношенных новорожденных контрольной группы. Проанализированные данные представлены на рисунке 3. Для наглядности диапазон колебаний отражен отдельно для каждого класса протеаз, т.е. представлен диапазон значений от минимального до максимального, что дополняет картину изменения микробиоценоза по микробному ферментному спектру копрофильтратов.
Как свидетельствуют данные проведенных исследований, у детей контрольной группы активность Ig-протеаз копрофильтратов незначительно менялась в диапазоне значений тиоловых и металлзависимых классов в сторону уменьшения, а в классе сериновых ферментов оставалась постоянной.
Таким образом, у новорожденных 4-5 дней жизни при клиническом и бактериальном отсутствии нарушений микробиоценоза и проявлений неонатальной инфекции отмечается риск первичной патологической колонизации кишечника с выявленной активностью ферментов микрофлоры копрофильтратов, ответственных за патогенность и воспаление.
Состояние функциональной активности протеаз копрофильтратов у детей с бактериальной пневмонией, осложненной парезом кишечника
Группу детей с пневмонией тяжелой степени, с клиникой пареза кишечника составили 24 ребенка с гестационным возрастом 30,2±1,4 недель.
В раннем неонатальном анамнезе у всех пациентов наблюдалась отягощенность асфиксией, мекониальной аспирацией, ранним развитием респираторных нарушений — один или несколько отягощающих факторов у каждого больного. Сразу после рождения все новорожденные находились в палате интенсивной терапии.
Дети поступали в отделение реанимации новорожденных из родильных домов в возрасте 4-5 дней жизни.
У детей наблюдались самые разнообразные клинические проявления: синдром интоксикации - у 33% детей, нарушения гемодинамики - у 26%, синдром полиорганной недостаточности — у 9%, вздутие живота, болезненность при пальпации, изменения характера стула - у 65%, гепа-томегалия - у 15 %. У всех пациентов бактериологически был констатирован дисбактериоз кишечника декомпенсированная форма, стадия микробной агрессии.
Все дети находились на ИВЛ с момента рождения, получали комплексную интенсивную терапию; 15 детей из 24 (62,5%) находились на парентеральном питании.
Для подтверждения бактериального генеза имеющихся у недоношенных новорожденных данной группы инфекционных процессов, в частности, пневмонии, на фоне которой развились проявления пареза кишечника, проводился дополнительный тест на прокальцитонин, который является одним из маркеров бактериального инфицирования. Результаты теста в числе данных лабораторно-клинического исследования недоношенных новорожденных представлены в таблице 6.
Результаты исследования активности Ig-протеаз копрофильтратов больным проводилось трижды — при поступлении, через 7 дней после поступления и через 14 дней, что соответствовало периоду клинического улучшения. Эти данные отражены в нижеследующей таблице 7.
Как видно из таблицы, при поступлении больных в стационар достоверно высокая микробная активность Ig-протеаз копрофильтратов наблюдалась только в классе тиоловых ферментов (р 0,05). К моменту стабилизации она сохранялась достоверно высокой. В то же время при поступлении детей наблюдалось значительное снижение активности серино-вых и металлзависимых протеаз (р 0,05), уровень которых по мере лечения нарастал, не достигая данных контрольной группы.
Данные приведенных исследований отражают зависимость значений активности Ig-протеаз копрофильтратов от тяжести сопутствующего син дрома на фоне пневмонии у недоношенных новорожденных. У больных с парезом кишечника при поступлении отсутствовал ожидаемый адекватный ответ ферментного спектра сериновых и металлзависимых микробных Ig-протеаз, ответственных за состояние инвазии грамотрицательной и грамположительной флоры при сохраняющемся факторе воспаления, маркером чего является компенсаторное повышение активности тиоловых протеаз, ответственных за реализацию воспаления.
Особое внимание привлекает значительное нарастание активности сериновых Ig-протеаз (факторов патогенности) копрофильтоатов у больных детей по мере лечения, что предполагает преобладание грамотрицательной флоры как одной из причин развития нарушения микробиоценоза более тяжелой степени в виде, проявлений пареза кишечника и его возможных осложнений некротизирующим энтероколитом. Эти данные подтверждаются в последующем исследовании: наличием грамотрицательной микрофлоры у наблюдаемых пациентов при бактериологическом исследовании кала и данными ферментного спектра микрофлоры копрофильтра-тов у больных новорожденных с клиникой НЭК на фоне пневмонии.
У детей с парезом кишечника, переведенных на парентеральное питание по клиническим показаниям, констатированы следующие изменения ферментного спектра протеаз: статистически значимо низкий уровень активности металлзависимых протеаз и высокий уровень активности сериновых протеаз, что предполагает наличие выраженных нарушений микробиоценоза кишечника и связано с более тяжелым состоянием детей.
Помимо определения средних показателей активности Ig-протеаз, был проведен динамический анализ протеазной активности по классам протеаз у недоношенных новорожденных с проявлениями пареза кишечника. Проанализированные данные представлены на рисунке 8. Для наглядности динамические показатели отражены отдельно для каждого класса протеаз, представлен диапазон значений от минимального до максимального, что дополняет картину изменения протеазной активности.
Взаимосвязь оценки состояния микробиоценоза кишечника бактериологическим методом и по показателям активности Ig-протеаз копрофильтратов у наблюдавшихся пациентов
Для выявления взаимосвязи оценки состояния микробиоценоза кишечника и результатам уровней активности общих Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных был проведен корреляционный анализ между этими показателями. Сводные данные корреляционного анализа представлены в таблице 11.
Сравнение полученных данных с результатами бактериологического обследования детей группы контроля на вероятность дисбиоза кишечника по результатам корреляционного анализа показало следующее: а) отсутствует линейная связь между количеством активности общих Ig-протеаз и количественными значениями наличия энтерококков (г=0); б) существует прямая связь между уровнем активности общих Ig-протеаз и количественными значениями E.coli ( г =0,36, р 0,05) и Proteus vulgaris (r=0,36, р 0,05); в) имеется обратная связь между уровнем активности общих Ig-протеаз и количественными значениями как бифидобактерий (г = -0,35, р 0.05), так и лактобактерий (г = -0,36, р 0,05).
Различия уровеней иммуноглобулин-расщепляющей активности копрофильтратов недоношенных новорожденных с нарушениями микробиоценоза, по сравнению с условной нормой, косвенно отражает качественные различия в составе микрофлоры при этом состоянии и может служить интегральным показателем дисбиотических состояний.
Полученные в исследовании данные характеризуют средний уровень активности Ig-протеаз копрофильтратов у условно здоровых новорожденных. У всех 30 новорожденных контрольной группы выявлена активность сериновых, металлзависимых и тиоловых Ig-протеаз. Надо отметить, что активность Ig-протеаз у условно здоровых детей сильно не менялась от момента поступления до выписки из отделения, кроме достоверного изменения величины активности тиоловых протеаз в сторону уменьшения (р 0,05).
Исходя их полученных результатов, условная норма активности Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных детей (мкг/ч) будет следующей: общая протеазная активность: 1,35 — 3,95, сериновая протеазная активность: 0,44 — 3,84, металлзависимая протеазная активность: 0 - 0,34, тиоловая протеазная активность: 0,08 — 0,56 .
Как видно, изменение состава полостной микрофлоры толстого кишечника у обследованных нами детей сопровождается изменением общей микробной Ig-протеолитической активности копрофильтратов, в основном, за счет сериновых ферментов — факторов патогенности грамотри-цательной микробной флоры, что является интегральным показателем изменения кишечной микробиоты у новорожденных детей; изменения уровней активности других классов протеазных ферментов копрофильтратов (металлзависимых и тиоловых), превышающих диапазон колебаний, приведенной выше условной нормы, дополняют оценку состояния нарушений микробиоценоза у детей неонатального периода.
Проблемы, связанные с ухудшением здоровья новорожденных детей обуславливают высокие показатели заболеваемости и формирование хронических форм патологии с раннего возраста (5,10,39). В этом плане особо важны инфекционно-воспалительные заболевания периода новорожденное и их влияние, в дальнейшем, на здоровье детей. У преждевременно родившихся детей высок риск первичной патологической колонизации кишечника, а присоединившаяся неонатальная инфекция способствует нарушению микробиоценоза кишечника и развитию дисбиотических состояний, которые качественно влияют на характер клинического течения болезни. Особого внимания заслуживает нарушение колонизационной резистентности у недоношенных с низкой массой тела, так как при этом имеется высокий риск развития некротизирующего энтероколита. Последнее обстоятельство представляет значительный интерес для практикующего неонатолога в плане превентивных мероприятий (33, 63). С этих позиций следует считать актуальной разработку новых скрининговых систем, обеспечивающих объективную информацию о резервах внутренней защиты и определяющих прогноз и исход заболевания. Цель исследования. Оценить состояние микробиоценоза кишечника по спектру про-теолитических ферментов копрофильтратов у недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией для оптимизации тактики лечения. Решались следующие задачи: 1. Изучить состояние Ig-протеазной активности копрофильтратов (общих, сериновых, металлзависимых и тиоловых) у недоношенных новорожденных без бактериальной инфекции и сопоставить их параметры с микробиологическими данными биоценоза кишечника. 2. Выявить изменения микробиоценоза кишечника по активности Ig-протеаз копрофильтратов у недоношенных новорожденных с бактериальной инфекцией - пневмонией, протекавшей: а) с синдромом срыгивания и рвоты, б) с явлениями пареза кишечника, в) осложненной некротизирую-щим энтероколитом (НЭК), а таюке на фоне энтерального зондового и парентерального питания пациентов. 3. Определить пороговые значения уровней активности микробных Ig-протеаз копрофильтратов для прогноза осложнений и оптимизации лечебной тактики больных новорожденных недоношенных с бактериальной инфекцией. 4. Оценить взаимосвязь изменений биоценоза кишечника по бактериологическому и Ig-протеазному методам у наблюдавшихся пациентов. Работа проводилась в течение 2004-2007гг. на базе отделений реанимации новорожденных и патологии новорожденных МУЗ «Детская больница №1 г. Казани» (глав, врач - К.З. Закиров) и в лаборатории иммунохимии КНИИЭМ. Для решения поставленных задач исследовалась группа недоношенных новорожденных - 100 детей, в том числе группа сравнения (условно здоровые новорожденные) составила 30 человек. Гестационный возраст детей к моменту рождения составил 30,6 ± 2,4 недель. Обследование проводилось по мере поступления детей в отделение реанимации новорожденных в течение всего периода новорожденности.
