Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Актуальные вопросы и современные подходы к проблеме пищевой аллергии (ПА) у детей (обзор литературы) 11
1.1. Современные представления о распространенности, факторах риска развития пищевой аллергии 11
1.2. Иммунологические механизмы развития и особенности формирования пищевой аллергии у детей 21
1.3. Клиника и диагностика пищевой аллергии и атопического дерматита у детей 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объект и объем исследования 40
2.2. Клиническое обследование больных 43
2.3. Аллергологические и иммунологические методы исследования 48
2.4. Статистическая обработка полученных данных 52
Глава 3. Состояние здоровья беременных женщин с отягощенным и неотягощенным аллергологическим анамнезом 54
3.1. Характеристика здоровья, особенности течения беременности и родов наблюдаемых женщин 54
3.2. Оценка рацион питания наблюдаемых беременных женщин 60
3.3. Аллергологический анамнез матерей детей с пищевой аллергией и атопическим дерматитом 64
Глава 4. Состояние здоровья и клинико - иммунологическая характеристика детей обследуемых групп 69
4.1. Клинико-анамнестическая характеристика детей обследуемых групп 69
4.2. Иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных детей обследуемых групп 73
4.3. Клинические проявления пищевой аллергии у детей обследуемых групп 81
4.4. Результаты катамнестического наблюдения детей обследуемых групп 93
Глава 5. Прогнозирование риска развития атопического дерматита у детей с пищевой аллергии 100
Заключение 111
Выводы 126
Рекомендации практическому здравоохранению 127
Список сокращений 128
Список литературы
- Иммунологические механизмы развития и особенности формирования пищевой аллергии у детей
- Аллергологические и иммунологические методы исследования
- Аллергологический анамнез матерей детей с пищевой аллергией и атопическим дерматитом
- Иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных детей обследуемых групп
Введение к работе
Актуальность исследования. Частота аллергических заболеваний за
последнее десятилетие существенно возросла, особенно в экономически развитых
странах и в странах с неблагоприятной экологической ситуацией (Ревякина В.А.,
2010; Намазова-Баранова Л.С., 2011; Балаболкин И.И., 2012; Asher М.I. et al.,
2006;). Многочисленные исследования, выполненные в разных регионах мира и
охватывающие разные возрастные группы населения, позволили получить
сопоставимые сведения и однозначно подтвердить продолжающийся рост аллергической заболеваемости (Гущин И.С., 2006; Metsala J. et al., 2008; Tollenes M.C. et al., 2008; Holloway J.W. et al., 2010; Prescott S., 2011).
Пищевая аллергия (ПА) является одной из важнейших проблем клинической аллергологии. Доказано, что у детей раннего возраста имеет место высокая распространенность пищевой аллергии с многообразием клинических проявлений (Балаболкин И.И., 2010). По данным эпидемиологических исследований распространенность доказанной пищевой аллергии в развитых странах среди детей первого года жизни составляет 6-8%, среди детей подросткового возраста -2-4%, а среди взрослых - 1,5%; (Согласительный документ АДАИР; Bisgaard H., 2004; Chapman J.A. et al, 2006; Lack G., 2008).
Значение пищевой аллергии у детей первого года жизни определяется, прежде всего, тем, что сенсибилизация к пищевым аллергенам является стартовой для формирования атопического дерматита (АтД), рецидивирующей крапивницы, аллергических заболеваний дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта, системных аллергических реакций (Ногаллер A.M., 2005; Балаболкин И.И., 2006; Лусс Л.В., 2007; Новик Г.А., 2012; Arshad S., 2003). В 50-80% случаев пищевая аллергия является причиной анафилаксии у детей (Сергеев В.А., 2011; Есакова Н.В., Пампура Н.А., 2013; Cianferoni A., et al., 2001; Nagel G., Sampson H.A., 2007).
Особенностью пищевой аллергии является полиорганность на фоне полисенсибилизации, в связи с чем возникают трудности в диагностике и терапии пищевой аллергии прежде всего у детей первого года жизни, в том числе в неонатальный период. Остаются малоизученными факторы, способствующие формированию полисенсибилизации у детей первого года жизни. Недостаточно сведений об этиологически значимых аллергенах и их роли в исходе пищевой аллергии и формировании атопического дерматита. Отсутствуют критерии прогнозирования аллергодерматозов у детей первого года жизни.
Иммунологические механизмы развития ПА связаны с участием
преимущественно аллергических реакций I типа, реже IV типа (Пичугина
О.В.,2013). Доказано, что у больных с атопическим фенотипом преобладают Th2-клетки, продуцирующие ИЛ-4, который является одним из ключевых цитокинов в развитии аллергического воспаления, вызывающий гиперпродукцию IgE, а также способствующий дифференцировке CD4+ клеток в популяцию лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-5, который стимулирует пролиферацию и активацию эозинофилов - эффекторов аллергического воспаления. Наряду со стимуляцией IgE ответа ИЛ-4 и ИЛ-10 оказывают угнетающее воздействие на Th1хелперы (Хаитов Р.М., 2011; Amoudrus Р., 2006; Commins S., 2010). Антагонистом ИЛ-4
является ИФН-, который супрессирует продукцию IgE при аллергическом воспалении, что имеет важное значение в регуляции иммунного ответа при атопии (Зайцева С.В., 2013). Согласно современным данным, процесс становления атопии (дифференцировки неонатальной иммунной системы по Th2 типу) начинается еще до рождения ребенка вследствие ряда физиологических изменений, происходящих в организме беременной женщины (Ширшев С.В., 2002; Хаитов P.M.,2011). С одной стороны Th2-иммунный фон беременной женщины обеспечивает процесс вынашивания, с другой стороны, служит дополнительной предпосылкой для рождения женщинами – атопиками детей с аллергическими заболеваниями (Прямкова Ю.В., 2007; Ревякина В.А., 2010; Kramer M.S., 2006; Ozdemir C., 2008; Pali-Scholl I., 2009). Вместе с тем механизмы внутриутробной сенсибилизации плода, а также факторы, влияющие на ранние проявления атопии у детей, включая пищевую аллергию, продолжают активно изучаться с учетом их практической значимости.
С этих позиций, актуальным является определение вклада факторов риска развития атопии у новорожденных детей и изучение механизмов формирования и прогнозирования атопического дерматита у детей первого года жизни.
Цель исследования: определить клинико–иммунологические особенности, приоритетные факторы риска формирования пищевой аллергии у новорожденных и детей первого года жизни с оценкой информативности признаков формирования атопического дерматита у детей первого года жизни.
Задачи исследования:
-
Установить приоритетные антенатальные и постнатальные факторы риска, влияющие на формирование пищевой аллергии у новорожденных и детей первого года жизни.
-
Оценить состояние цитокинового статуса и гуморального звена иммунитета у новорожденных и детей первого года жизни с отягощенным аллергологическим анамнезом по исследованию содержания ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-, ИФН-, IgА, IgМ, IgG, общего IgE в сыворотке пуповинной, венозной крови и аллергенспецифических IgE в сыворотке венозной крови.
-
Установить клинико-иммунологические особенности течения пищевой аллергии с исходом в атопический дерматит у детей первого года жизни.
-
Определить информативные признаки для прогнозирования формирования атопического дерматита у новорожденных и детей первого года жизни с пищевой аллергией.
Научная новизна. Определены антенатальные и постнатальные факторы риска формирования пищевой аллергии у новорожденных детей с оценкой наиболее значимых для формирования атопического дерматита у детей первого года жизни (хроническая внутриутробная гипоксия плода, недоношенность, низкая оценка по шкале Апгар, гестоз, оперативное родоразрешение, отягощенный генеалогический анамнез по аллергопатологии, аллергический дерматит в период новорожденности, употребление беременной продуктов с
высоким сенсибилизирующим эффектом, курение матери, ранний перевод на искусственное вскармливание, поливалентная сенсибилизация).
Доказана диагностическая ценность исследования пуповинной крови для
оценки риска формирования атопического дерматита у детей первого года жизни
с пищевой аллергией. Установлено, что формированию пищевой аллергии с
исходом в атопический дерматит способствует выраженная недостаточность
продукции ИФН-, высокие значения соотношения ИЛ-4/ИФН-, высокий
уровень ИЛ-10, низкое содержание IgG, первоначально выявляемые в сыворотке
пуповинной крови. Впервые доказано, что изменения иммунологических
показателей сохранялись в динамике при исследовании венозной крови у детей
данной группы в течение первого года жизни. Катамнестическое исследование
показало, что выявленная направленность иммунологических изменений в
пуповинной крови сохранялась и в отношении параметров, определяемых в
периферической крови, что доказывает преобладание Th2- цитокинового
профиля Т-лимфоцитов и недостаточности Тh1-ответа с момента рождения с сохранением данной поляризации в постнатальном периоде.
Доказано, что у 6% обследуемых новорожденных с отягощенным
аллергоанамнезом в пуповинной крови определялся повышенный уровень общего
IgЕ. Подтверждена высокая диагностическая значимость определения содержания
общего IgЕ в пуповинной крови у новорожденных с отягощенным
аллергоанамнезом. Обнаружение общего IgЕ в сыворотке пуповинной крови в последующем сопровождалось более чем 10-кратным ростом уровня общего IgЕ в сыворотке венозной крови, что коррелировало с ранней манифестацией атопического дерматита у детей в возрасте 1-2 месяцев жизни.
Установлена высокая частота поливалентной сенсибилизации у детей с ПА в сочетании с атопическим дерматитом по сравнению с детьми, страдающими только ПА, сопровождающейся высоким титром аллергенспецифических IgE к белкам коровьего молока, куриного яйца, куриного мяса, говядины, пшеницы, овса, рыбе, домашней пыли, эпителию кошки, перу подушки, пыльце березы.
На основе расчета информативности признаков, включающих
анамнестические, клинико-лабораторные данные и иммунологические
показатели, оцениваемые в пуповинной и венозной крови, обоснованы критерии формирования атопического дерматита у новорожденных и детей первого года жизни с пищевой аллергией.
Практическая значимость. Использование анкетирования по выявлению групп детей с высоким риском развития атопического дерматита предусматривает проведение ряда ранних превентивных мероприятий.
Выявленные приоритетные антенатальные и постнатальные факторы риска
формирования аллергической патологии и наличие дисбаланса в системе Тh1/Th2-
лимфоцитов, оцениваемого первоначально по уровню цитокинов,
иммуноглобулинов в сыворотке пуповинной крови, далее - в венозной крови в
сочетании с анамнестическими данными, могут служить прогностическими
критериями развития аллергической патологии у детей уже в первом полугодии
жизни.
На основании полученных данных разработана прогностическая таблица, позволяющая выявить предрасположенных к развитию аллергопатологии новорожденных детей и рассчитать риск развития атопического дерматита.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты
диссертационного исследования внедрены в работу Областного детского центра аллергологии и клинической иммунологии, областного перинатального центра ГАУЗ «ООКБ №2»; ГАУЗ «ГКБ им. Н.И. Пирогова»; детских поликлиниках №8, №9 ММУЗ «МГКБ №6»; №6, №7, №10 ГБУЗ «ГКБ №5»; №1, №4 МАУЗ «ДГКБ» г. Оренбурга.
Теоретические положения и практические рекомендации включены в
лекционный курс и практические занятия для студентов, клинических
ординаторов, врачей аллергологов-иммунологов на кафедре детских болезней
ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Результаты комплексного исследования включены в материалы
информационно-методического письма «Прогнозирование пищевой аллергии и формирования атопического дерматита у детей первого года жизни», утвержденного Министерством здравоохранения Оренбургской области для врачей педиатров, аллергологов - иммунологов, врачей общей практики (Оренбург, 2014г.).
Личный вклад автора. Автором разработана анкета, с помощью которой осуществлялось анкетирование беременных женщин и рожениц, матерей наблюдаемых групп детей, проводилось клиническое обследование детей первого года жизни, включенных в исследование, сформирована база данных, осуществлялся забор и исследование ряда гуморальных показателей иммунитета в пуповинной крови, проведена статистическая обработка результатов и анализ клинических, функциональных и иммунологических показателей.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и
обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях:
Международной Европейской школе по педиатрии, гастроэнтерологии,
гепатологии и нутрициологии (ESPGHAN, Москва, 2011), X Российской
конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012), международной молодежной
научной школе «Иммунодиагностика и иммунотерапия хронических
заболеваний» (Оренбург,2012), VI съезде иммунологов России - Объединенный иммунологический форум (Н.-Новгород,2013), II Всероссийской конференции с международным участием студентов и молодых ученых в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА» (Оренбург,2013), заседаниях Оренбургского областного научно-практического общества аллергологов-иммунологов (Оренбург, 2011-14гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 4 из них - в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объм и структура работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 13 рисунками, 1
схемой. Библиографический указатель включает 243 источника, из которых 138 опубликованы в отечественной и 105 в зарубежной литературе.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа
выполнена в Государственном бюджетном учреждении высшего
профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации согласно плана НИР (№ государственной регистрации 01201156935)
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Приоритетными антенатальными факторами риска формирования
пищевой аллергии у детей являются: отягощенный генеалогический анамнез по
аллергопатологии, употребление беременной продуктов с высоким
сенсибилизирующим эффектом, хроническая внутриутробная гипоксия плода, угроза прерывания беременности, гестоз, оперативное родоразрешение, курение во время беременности. Наиболее значимыми постнатальными факторами риска формирования атопического дерматита у детей с пищевой аллергией являются, недоношенность, низкая оценка по шкале Апгар (6 ±1,1 балла), характер вскармливания, поливалентная сенсибилизация.
-
Особенностями клинико-аллергологических проявлений пищевой аллергии у новорожденных и детей первого года жизни являются: ранняя манифестация атопического дерматита с непрерывно-рецидивирующим течением, преобладание средне-тяжелых форм атопического дерматита, сочетанность с гепато- и панкреатопатиями, поливалентная сенсибилизация.
-
Высокий риск формирования атопического дерматита у новорожденных с пищевой аллергией ассоциирован с низким уровнем в пуповинной крови ИФН-, Ig G; низким содержанием ИФН-, высоким- ИЛ-10, высокими значениями соотношения ИЛ-4/ ИФН- в пуповинной и периферической крови. Обнаружение общего IgЕ в пуповинной крови имеет прогностическое значение для ранней манифестации атопического дерматита.
Иммунологические механизмы развития и особенности формирования пищевой аллергии у детей
Значение пищевой аллергии у детей первого года жизни определяется, прежде всего, тем, что сенсибилизация к пищевым аллергенам является стартовой для формирования атопического дерматита, рецидивирующей крапивницы, аллергических болезней дыхательных путей, системных аллергических реакций, аллергических реакций со стороны желудочно-кишечного тракта [12,45,61]. Доказано, что атопический дерматит является фактором риска развития респираторной аллергии [126,179,236]. По данным проспективных исследований, приблизительно у половины пациентов с атопическим дерматитом в последующем развивается бронхиальная астма (особенно при тяжелом течении атопического дерматита), у 2/3 — аллергический ринит [42,103,149].
В настоящее время опубликованы результаты двух когортных исследований распространенности ПА у детей раннего возраста. Так, проспективное наблюдение за детьми, родившимися в 2008–2009 гг., продемонстрировало наличие симптомов ПА у 14,2% обследованных в возрасте 3 мес, 9,1% — в 6 мес и 7,2% — в 12 мес. (Великобритания, n=969). При этом в возрасте 1 года по результатам плацебо-контролируемых провокационных проб ПА выявлена у 3,2%, а позитивные кожные прик-тесты к пищевым аллергенам (яйцо, арахис, молоко, рыба, кунжутное семя) имели 2,2% детей [233].
В другом исследовании комплекс диагностических мероприятий, включавший кожное аллерготестирование, плацебо-контролируемые провокационные тесты, оценку уровня специфического IgE, позволил выявить наличие ПА у 2,3% детей, достигших 3 лет (Дания, n=486). Наиболее частыми причинно-значимыми аллергенами для данной когорты были куриное яйцо, коровье молоко и арахис. В то же время гиперчувствительность к аллергенам рыбы, сои, фруктов и овощей, верифицированная кожными аллергопробами, в большинстве случаев не подтверждалась провокационными тестами [203,149]. F. Rance et al. (2008) отмечают, что у детей в возрасте до трех лет в качестве наиболее распространенных причинно-значимых аллергенов выступают антигены белков куриного яйца в 1,6-2,6% случаев, белков коровьего молока (БКМ) – 1,1-2,2%, орехи – 0,5-1,2%, рыба и морепродукты – 5,9% [161,166,186,213]. Анализируя распространенность аллергии к БКМ у детей, установлено, что в первые 3 года жизни она составляет 6%, при этом 60% детей первого года жизни с аллергией к БКМ имеют IgE-опосредованные реакции. К возрасту 5 лет у 80% этих детей наблюдается толерантность к молочному белку. Установлено, что кормление новорожденных молочной смесью в роддоме, перевод ребенка на смешанное или искусственное вскармливание смесями на основе коровьего молока способствуют возникновению аллергической реакции к БКМ у детей [12,23,160,185,232].
Существует несколько гипотез, объясняющих рост аллергологической патологии. Наиболее признанная в настоящее время «гигиеническая гипотеза» драматического роста распространенности атопических болезней за последние десятилетия в качестве причины преобладания Тh2-ответа называет снижение стимуляции Thl лимфоцитов естественными вирусными и микробными антигенами в самый ранний период жизни ребенка. Известен целый ряд эпидемиологически верифицированных факторов, ассоциированных с высоким риском формирования атопии у детей: положительный семейный анамнез по атопии, малый размер и высокий социальный статус семьи (Asthma Prevalence, Family Size, and Birth Order), курение в семье, проживание в городе, по сравнению с селом (Asthma and Atopy in Rural Children), отсутствие домашних животных (Cohort study of sibling effect, infectious), мужской пол (Blackwell Synergy - Pediatr Allergy Immunol, Volume 16; Kurzius-Spenser M., 2005), низкий вес при рождении, низкая частота респираторных инфекций на первом году жизни ребенка (Early Respiratory Infections, Asthma, and Allergy) и, возможно, во время беременности (Kurzius-Spenser М, 2005) [139,168].
Формирование пищевой сенсибилизации у детей раннего возраста зависит от множества факторов. К патогенетическим пренатальным факторам риска относят: наличие отягощенного анамнеза по атопии, юный возраст матери, гестозы беременных, кесарево сечение, аллергические заболевания у матери, высокий уровень IgE в сыворотке крови во время беременности, медикаментозную терапию беременной, перенесенные вирусные инфекции, воздействие профессиональных аллергенов, одностороннее углеводное питание женщины, употребление облигатных пищевых аллергенов и перегрузка пищевого рациона кормящих женщин молочными продуктами, а также курение [30,37,58,81].
К постнатальным факторам относят: дисбактериоз кишечника у матери и ребенка, сокращение сроков естественного вскармливания, природа и доза антигена, частота его введения, состояние иммунной системы на момент контакта с аллергеном (например, на фоне вирусной инфекции), не соблюдение гипоаллергенной диеты матерью во время кормления грудью и поступление аллергена с грудным молоком [99,206,223].
В исследованиях проведенных в Финляндии (2008), ученые показали, что наличие бронхиальной астмы у матери, молодой возраст, курение, предыдущие самопроизвольные аборты и высокое число предыдущих родов, также как кесарево сечение, низкий гестационный возраст и низкий весовой индекс были связаны с увеличенным риском развития аллергической патологии у детей, диагностированной до трехлетнего возраста [14,196,198].
Аллергологические и иммунологические методы исследования
Для проведения комплексной оценки гуморального и цитокинового статуса, собиралась пуповинная кровь новорожденных сразу после пересечения пуповины из дистального отрезка пупочной вены в момент рождения ребенка в количестве 5- 10 мл. в вакуумные пробирки фирмы IMPROVACUTER и доставлялась в лабораторию максимально через 2 часа после забора, также осуществлялся забор крови из кубитальной вены беременных женщин и детей первого года жизни в утренние часы, по истечении 6-часов после последнего кормления, кровь центрифугировалась при 2000 об./мин в течение 15 минут. После получения сыворотки, проба делилась на аликвоты замораживались и хранились при t - 40С до проведения процедуры анализа.
Исследование концентрации общего IgE в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного метода с использованием диагностических наборов «Алкор-Био» НПО «Биотехнология» (Россия, г. Санкт-Петербург) с регистрацией результатов в фотометре «Multiskan» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм., результаты выражали в МЕ/мл. Иммуноферментный анализ - метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. В данной тест системе применялся твердофазный вариант иммуноферментного анализа «сэндвич» метода, где в качестве твердой фазы используют 96-луночные планшеты, а в качестве фермента — пероксидаза хрена. Общая схема проведения метода заключается в следующем: на твердой фазе адсорбированы моноклональные антитела (анти-IgE) к исследуемому антигену (IgE). После добавления в лунки калибраторов и исследуемой сыворотки (при этом образуется комплекс антитело—антиген) добавляется конъюгат, т.е. моноклональные антитела к определяемому антигену, меченные ферментом (пероксидазой хрена). После инкубации исследуемого материала производится удаление не связавшихся компонентов (промывка специальным буфером) и остается комплекс, в котором антиген заключен между двумя слоями антител. Затем в лунки добавляется соответствующий хромоген-субстрат, который в присутствии фермента дает окрашивание. Интенсивность окраски хромогена прямо пропорциональна концентрации IgE в исследуемых образцах. После инкубации реакция субстрат-фермент останавливается (соляной или серной кислотой). Затем результаты учитываются путем измерения оптической плотности раствора в лунках с помощью ИФА-анализатора и последующим расчетом концентрации IgE на основе калибровочной кривой.
Аллергенспецифические IgЕ-антитела определяли к пищевым, бытовым и пыльцевым группам аллергенов у матерей и детей обследуемых групп в динамике в возрасте 3, 6 месяцев и 1 года жизни. Для количественного определения аллергенспецифических иммуноглобулинов E в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) использовали набор реагентов фирмы «Алкор-Био» (Россия, г. Санкт-Петербург) с регистрацией результатов в фотометре «Multiskan» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм.. В наборе «АллергоИФА-специфические IgE» для выявления IgE -антител, специфичных к конкретным аллергенам, использованы два варианта твердофазного иммуноферментного анализа. В лунках, предназначенных для калибровочных проб, реализован «сэндвич» - вариант анализа. Для этого использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к иммуноглобулинам класса Е, а также конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. Одно из моноклональных антител иммобилизовано на твердой фазе, второе конъюгировано с эфиром биотина. Во время первой инкубации в этих лунках одновременно происходят иммобилизация на твердой фазе и связывание с конъюгатом анти- IgE -биотин молекул IgE, содержащихся в калибровочных пробах. В лунках, предназначенных для образцов сыворотки крови, реализован «capture» - вариант иммуноферментного анализа. Для выявления IgE к конкретным аллергенам используются одно моноклональное антитело, специфичное к иммуноглобулинам класса Е и иммобилизованное на твердой фазе, а также биотинилированные аллергены вместо конъюгированного с эфиром биотина антитела и конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. В лунках с исследуемыми образцами во время первой инкубации происходит иммобилизация разных молекул IgE, содержащихся в сыворотке крови, на твердой фазе. Если среди них имеются IgE, специфичные к выбранным аллергенам, то одновременно происходит их связывание с биотинилированным аллерген.
При промывке планшета из лунок с калибровочными пробами удаляется избыток конъюгата анти- IgE -биотин, из лунок с образцами сыворотки крови -избыток биотинилированных аллергенов. Во время второй инкубации конъюгат стрептавидин-пероксидаза связывается с биотинилированными антителами в лунках с калибровочными пробами и биотинилированным аллергеном лунках с исследуемыми образцами. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Количество связавшегося аллергена и конъюгата стрептавидин-пероксидаза прямо пропорционально количеству специфических IgE в исследуемых образцах.
Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата стрептавидин-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочных графиков, построенных с использованием значений оптической плотности, полученной при длине волны 450 нм, рассчитывается концентрация специфических IgE в исследуемых образцах.
Аллергологический анамнез матерей детей с пищевой аллергией и атопическим дерматитом
В структуре хирургической и ортопедической патологии детей наблюдаемых групп на первом году жизни диагностировалась пупочная грыжа (12,1%), физиологическая водянка яичек (8,6%), гемангиома (6%), крипторхизм односторонний (5,2%), панариций (4,3%), мышечная кривошея (2,6%), варусная деформация голеней (1,7%) различий в частоте встречаемости у детей 1,2,3 групп не выявлено(p 0,05).
Одним из ведущих факторов формирования аллергической патологии у новорожденных и детей первого года жизни является характер вскармливание ребенка. Установлено, что искусственное вскармливание с рождения, а также ранний перевод на искусственное вскармливания наблюдался у 44,4% детей 1 группы, у 12,5 % детей 2 группы и 6,7% детей 3 группы. При этом на грудном вскармливании до 12 месяцев находилось 22,2% детей 1 группы, 47,5 % -2 группы и 70% детей 3 группы (таблица 4.1.3.)
Таким образом, дети с атопическим дерматитом, чаще были рождены от 3 беременности, 1 родов, посредством кесарева сечения, среди них 1/3 детей были недоношенными, регистрировались низкие антропометрические параметры при рождении, высокий процент наличия отягощенного аллергологического анамнеза, особенно по линии матери, и формирование на первом году жизни соматической патологии, такой как дисбактериоз кишечника, аллергический диатез в неонатальном периоде, диффузные изменения поджелудочной железы и печени. Установлено, что дети с атопическим дерматитов в 3 раза, а дети с пищевой аллергией в 1, 5 раза реже находились на естественном вскармливании, по сравнению со здоровыми детьми, что подтверждает мнение большинства ученых о значимости естественного вскармливания, как одного из факторов предупреждающего развитие аллергической патологии у новорожденных и детей первого года жизни.
Формирование атопии у детей начинается до рождения ребенка вследствие ряда физиологических изменений, происходящих в организме беременной женщины. Уровень цитокинов и иммуноглобулинов в пуповинной крови во время родов может определять риск развития различных вариантов аллергии у детей вплоть до 6-летнего возраста [156]. Для новорожденных характерна физиологическая супрессия клеточного иммунитета. С этих позиций, ведущее значение в процессах постнатальной адаптации имеет состояние гуморального звена иммунитета, который обеспечивается материнскими антителами. Через плацентарный барьер проходят только иммуноглобулины класса G, которые в свою очередь, представлены на 80-90% субклассами G1 и G2. Можно предположить, что на течение неонатального периода в определенной степени влияет уровнь иммуноглобулинов у новорожденного. Низкий уровень иммуноглобулинов новорожденного, связанный с акушерской, соматической патологией матери или состоянием ребенка, не исключает неблагоприятного влияния на течение неонатального периода с высоким риском развития в последующем аллергопатологии.
Для проведения комплексной оценки цитокинового профиля и гуморального звена иммунитета осуществлялся забор пуповинной крови сразу после пересечения пуповины из дистального отрезка пупочной вены.
Установлено достоверное снижение уровня IgG в пуповинной крови у новорожденных 1 группы по сравнению с новорожденными 3 группы (7,96 [5,40; 11,24] против 11,98 [8,36;12,65] г/л). Иммуноглобулины класса А, М в сыворотке пуповинной крови новорожденных исследуемых групп не выявлялись. По данным ряда авторов [12,30,] определение общего IgE в сыворотке пуповинной крови для прогнозирования развития аллергопатологии у детей, рожденных от матерей с отягощенным аллергологическим анамнезом остается дискутабельным. Результаты нашего исследования показали, что уровень общего IgE в сыворотке пуповинной крови у всех новорожденных 2 и 3 групп и 94% новорожденных 1 группы не определялся в тест системах ИФА, однако у 6% детей 1 группы уровень общего IgE составил 10-18 МЕ/мл. Полученные результаты об отсутствии повышенного уровня общего IgE в сыворотке пуповинной крови совпадают с результатами исследования других авторов [155,181], по данным которых содержание общего IgE колебалось от 3 до 6 МЕ/мл. Вместе с тем обращает внимание, что уровень общего IgE в сыворотке венозной крови у 25% детей 1 группы в возрасте 1 месяца был высоким и исследование в динамике (через 3, 6 месяцев) позволили установить, что с возрастом у детей с отягощенным аллергологическим анамнезом отмечался значительный рост данного показателя (10-кратное увеличение) и коррелировало с ранней манифестацией атопического дерматита у детей в возрасте 2-3 месяцев жизни.
Анализ уровня цитокинов в сыворотке пуповинной крови проводился с оценкой медианы, 95 квартелей, средней и ошибкой средней. Установлено, что у новорожденных 1 группы выявлено достоверное увеличение содержания ИЛ-10, по сравнению с уровнем у детей 2 и 3 группы детей (8,8 [5,0; 10,8] против 4,48[3,26; 6,4] против 2,55[1,86;4,99] пг/мл, p 0,05). Подобная закономерность была выявлена при анализе средних значений показателя (таблица 4.2.1.). Анализируя частоту встречаемости высоких и низких значений данного показателя в сыворотке пуповинной крови обследуемых групп новорожденных детей установлено, что процент высоких значений (3,9-19,17 пг/мл) выявлен у 94, 8% новорожденных 1 группы, что в 7 раз было выше, по сравнению с 13,3% 3 группы и в 1,4 раза с 60% 2 группой новорожденных детей. По данным Р. Amoudrus, et al (2006), высокий уровень ИЛ-10 в сыворотке пуповинной крови новорожденных с отягощенным аллергологическим анамнезом, возможно, связан с тем, что ИЛ-10 может синтезироваться не только Т- регуляторными клетками относящимися к СD4+ популяции лимфоцитов, но и другими типами клеток, включая макрофаги и дендритные клетки.
Иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных детей обследуемых групп
Важность того или иного фактора риска во многих работах часто обсуждается на основании изучения его частоты проявления в отдельных группах больных детей. Для сравнительного анализа вклада всех исследуемых параметров в формирование пищевой аллергии с проявлением атопического дерматита у детей первого года жизни был использован метод главных компонент (факторный анализ), позволивший редуцировать матрицу полученных данных.
Редуцирование матрицы данных и количества переменных (n=25) на основе метода главных компонентов и нормализованного варимаксного вращения матрицы факторных нагрузок [7] позволило идентифицировать 4 значимых фактора (объединения), составляющих 45,8% общей дисперсии на основе анализа матрицы показателей пуповинной и венозной крови детей 1 и 2 групп, а также данных анкетирования их матерей (таблица 5.1). Наиболее значимым объединением признаков (собственное значение 3,343; процент объясняемой дисперсии 12,38%) оказался фактор отрицательно коррелирующий с ИФН- и ИФН-, IgG (пуповинная кровь). В альтернативную группу вошли показатели аллергологического анамнеза матери (атопический дерматит, бронхиальная астма), уровень общего IgЕ в сыворотке пуповинной и венозной крови, уровень ИЛ-4 в сыворотке пуповинной крови. На основании анализа значений факторных нагрузок параметров, формирующих первый фактор (таблица 5.1, рисунок 5.1) он был интерпретирован как фактор «детерминированности баланса Th1, Th2 у новорожденных от матерей с аллергической патологией». Тем самым показано, что формирование АтД у детей с ПА происходит в условиях недостаточности реактивной системы интерферонов пуповинной крови (низкие концентрации
ИФН-, ИФН- в сыворотке пуповинной крови), определение общего IgЕ в пуповинной крови, в последующем с многократным ростом его уровня в сыворотке венозной крови и отягощенным аллергологическим анамнезом матери, создающим благоприятные условия для внутриутробной сенсибилизации ребенка.
Вторым по значимости (собственное значение 3,282; процент объясняемой дисперсии 12,16%) оказался фактор, положительно коррелирующий с курением матери (значение факторной нагрузки 0,85), ранним искусственным вскармливанием (0,68), оперативным родоразрешением (кесарево сечение) (0,69), наличием гестоза (0,62). Отрицательно коррелировал с уровнем ИФН- и ИЛ-10 в пуповинной крови (значение факторной нагрузки -042, -0,51соответствено) (таблица 5.1, рисунок 5.1). Второй фактор был интерпретирован как фактор «недостаточности иммунорегуляции», так как известно, что ИЛ-10 продуцируется Тreg клетками, Th2 лимфоцитами и нарушение его регуляторной роли может приводить к изменению характера иммунного ответа, что является одной из причин формирования аллергического воспаления.
В формировании третьего по значимости фактора (собственное значение 3,149; процент объясняемой дисперсии 11,66%) принимали участие, находясь в альтернативных группах с высокими значениями факторных нагрузок, дисбактериоз у ребенка (значение факторной нагрузки 0,83) и уровень одного из важнейших цитокинов Th1 лимфоцитов ИФН- в сыворотке венозной крови (значение факторной нагрузки -0,76), (таблица 5.1, рисунок 5.2). Учитывая, что дисбактериоз рассматривается как одна из причин нарушения оральной иммунологической толерантности, данный фактор был интерпретирован как фактор «участия микроэкологических нарушений кишечника в формировании АтД у детей».
Четвертый фактор (собственное значение 2,593; процент объясняемой дисперсии 9,61%) положительно коррелировал с несоблюдением гипоаллергенной диеты у матери значение факторной нагрузки 0,76), отсутствием гипоаллергенного быта (0,64), ХВГП (0,40) и отрицательно – с уровнем ИЛ-10 в венозной крови ребенка(-0,73), (табл.5.1, рис.5.2). Описываемый фактор был интерпретирован как фактор «взаимосвязь ранних проявлений пищевой аллергии
Таким образом, проведенный факторный анализ позволил выявить причинно -значимые антенатальные и постнатальные факторы риска и параметры иммунной системы у детей с пищевой аллергией, которые были сопряжены между собой. Результаты проведенного факторного анализа показали: существенный вклад в развитие АтД у детей с ПА принадлежит наследственному фактору (атопия у матери, у отца, у родственников) и нарушению рекомендаций по соблюдению гипоаллергенной диеты и быта беременной женщиной, а также особенностям течения беременности (гестоз, ХВГП). формированию АтД у детей с имеющейся пищевой аллергии способствует микроэкологические нарушения толстого кишечника, приводящие к 104 нарушению проницаемости кишечного барьера, избыточной антигенной нагрузке, изменению профиля цитокинового статуса. ведущими механизмами, участвующие в реализации развития АтД у детей с пищевой аллергией, являются: нарушение иммунорегуляции, о чем свидетельствуют низкие уровни ИФН-, ИФН-, что отражает недостаточность реактивности системы интерферонов; низкий уровень IgG и, напротив, высокие концентрации IgE, ИЛ-4, ИЛ-10 в сыворотке пуповинной и венозной крови. Проведенный кластерный анализ в совокупности с факторным анализом доказывают однонаправленность выявленных совокупностей и позволяют обосновать различные фенотипы пищевой аллергии, в структуре которых причинно-значимые антенатальные, постнатальные факторы риска и иммунологические показатели у детей с пищевой аллергией (рисунок 5.3.,5.4).
