Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Иммунологические нарушения и роль герпесвирусной инфекции при гломерулонефрите у детей .
1.1. Роль интерлейкинов-8, -10, -18 при гломерулонефрите 10
1.2. Роль а- и у-интерферонов при гломерулонефрите 17
1.3. Герпесвирусная инфекция и ее роль в поражении почек 20
1.4 Принципы терапии герпесвирусных инфекций 34
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клиническая характеристика исследуемых групп 43
2.2. Общая характеристика клинического, лабораторного и функционального обследования больных
2.3. Специальные методы исследования
2.3.1. Определение антител классов М и G к вирусу простого герпеса 1 типа (и авидности Ig G), цитомегаловирусу и вирусу Эпштейна-Барр в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа 57
2.3.2. Определение вируса простого герпеса 1 типа, цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр в сыворотке крови и мочевом осадке методом полимеразной цепной реакции 57
2.3.3. Методики определения уровней интерлейкинов-8, -10, -18 методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови и моче ... 59
2.3.4. Методика определения продукции интерферонов методом иммуноферментного анализа 61
2.4. Статистическая обработка результатов з
Глава 3. Частота и структура герпесвирусной инфекции у детей с гормоночувствительным нефротическим синдромом 63
Глава 4. Интерлейкины в крови и моче, и продукция интерферона у детей с гормоночувствительным нефротическим синдромом
4.1. Уровень интерлейкинов-8, -10, -18 в крови и моче у детей с гормоночувствительным нефротическим синдромом 96
4.2. Уровни иммуноглобулинов классов A, G, М у детей исследуемых групп 120
4.3. Динамика уровней интерлейкинов-8 и -18 в дебюте нефротического синдрома 121
4.4. Показатели продукции интерферона у детей с
гормоночувствительным нефротическим синдромом 134
Глава 5. Эффективность противовирусной терапии герпесвирусной инфекции у детей с вирусассоциированным гормоночувствительньгмнефротическим синдромом 151
Заключение 171
Выводы 182
Практические рекомендации 184
Список литературы
- Роль а- и у-интерферонов при гломерулонефрите
- Общая характеристика клинического, лабораторного и функционального обследования больных
- Методики определения уровней интерлейкинов-8, -10, -18 методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови и моче
- Уровни иммуноглобулинов классов A, G, М у детей исследуемых групп
Роль а- и у-интерферонов при гломерулонефрите
Гломерулонефрит (ГН) - гетерогенная группа заболеваний почек, различных по этиологии, патогенезу, клинико-морфологической характеристике, характеризующихся преимущественным поражением капилляров клубочков. В структуре хронической почечной недостаточности у детей, ГН занимает третье место после наследственных заболеваний и обструктивных уропатий [20].
ГН может быть первичным (идиопатическим), поражение при котором ограничиваются только почками, или вторичным - при системных заболеваниях (системная красная волчанка (СКВ), васкулиты и т.д.), вирусных и бактериальных инфекциях (гепатиты В и С, цитомегаловирусная инфекция и др.) [20].
Нефротический синдром (НС) представляет собой симптомокомплекс, состоящий из протеинурии более 3,5 г/1,73 м" в сутки или 40 мг/м7ч, гипоальбуминемии ниже 25 г/л, диспротеинемией, гиперлипидемии и отеков (периферические и генерализованных). Распространенность НС составляет примерно 1 случай на 6000 детского населения. Наиболее распространенным является так называемый идиопатический НС. Большинство исследований свидетельствует о ведущей роли дисфункции Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе, приводящим к изменению структуры клубочкового фильтра. Цитокины, продуцируемые лимфоцитами, вызывают повреждение щелевых диафрагм между малыми отростками подоцитов, что в свою очередь ведет к потере альбуминов [21]. Данную теорию подтверждает эффективность глюкокортикостероидов (ГКС) при идиопатическом НС. Их иммуносупрессивный эффект, очевидно, приводит к блокаде продукции ряда цитокинов, вызывающих дисфункцию подоцитарного аппарата.
Морфологической основой идиопатического НС являются так называемые минимальные изменения в клубочках.
ГН, ассоциированный с вирусными инфекциями, инициализируется посредством сложных иммунных реакций. Так, иммуноглобулины циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) могут повреждать гломерулярные клетки при активации Fc-рецепторов, но способствуют ли ЦИК гломерулярному воспалению, остается неизвестным. Молекулярные патологические механизмы, посредством которых вирусные инфекции могут вызывать ГН, в настоящее время до конца не ясны [11,21, 27].
В последние годы различные эффекты цитокинов находятся в центре внимания фундаментальной и клинической иммунологии. Особые надежды возлагаются на возможное лечебное применение цитокинов. Изучение цитокинов началось с 1957г., после открытия А. Айзексом и Д. Линденманом противовирусного агента - интерферона (ИФН).
Цитокины — класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма. Они определяют тип и длительность иммунного ответа, контролируют пролиферацию клеток, ангиогенез, гемопоэз, воспаление, репаративные и многие другие процессы.
В настоящее время более 100 цитокинов объединены в следующие группы [15,25,42]: 1) интерлейкины (ИЛ-1 - ИЛ-33 и др.) - регуляторные иммунные полипептиды, обеспечивающие взаимодействия внутри иммунной системы и связь ее с другими системами организма; 2) интерфероны (ИФН) - преимущественно противовирусные агенты с выраженным иммунорегуляторным действием: ИФН I типа (а-ИФН, (3-ИФН и др.), ИФН II типа (у-ИФН); 3) факторы некроза опухоли (ФИО) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действиями: (ФНО-а и ФНО-Р); 4) колониестимулирующие факторы (КСФ) - стимуляторы роста и диффе-ренцировки гемопоэтических клеток (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ и др.); 5) хемокины - хемоатрактанты для лейкоцитов; 6) факторы роста - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканей (фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелиальных клеток, фактор роста эпидермиса, трансформирующий фактор роста и др.). Система цитокинов постоянно пополняется находками новых продуктов. Многие количественные характеристики цитокинов оцениваются при целом ряде заболеваний человека, например, провоспалительные цитокины. Препараты цитокинов или антитела к ним внедряются в клиническую практику в качестве лекарственных средств (ИЛ-13, ИЛ-2, КСФ, ИФН и др.) для лечения тяжелых заболеваний.
Общая характеристика клинического, лабораторного и функционального обследования больных
Лечение ГВИ до настоящего времени остается сложной задачей. При персистирующей вирусной инфекции отмечается снижение специфических и неспецифических факторов иммунологической защиты. Несмотря на разнообразие лекарственных препаратов, использующихся для лечения герпетической инфекции, средств, обеспечивающих полное излечение, не существует [7, 29, 96].
В литературе широко обсуждается проблема лечения ГВИ при различных иммуносупрессивных состояниях. Как известно, осложнения, вызываемые герпесвирусами, при ослабленном иммунитете имеют тяжелые последствия, приводя, в ряде случаев, к летальному исходу. Показаниями к терапии являются: тяжелое, опасное для жизни острое или рецидивирующее герпесвирусное заболевание; неблагоприятный фон, на котором возникла острая или рецидивирующая ГВИ [34, 52].
Несмотря на существенное развитие фармакологической основы терапии, лечение ГВИ представляет значительные методические и практические трудности. Это объясняется непреодолимостью биологическими и фармакологическими методами терапии длительной персистенции герпесвирусов в организме человека, а также вторичным иммунодефицитом, сформированным у больных с рецидивирующими ГВИ. Для этиотропной терапии ГВИ используют химиопрепараты - аномальные нуклеозиды. Механизм действия которых связан с угнетением синтеза вирусной ДНК и репликации путем ингибирования вирусной ДНК-полимеразы. Имеющиеся лекарственные средства дают хорошие результаты при первичной фазе болезни или в начале рецидива, их эффективность максимальна в продромальный период и первые 48 часов реактивации вирусов.
Основными противовирусными препаратами являются ацикловир (валацикловир), фамацикловир, ганцикловир (валганцикловир).
Первый синтетический нуклеозид - зовиракс (ацикловир) был разработан в 1974 г. специалистами фирмы «Glaxo Wellcome» (Англия). Он до настоящего времени является наиболее часто назначаемым противогерпетическим препаратом. Ацикловир - синтетический ациклический аналог пуринового нуклеозида - гуанозина, одного из самых частых нуклеозидов ДНК вирусов (около 16% всех повторов в цепях ДНК вирусов герпеса) [29].
Ацикловир является родоначальником группы ингибиторов вирусной ДНК-полимеразы. После поступления в инфицированные клетки, содержащие вирусную тимидинкиназу, ацикловир фосфорилируется и превращается в ацикловир монофосфат, который под влиянием клеточной гуанилаткиназы преобразуется в дифосфат, и затем под действием нескольких клеточных ферментов в активный метаболит -— ацикловир трифосфат. Ацикловира трифосфат взаимодействует с вирусной ДНК-полимеразой, включается в цепочку вирусной ДНК, вызывает обрыв цепи и блокирует дальнейшую репликацию вирусной ДНК без повреждения клеток хозяина. В здоровых клетках концентрация ацикловира трифосфата в 40-100 раз ниже, чем в клетках пораженных вирусами, поэтому цитотоксичность препарата минимальна. Ацикловир ингибирует репликацию таких герпесвирусов человека, как (в порядке снижения активности ацикловира): ВПГ 1 и 2 типов, вирус Varicella zoster, ЭБВ и ЦМВ. Однако существуют ацикловиррезистентные штаммы герпетических вирусов [29].
В начале 80-х годов были синтезированы новые ациклические нуклеозиды: валацикловир (валтрекс , валавир ), фамцикловир (фамвир J). Валацикловир -метаболический предшественник ацикловира, представляющий собой L-вали коррелировало новый эфир ацикловира, предназначенный для приема внутрь. Препараты валацикловира имеют более высокую биодоступность (более 50% против около 20% у ацикловира) и меньшую кратность приема до 2-х раз в сутки, что серьезно повышает приверженность терапии при длительном лечении рецидивирующих ГВИ.
Фамцикловир в отличие от ацикловира (валацикловира) в 75-100 раз более активно связывается и фосфорилизируется вирусной тимидинкиназой, что создает значительный перевес синтетического нуклеозида над естественным. Химические структурные отличия фамцикловира обеспечивают его более высокую биодоступность, а также клиническую эффективность в 30% случаев в отношении штаммов, резистентных к ацикловиру (валацикловиру) [29].
Ганцикловир - препарат с преимущественным вирусостатическим действием на ЦМВ, представляет собой синтетический аналог 2 -дезоксигуанозина. К вирусам, чувствительным к ганцикловиру, относят ЦМВ человека, ВПГ 1 и 2, вирус герпеса человека типа б, 7 и 8, ЭБВ, вирус Varicella zoster.
В ЦМВ-инфицированных клетках ганцикловир вначале фосфорилируется под действием вирусной протеинкиназы UL97 с образованием ганцикловира монофосфата. Описаны мутации в гене UL97 ЦМВ, обеспечивающем фосфорилирование ганцикловира, а также мутации в гене вирусной ДНК-полимеразы, определяющие вирусную резистентность к ганцикловиру [29, 40].
Методики определения уровней интерлейкинов-8, -10, -18 методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови и моче
После тщательной промывки лунок стрипов, согласно инструкции, в каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего раствора коныогата стрептавидина с пероксидазой хрена, с последующей инкубацией в шейкере в течении 30 мин, при 37С и 700 об/мин. После окончательной тщательной промывки, согласно инструкции, в каждую лунку вносилось по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина и инкубировали в темноте в течение 25 мин при температуре 18-25С. Реакцию останавливали добавлением стоп-реагента.
Регистрация результатов проводилась с помощью спектрофотометра Anthos 2020 (Австрия) по измерению оптической плотности растворов в лунках планшет при длине волны 450 им с последующим построением калибровочного графика зависимости оптической плотности от концентрации определяемого цитокина в линейных координатах согласно прилагаемой инструкции.
Определение уровней а-ИФН и у-ИФН проводилось в плазме или сыворотке крови, а также исследовалась индуцированная продукция а-ИФН и у-ИФН клетками периферической крови в системе in vitro. Уровень а-ИФН в плазме отражает непосредственное его содержание в периферической крови, а уровень индуцированного ИФН - способность лейкоцитов к продукции ИФН в ответ на дополнительную стимуляцию (для а-ИФН - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для у-ИФН - фитогемагглютинин (ФГА)). Для здоровых людей характерным является практически полное отсутствие ИФН в плазме и достаточный уровень индуцированного ИФН.
Для определения продукции ИФН бралась венозная кровь в объеме 5 мл, в стерильную пробирку, содержащую 10-20 ед. гепарина. Постановку тестов производили в день забора крови. Тесты проводили в стерильных 96-луночных круглодонных планшетах в трех повторах. В каждую лунку вносили: в первые три - по 10 мкл вируса болезни Ныокастла (ВБН) - для индукции а-ИФН во вторые - по 10 мкл фитогемагглютинина - для индукции у-ИФН. Кровь разводили в соотношении 1:10 средой Игла или RPM1-1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамина и гентамицина. Во все лунки вносили по 100 мкл разведенной средой крови. Планшеты закрывали стерильной крышкой и инкубировали 24 час при 37С в атмосфере 5% ССЬ. Оставшуюся кровь центрифугировали для получения плазмы. Полученную плазму аликвотировали и хранили при -20С до постановки анализа.
Через 24 часа инкубации из лунок круглодонной планшеты аккуратно отбирали супернатант, аликвотировали и хранили при -20С до момента определения ИФН методом ИФА с использованием тест-наборов «альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ» и «гамма-Интерферон - ИФА-БЕСТ» фирмы ЗАО «Вектор-БЕСТ», Новосибирск-117, согласно прилагаемых инструкций.
Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методикам вариационной статистики на персональном компьютере при помощи программы «STATIST1CA 6.0». Проверка нормальности распределения осуществлялась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. При отличном от нормального распределения признаков, использовались непараметрические статистические методы: оценка различий двух несвязанных групп проводилось с использованием критерия Манна-Уитни; для определения корреляции применялся непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. При проверке статистических гипотез наличие статистической значимости определялось при значении р 0,05. Собственные результаты Глава 3. Частота н структура герпесвирусной инфекции у детей с гормоночувствительным нефротическим синдромом.
В настоящее время по-прежнему недостаточно изученным остается вопрос о роли ГВИ в этиологии и патогенезе ГЫ [148]. На сегодняшний день роль персистирующей вирусной инфекции как прогрессирующего и этиологического фактора ГН не ясна. Следует отметить, что по имеющимся данным для ГН, ассоциированного с персистирующей вирусной инфекцией, характерны: высокая частота обострений, смешанный мочевой синдром и резистентность к ИСТ [11, 28].
Для оценки частоты и структуры ГВИ у детей с гормоночувствительным вариантом нефротической формы ГН обследованы 94 ребенка с ГЧНС (средний возраст 7,77±0,43 лет; 32 девочек (34,0%), 62 мальчика (66,0%)), которым проводилось вирусологическое обследование с определением ЦМВ, ВПГ-І, ЭБВ (семейство Herpesviridae) методом ИФА и ПЦР (в лейкоконцентрате и клеточном осадке мочи).
Только у 6 детей не были выявлены маркеры ГВИ (ДНК и AT к трем исследуемым типам герпесвирусов). Таким образом, инфицированность герпесвирусами среди обследованных пациентов с ГЧНС составила 93,62%, что согласуется с данными отечественных и зарубежных исследователей [8, 12, 26].
В исследовании использовалось подразделение ГВИ на формы, по результатам комплексной оценки данных ИФА и ПЦР: различались активная, реактивированная и латентная (неактивная) формы инфекции (табл. № 1.2.4).
Все пациенты были разделены на две группы: первую группу составили дети с рецидивирующим ГЧНС (РНС) (п=45) (средний возраст 7,25±0,56 лет; 26 мальчиков (57,78%), 19 девочек (42,22%)), вторую - дети с ГЗНС (п=49) (средний возраст 8,26±0,65 лет; 36 мальчиков (73,47%), 13 девочек (26,53%))). Выделенные группы по возрасту и полу достоверно не отличались.
Уровни иммуноглобулинов классов A, G, М у детей исследуемых групп
Исследования последних 20 лет указывают на особенности клинических, патоморфологических и иммунологических характеристик у больных с гормоночувствительным вариантом нефротической формы гломерулонефрита среди гетерогенной группы нефрогического синдрома [20, 35]. Неоднородность гормоночувствительного варианта нефротической формы гломерулонефрита у детей, обусловленная различными этиологическими факторами (аллергены, вирусы, бактерии), способствующими манифестции и развитию рецидивов заболевания, а также исходным состоянием иммунной системы, находит отражение в различиях морфологических характеристик поражения почечной ткани, прогнозе заболевания, оівеїе на гормональную терапию. Кроме і ого, неоднородностью этой группы больных можно объяснить и противоречивость результатов исследований механизмов развития заболевания.
В исследовании приняли участие 58 детей с ГЧНС и их катамнестические повторные исследования (п=29) образцов крови и мочи при разной активности НС (с интервалами забора клинического материала через 1, 6 или 12 месяцев). Возраст детей был от 2 до 17 лет, (средний возраст составил 8,72±0,59 лет). Состав по полу был с преимущественным преобладанием мальчиков - 41 (71%), против 17 (29% ) девочек. Контрольную группу составили 13 практически здоровых детей (мочу исследовали у 11 из них) в возрасте от 3 до 16 лет (средний возраст составил 8,78±0,86 лет); 9 мальчиков (69%), 4 девочки (31% ). Таким образом, основная и контрольная группы не отличались по полу и возрасту. Все пациенты с ГЧНС были разделены на 2 группы: первую группу составили дети с рецидивирующим ГЧНС (24 ребенка и 9 катамнестических исследований проб крови, 7 проб мочи), вторую - дети с ГЗНС (34 ребенка и 20 катамнестических исследований проб крови, 15 проб мочи). Группу рецидивирующего течения ГЧНС (группа I, РНС) составили 24 ребенка (средний возраст 6,83±0,76 лет; распределение по полу составило: 62,5% - мальчики (15), 37,5% -девочки (9)). Группу пациентов с ГЗНС (группа II) составили 34 ребенка (средний возраст 9,52±0,83 лет; распределение по полу составило: 75% - мальчики (25), 25% - девочки (8)). Таким образом, различий по полу между двумя основными группами не выявлено, но дети с РНС имели достоверно более низкий средний возраст.
Все дети были распределены на 5 подгрупп с учетом активности и длительности ремиссии НС на момент обследования: I подгруппа - активность НС 2-3 ст.; II подгруппа - активность НС 1 ст.; III подгруппа - ремиссия НС менее 1 месяца; IV подгруппа - ремиссия НС более 1 месяца. Степень активности НС определялась в зависимости от выраженности экстраренальных проявлений, обменных изменений и мочевого синдрома (по классификации Сперанского Г.Н. с соавт. 1966 г., с добавлениями Игнатова М.С., Вельтищев Ю.Е. 1989 г.
У детей основных и контрольной групп проведено общеклиническое и вирусологическое исследование, определение уровня интерлейкинов 8, 10, 18 в крови и моче. Показатели уровня ИЛ-8 в сыворотке крови (пкг/мл) и моче (мкг/ммоль Сг мочи) по подгруппам детей с ГЧНС с учетом активности НС, представлены в таблице 4.1 и 4.2.
Средний уровень ИЛ-8 в сыворотке крови у пациентов основных (группы I и II) и контрольной групп достоверно не отличался независимо от активности НС (р 0,05) (табл. 4.1). Но отмечалась тенденция к его более высокому уровню при ГЗНС независимо от активности НС. При ремиссии НС более 1 месяца средний уровень ИЛ-8 в сыворотке среди детей с ГЗНС был достоверно выше, чем у детей с РНС (р 0,05). Также следует отметить, что средний уровень ИЛ-8 в сыворотке крови у детей с РНС в ремиссии НС более 1 месяца был достоверно ниже, чем при ремиссии менее 1 месяца (р 0,05). Таблица 4.1. Уровень ИЛ-8 в сыворотке крови у детей с ГЧНС № Подгруппы пациентов (1)Группа РНС (2)Группа ГЗНС ГЧНС общая РгРг п М±т п М±т п М±т Уровень ИЛ-8 в сыворотке крови, пкг/мл 1. Активность П-Ш ст. 10 9,04±1,17 13 18,46±8.04 23 14,37 4,60 0,05 2. Активность I ст. 11 5,03+1,40 14 5,79 1,32 25 5,45±0,95 0,05 3. Ремиссия менее 1 мес 8 12,85±4,53 9 17,46±4,09 17 15,44±2,99 0,05 4. Ремиссия более 1 мес 4 3,15±3,15 18 12,62±1,94 22 10,90±1,84 0,05 5. Контроль, п=13 10,69±1,63 - р2-р5 0,05; рз-р4=0,05 В тоже время средний уровень ИЛ-8 в моче (мкг/ммоль Сг мочи) больных с активным НС (включая I—III степени активности) обеих групп был достоверно выше, чем в ремиссии и контрольной группе (р 0,05). Уровень ИЛ-8 в моче между двумя основными группами достоверно не отличался в соответствующих подгруппах активности НС (р 0,05) (табл. 4.2).
При установлении взаимосвязи уровня ИЛ-8 в моче (пкг/моль Сг мочи) и степени протеинурии (г/м /сут) не было найдено корреляционной связи как у детей изучаемых групп (R=0,15; р 0,05 и R=0,25; р 0,05, соответственно для I и II группы), так и в общем количестве детей с ГЧНС (R=0,44; р 0,05). Не было выявлено достоверной корреляционной связи между концентрациями ИЛ-8 в сыворотке крови и моче (R=0,15; р 0,05), что указывает на высокую вероятность локального почечного происхождения ИЛ-8 в моче.
Средний уровень ИЛ-18 в сыворотке крови у пациентов основных (группы I и II) и контрольной групп достоверно не отличался независимо от активности НС (р 0,05) (табл. 4.3). При ремиссии НС менее 1 месяца средний уровень ИЛ-18 в сыворотке среди детей с РНС был достоверно выше, чем у детей с ремиссией РНС более 1 месяца (р 0,05) (табл. 4.3).
