Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Факторы риска развития бронхиальной астмы .
1.2 Механизмы развития бронхиальной астмы
1.3. Основные принципы лечения бронхиальной астмы
1.4. Гены предрасположенности к бронхиальной астме
1.4.1. Ген глюкокортикостероидного рецептора
1.4.2.Ген рецептора кортикотропин-рилизинг гормона .
1.4.3. Ген транскрипционного фактора T-bet .
1.4.4. Ген 2-адренергического рецептора .
1.4.5. Ген ариламин-N-ацетилтрансферазы 2
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Общеклинические методы
2.2. Иммунологические методы
2.3. Аллергологические методы
2.4. Инструментальные и другие методы исследования .
2.5. Молекулярно-генетические методы
2.5.1. Выделение геномной ДНК
2.5.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
2.5.3. Рестрикционный анализ .
2.5.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле
2.6. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3. Реультаты и обсуждение
3.1. Комплексная характеристика детей, больных бронхиальной астмой
3.1.1. Сравнительный анализ клинико-анамнестических показателей больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов
3.1.2. Клинико-аллергологическая характеристика детей, больных бронхиальной астмой
3.1.3. Сравнительная характеристика функциональных и клинических оценок контроля бронхиальной астмы у детей.
3.2. Исследование полиморфных вариантов генов у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов
3.2.1. Анализ ассоциации полиморфного варианта rs41423247 гена глюкокортикостероидного рецептора с развитием бронхиальной астмы
3.2.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов (rs242939,
rs1876828, rs242941) гена рецептора кортикотропин-рилизинг гормона с развитием бронхиальной астмы
3.2.3. Анализ ассоциации полиморфного варианта rs2240017 гена транскрипционного фактора T-bet (TBX21) с развитием бронхиальной астмы
3.2.4. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена 2-адренорецептора (rs1042713, rs1042714, rs1800888) с развитием бронхиальной астмы .
3.2.5. Анализ ассоциации полиморфных вариантов (rs1799929, rs1799930, rs1799931) гена ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 с развитием бронхиальной астмы
3.3. Исследование роли межгенных взаимодействий в формирова нии предрасположенности к бронхиальной астме .
Заключение
Выводы
Практические рекомендации список литературы.
- Основные принципы лечения бронхиальной астмы
- Инструментальные и другие методы исследования
- Клинико-аллергологическая характеристика детей, больных бронхиальной астмой
- Анализ ассоциации полиморфного варианта rs2240017 гена транскрипционного фактора T-bet (TBX21) с развитием бронхиальной астмы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бронхиальная астма остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Согласно эпидемиологическим данным, во многих странах отмечается прогрессивный рост ее в детском возрасте (Зайцева О.В., 2007; Геппе Н.А., Файзуллина Р.М., 2010). Распространенность БА среди детей в России составляет 5,6–12,1% (Хаитов Р.М., Ильина Н.И., 2009; Балаболкин И.И., Булгакова В.А., 2011). В Республике Башкортостан (РБ) в период за 1991–2009 гг. распространенность БА среди детей увеличилась в 3,5 раза (с 172,1 до 610,3 на 100 тыс. населения), среди подростков примерно в 5 раз (с 183,1 до 901,5 на 100 тыс. населения) (Тимашева Р.З., Азнабаева Ю.Г., Муталов А.Г., 2010).
Современная медицина предлагает новые подходы к ведению пациентов с точки зрения уровня контроля над заболеванием, акцентируя внимание на ступенчатой терапевтической стратегии, в которой целью является достижение клинического контроля, а не лечение «тяжести» болезни (Национальная программа, 2012). Несмотря на значительные успехи клинической фармакологии, лечение БА и на сегодняшний день остается сложной задачей (Вишнева Е.А., Намазова-Баранова Л.С., 2008).
По международным стандартам в настоящее время ИГКС являются самыми эффективными препаратами базисной терапии БА (Огородова Л.М., Петровский Ф.И., Петровская Ю.А., 2002; GINA, 2012). Однако существуют пациенты с тяжелой формой БА, нуждающиеся в терапии высокими дозами глюко-кортикостероидов на длительный период. Установлено, что вариабельность ответа на ряд противоастматических препаратов может зависеть от генетических особенностей организма (Evans W.E., McLeod H.L., 2003; Tantisira K. et al., 2004; Асанов А.Ю. и др., 2008).
Тяжелые формы имеют невысокую частоту в структуре БА, но именно они в первую очередь составляют группу риска по неблагоприятным исходам и инвалидизации (Чучалин А.Г., 2000). Важно выявить этих пациентов на ранних сроках заболевания, т.к. отсутствие ответа на терапию часто приводит к неоправданно высоким дозам ИГКС и 2-адреномиметиков, и, как следствие этого, развитию побочных эффектов.
БА является многофакторным заболеванием, в развитии которого принимает участие множество генетических и внешнесредовых факторов. В последние годы во всем мире идет интенсивное изучение генов, связанных с ответом на препараты, применяемые для терапии БА (Bray P.J., Cotton R., 2003; Contopoulos-Ioannidis D. et al., 2005; Bleecker E.R. et al., 2007;
Szczepankiewicz A. et al., 2008; Dijkstra A. et al., 2008; Hizawa N., 2009; 2011;
Tantisira K.G. et al., 2004; 2008; 2011; Rogers A.J. et al., 2009; Ye Y.M. et al., 2009; Finkelstein Y. et al., 2009; Portelly M., Sayers I., 2012).
В литературных данных российских ученых встречаются, в основном, молекулярно-генетические работы, посвященные исследованию роли полиморфных вариантов генов цитокинов и генов детоксикации ксенобиотиков в развитии БА (Пузырев В.П., Фрейдин М.Б., 1999; Ляхович В.В. и др., 2002; Фрейдин М.Б. и др., 2002, 2003; Брагина Е.Ю. и др., 2005; Карунас А.С. и др., 2004; 2007; 2012; 2009; Федорова Ю.Ю. и др., 2009; 2010; Макарова С.И., 2011; Шагалина А.У. и др., 2012; Смольникова М.В. и др., Тютина О.С., 2013). Накоплен опыт в отношении генов, отвечающих за эффективность противоастматической терапии: в частности, генов, кодирующих 2-адренорецептор (Васьковский Н.В. и др., 2006; Саркисян Л.К., 2006; Брянцева О.Н. и др., 2007; Ненашева Н.М., 2008; Хаи-това Н.М. и др., 2009; Соловьева Н.А., 2009) и глюкокортикостероидный рецептор (Жданова М.В. и др. 2007; Асанов А.Ю. и др., 2008; Тюменцева Е.С., Петрова Н.В., 2011; Симакова М.А., 2011; Миронова Ж.А., 2012).
Результаты представленных выше исследований весьма противоречивы и не дают однозначного ответа в отношении возможного влияния полиморфных вариантов генов, ответственных за метаболизм глюкокортикостероидов и 2-агонитов, на эффективность проводимой противоастматической терапии.
На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы. Оценка клинико-генетической значимости полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме глюкокортикостероидов и 2-агонистов, в прогнозировании развития и течения бронхиальной астмы у детей.
Задачи исследования:
-
Оценить клинико-аллергологический статус детей, больных бронхиальной астмой.
-
Определить место «Теста по контролю над астмой» и теста на заложенность носа в мониторинге детей с бронхиальной астмой.
-
Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов генов глюкокор-тикостероидного рецептора GR, рецептора кортикотропин-рилизинг гормона CRHR1, транскрипционного фактора TBX21, 2-адренорецептора ADRB2 и ари-ламин-N-ацетилтрансферазы NAT2 с развитием бронхиальной астмы у детей.
-
Провести оценку эффективности лечения детей с бронхиальной астмой с различными генотипами по полиморфным вариантам исследованных генов. Установить генетические маркеры повышенного риска тяжелого, неконтролируемого и частично-контролируемого течения заболевания.
-
Оценить роль межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к развитию и течению бронхиальной астмы.
Научная новизна. Впервые дана комплексная оценка клинико-аллергологического, функционального и фармакогенетического статуса детей с бронхиальной астмой. Показана корреляция результатов «Теста по контролю над астмой» с функциональными методами оценки проходимости дыхательных путей (спирография, пикфлоуметрия), что позволяет использовать АСТ-тест, как наиболее простой и доступный метод контроля бронхиальной астмы. Использование анкеты на заложенность носа у детей с БА дает возможность диагностировать патологию ЛОР-органов и своевременно направлять на обследование к специалисту.
Впервые в диссертационной работе определены частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов глюкокортикостероидного рецептора, рецептора кортикотропин-рилизинг гормона, транскрипционного фактора T-bet, 2-адренергического рецептора и ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 у детей с БА и практически здоровых индивидов, проживающих на территории РБ. Проведен анализ ассоциаций данных полиморфных локусов с бронхиальной астмой в РБ. Выявлены маркеры повышенного риска развития, тяжелого, неконтролируемого течения БА. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по разработке лечебных и профилактических мероприятий у детей, страдающих бронхиальной астмой. По мере совершенствования методов генетического скрининга фармакогенетический подход может приобрести важное значение для индивидуального подбора эффективной терапии.
Практическая значимость. Для оценки эффективности терапии БА врачами первичного звена здравоохранения, аллергологами, пульмонологами, детьми и их родителями может использоваться «Тест по контролю над астмой».
С целью выявления и контроля сопутствующей патологии ЛОР-органов информативно использование теста на заложенность носа.
Для прогнозирования риска неконтролируемого течения болезни у конкретного пациента и определения спектра аллергологического обследования целесообразно проведение генотипирования по полиморфным вариантам генов глюкокор-тикоидного рецептора GR (rs41423247) и 2-адренорецептора ADRB2 (rs1042714).
Внедрение в практику. Результаты исследования применены в учебном процессе на кафедре госпитальной педиатрии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, внедрены в практику подготовки интернов на кафедре госпитальной педиатрии, а также в клиническую практику аллергологов аллергологического отделения и поликлиническую работу врачей пульмонологов и аллергологов РДКБ (г. Уфа).
Полученные результаты молекулярно-генетического исследования у детей
с бронхиальной астмой и их практически здоровых сверстников, проживающих
на территории РБ, используются при чтении лекций на кафедре генетики и фундаментальной медицины государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» Министерства образования Российской Федерации.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XIII Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии» (Томск, 2009); Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Уфа, 2011; Москва, 2012; Казань, 2013); Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2009; 2010; 2011); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Курск, 2011); II Всероссийской школе-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011); Всероссийской школе-конференции молодых ученых (Уфа, 2012); XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011); конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Стамбул, 2011; Милан, 2013), конгрессах Европейского респираторного общества (Барселона, 2010; Амстердам, 2011; Вена, 2012). Материалы диссертации по вопросам диагностики, профилактики аллергических заболеваний и контроля бронхиальной астмы изложены в монографии «Критерии диагностики, классификации и лечение отдельных болезней органов дыхания у детей // Под ред. Р.Ф. Гатиятуллина»: в главах «Если в семье аллергик. Вопросы профилактики аллергических заболеваний», «Бронхиальная астма у детей. Критерии диагностики и вопросы контроля над заболеванием» (Уфа, 2012).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертационной работы опубликовано 34 печатные работы, в том числе 4 в рецензируемых журналах, включенных в «Перечень российских рецензируемых научных журналов».
Структура и объём и диссертации. Диссертационная работа изложена на 199 страницах, иллюстрирована 38 таблицами, 33 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 148 отечественных и 213 зарубежных источника.
Основные принципы лечения бронхиальной астмы
Бронхиальная астма является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. В связи с этим по инициативе Национального института сердца, легких и крови (США) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 1993г. была разработана «Глобальная инициатива по бронхиальной астме» (GINA). В 1995г. вышел первый совместный доклад, в котором освещались современные подходы к лечению и профилактике БА. «Глобальная инициатива по бронхиальной астме» получила широкое распространение и была переведена на многие языки мира. В нашей стране отражением данного документа стала, созданная в 1997г., первая Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактики». Внедрение Национальной программы позволило улучшить диагностику БА, уменьшить долю тяжелых больных, их инвалидизацию и летальность.
Бронхиальная астма определяется как хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором играют роль многие клетки и клеточные элементы [GINA, 2012]. Заболевание сопровождается повышением реактивности дыхательных путей, которое приводит к повторяющимся эпизодам свистящих хрипов, одышке, чувства стеснения в груди и кашля, особенно ночью или ранним утром [GINA, 2012]. Эти эпизоды обычно связаны с распространенной, но изменяющейся по своей выраженности бронхиальной обструкцией, которая часто является обратимой спонтанно, либо под влиянием лечения. БА является одним из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний [Национальная программа, 2012].
В связи с более высокой распространенностью БА у детей, чем у взрослых, вариабельностью клинического течения в разные возрастные периоды, трудностями диагностики и лечения у детей до 5 лет в 2007г. был создан документ, являющийся консенсусом педиатров мира – PRACTALL (Practical Al 12 lergology (Pediatric Asthma Group EAACI / AAACI)) по вопросам БА у детей. PRACTALL описывает БА у детей как повторяющиеся эпизоды бронхиальной обструкции и гиперреактивности дыхательных путей к таким провоцирующим факторам, как физическая нагрузка, контакт с аллергеном и вирусные инфекции. Между тем, эти симптомы, широко распространенные у дошкольников, часто носят транзиторный характер и у 60% детей исчезают к школьному возрасту [PRACTALL, 2008].
Распространенность бронхиальной астмы в разных регионах мира к 1998 году по данным ISAAC (International Studi of Astma and Allergies in Childhood) и ECRHS (European Communiti Respiratory Health Survey), составило 10-15%, число больных детей достигло 100-150 миллионов человек [Сергеева Г.Р., Емельянов А.В., 2002]. В последнее десятилетие у детей прослеживается отчетливая тенденция дальнейшего роста частоты этих заболеваний, что диктует поиск новых путей решения проблемы, в частности рационального применения современных лекарственных средств [Bousquet J., et al., 2009].
Исследования по программе «ISAAC», проведенные в ряде городов России, свидетельствуют о значительной распространенности БА, так в Москве за период с 1993 по 2002г. зафиксирован рост текущих показателей заболевания почти в 2,5 раза, особенно ночных симптомов [Национальная программа, 2012]. Распространенность симптомов БА в разных регионах значительно не различается и составляет 16,9% в Москве, 10,6% в Иркутске, 11,1% – Новосибирске, 11,4% – Томске. В среднем по РФ симптомы астмы зарегистрированы у 9,7% опрошенных детей [Баранов А.А., Хаитов Р.М., 2008].
Распространенность БА среди детей в России составляет 5,6-12,1% [Хаитов Р.М., Ильина Н.И., 2009; Балаболкин И.И., Булгакова В.А., 2011]. В Республике Башкортостан в период за 1991-2009 гг. распространенность БА среди детей увеличилась в 3,5 раза (с 172,1 до 610,3 на 100 тыс. населения), среди подростков примерно в 5 раз (с 183,1 до 901,5 на 100 тыс. населения) [Тимашева Р.З., Азнабаева Ю.Г., Муталов А.Г., 2010]. 1.1. Факторы риска развития бронхиальной астмы
Бронхиальная астма – это многофакторное заболевание, развитие которого обусловлено комплексным воздействием внутренних и внешних факторов. Согласно Национальной программе (2012г.) выделяют следующие факторы риска возникновения брохиальной астмы у детей (табл. 1.1.)
Генетическая предрасположенность. Наследственная предрасположенность к аллергическим реакциям и болезням наблюдается у 30-70% детей с атопическими болезнями [Пузырев В.П. и др., 2002; Геппе Н.А., Ревякина В.А., 2008; Будчанов Ю.И., Делягин В.М., 2010]. Влияние генетических факторов является одним из важнейших условий, необходимых для реализации аллергического заболевания (АЗ) при соответствующих факторах окружающей среды [Фрейдин М.Б. и др., 2010; Vercelli D., 2003; Kaza U. et al., 2007].
Генетическая предрасположенность к атопии может выражаться различными клиническими проявлениями: астмой, ринитом или атопическим дерматитом [Postma D.S. et al., 2000].
Атопия определяется как наследственная предрасположенность к IgE-опосредованному ответу на воздействие распространенных аллергенов окружающей среды, и верифицируется тремя методами: кожными аллергопробами, высоким уровнем IgE, эозинофилией крови [Чучалин А.Г., 2005]. Иммунная система индивидуумов с атопией способна к распознаванию и выработке иммунного ответа даже на воздействие крайне низких концентраций ингалируе-мого аллергена. Наличие атопии считается важным условием, способствующим развитию БА. Еще в 1960-1970 гг. был проведен ряд исследований, которые подтвердили наследственный компонент БА. В частности, в результате семейных исследований было выяснено, что предполагаемый общий генетический вклад в астму составляет 30-70% [Делягин В.М. и др., 2012].
Инструментальные и другие методы исследования
Спирометрия проводилась детям с БА старше 5 лет. Функцию внешнего дыхания определяли на спирографе («Erich Jaeger», Германия). Оценка результатов выполнялась согласно границам норм и градаций патологических отклонений показателей кривой «поток-объем» (в процентах от должных величин, заложенных в компьютерную базу спирометра). Оценивались такие по 53 казатели как: ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1, МОС 25, МОС 50, МОС 75. Градации нормы и снижение параметров спирограммы в % от долженствующей величины для детей до 18 лет оценивались по Клементу Р.Ф. и Зильберу Н.А., 1994.
Пикфлоуметрия является средством контроля БА посредством индивидуального пикфлоуметра. Данный метод подходит для пациентов старше 5 лет. ПСВ измеряли утром – сразу после пробуждения до ингаляции бронхоли-тиков и вечером – перед сном, после их применения. Тест выполняли стоя, прибор держали в горизонтальном положении, делали максимальной вдох, затем плотно обхватив губами пикфлоуметр, максимальный выдох. Попытку проводили трижды, отмечая наилучший показатель. Мониторинг ПСВ может быть информативен для определения ранних симптомов обострения заболевания, определения обратимости бронхиальной обструкции, оценки тяжести заболевания, оценки гиперреактивности бронхов, прогнозирования обострения, оценки эффективности лечения. Ориентировочные нормы показателей ПСВ приведены в специальных таблицах и зависят от роста, возраста и пола.
Вариабельность пиковой скорости выдоха — важный критерий тяжести и стабильности состояния, так как она коррелирует с гиперреактивностью дыхательных путей [Национальная программа, 2012]. Дневной разброс показателей ПСВ более чем на 20% рассматривается как диагностический признак суточной вариабельности ПСВ [Чучалин А.Г и др., 1997].
Для удобства оценки течения заболевания разработана методика регистрации данных пикфлоуметрии с использованием принципа «светофора», в соответствии с нею на графике пациента зеленым цветом обозначается границы нормальных значений ПСВ более 80% от должных величин, желтым – в пре 54 делах 60-80%, красным – ПСВ менее 60%. [Цыпленкова С.Э., 2010]. Мониторинг ПСВ может быть информативен для определения ранних симптомов обострения заболевания [Намазова Л.С. и др., 2006]. Тест по контролю над астмой Оценка степени контроля БА проводилась с использованием валидизи-рованного вопросника «Тест по контролю над астмой» (Asthma Control Test, АСТ). Данный тест создан специально для выявления пациентов с плохо контролируемой БА.
АСТ-тест продемонстрировал хороший уровень надежности [Белевский А.С., 2005], высокую чувствительность и хорошую корреляцию с оценкой контроля над БА врачом-специалистом (общее согласие – 71-78%) [Nathan R.A. et al., 2004]. В ряде исследований была доказана корреляция АСТ-теста и ОФВ1 [Елисеева Т.И. и др., 2013; Nathan R.A. et al., 2004; Schatz M. et al., 2006], имеются данные о корреляции уровня контроля с БГР [Черняк Б.А., Иванов А.Ф., 2008]. Более того, в некоторых исследованиях продемонстрирована большая чувствительность АСТ-теста в контроле БА, чем функционального обследования легких [Nathan R. еt al., 2004; Schatz M. et al., 2007]. АСТ-тест – надежный инструмент для оценки эффективности лечения детей с БА. Ранее АСТ был доступен для взрослых и детей старше 12 лет, но с 2006 г. разработана его детская версия с 4-11 лет.
Тест по контролю над астмой у детей содержит 7 вопросов, касающихся симптомов заболевания и общей оценки пациентом своего самочувствия. Вопросы 1-4 предназначены для ребенка (4-бальная оценочная шкала ответов: от 0 до 3 баллов), а вопросы 5-7- для родителей (6-бальная шкала: от 0 до 5 баллов). Результатом теста является сумма оценок за все ответы в баллах (максимальная оценка-27 баллов). В зависимости от общего количества баллов, набранных пациентом, выносится решение о контроле над БА (20 баллов и выше), 19 баллов и ниже – контроль недостаточно эффективен. Опросник АСТ-теста представлен в разделе приложение (рис.1). Тест на назальную проходимость
Тест на назальную проходимость был предложен компанией Шеринг-Плау. Данный тест содержит 7 вопросов, касающихся носовых симптомов и общей оценки пациентом своего самочувствия. Для каждого из вопросов существует перечень формализованных ответов, каждому из которых соответствует определенное количество баллов (0-4 балла). В зависимости от общего количества баллов, набранных пациентом, выносится решение о вероятном наличии ЛОР-патологии (более 7 баллов) или его отсутствии (меньше 7 баллов). Опросник теста на заложенность носа представлен в разделе приложение (рис.2).
Молекулярно-генетические исследования выполнялись в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (дир. – д.б.н., проф. Вахитов В.А.) в лаборатории молекулярной генетики человека отдела геномики (зав. – д.б.н., проф. Хуснутдинова Э.К.).
ДНК была выделена из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew C.C., 1984]. Кровь набирали в пробирки с консервантом, в качестве которого использовался глюгицир в соотношении с кровью 1:4, тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С не более 2 недель. Для получения фракции клеточных ядер к 5 мл крови добавляли 30 мл холодного лизирующего буфера (320мМ сахароза; 5мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10мМ трис-HCl; рН= 7,6) и центрифугировали 20 мин. при температуре +4 и 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали. К осадку повторно добавляли 20 мл холодного лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. Надосадочную жидкость снова сливали. Ядерный осадок суспензировали в 800 мкл буфера Soline EDTA (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75мМ NaCl), переносили осадок с Soline EDTA в эппендорф на 2 мл, добавляли 80 мкл 10% SDS и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл), слегка перемешивали и инкубировали при 37 С в течение 12 часов.
Экстракцию ДНК проводили в три этапа: забуференным фенолом (фенол-трис-HCl, рН 7,8, 200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола-трис-НCl); смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа-изоамилового спирта (1 мл изоамилового спирта на 24 мл хлороформа) в равных объемах. Выделение ДНК проводили, смешивая лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляли центрифугированием при 5 000 об/мин. в течение 10 мин. ДНК осаждали путем добавления 2-3 мл охлажденного 96% этанола. Плавно перемешивали до образования «медузы». Осадок промывали 2 мл 70% спирта для удаления солей, подсушивали на воздухе, затем растворяли в дистиллированной воде и хранили при -20С.
Клинико-аллергологическая характеристика детей, больных бронхиальной астмой
По данным Овчинникова А.Ю. и совт. у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких в 80–100% случаев встречаются патологические изменения со стороны полости носа и околоносовых пазух [Овчинников А.Ю., Овчаренко С.И., 2010]. В нашем исследовании наряду с АР у 55 (28,1%) детей была диагносцирована сопутствующая ЛОР-патология (р=0,0003): гипертрофия аденоидов (15,8%) и небных миндалин (6,6%), различной степени экссудативный средний отит (5,1%), искривление носовой перегородки носа с нарушением носового дыхания (3,6%), хронический гипертрофический ринит (2,0%), у 9,2% детей было выявлено сочетанное поражение ЛОР-органов. У 4,1% больных АР был диагносцирован гнойный риносинусит, у одного больного – полипозный риносинусит.
Более половины больных БА (51,5%, n=101) жаловались на проявления сезонного АР. Дети, проживающие в городах, достоверно чаще страдали пол-линозом (р=0,004), АД (р=0,04), крапивницей (р=0,015) и непереносимостью лекарственных препаратов (р=0,038).
Атопическая триада в виде дермато-респираторного синдрома (АД, БА, АР) встречалась в 11,7 % случаев.
У каждого второго (59,2%) ребенка основной группы отмечалась пищевая аллергия в виде крапивницы, в том числе на цитрусовые (21,9%), шоколад (17,9%), яблоко (7,1%), куриное яйцо (6,6%), мед (6,1%), землянику (5,1%), томаты (5,1%), рыбу (4,6%), орехи (4,6%), коровье молоко (4,6%), свеклу (4,1%), курицу (2,0%), бананы (2,0%).
Реакцию на прием лекарственных средств отмечали у себя 29,6% (n=58) детей, в том числе на антибактериальные препараты (21,4%), нестероидные противоспалительные препараты (4,6%), антигистаминные препараты первого поколения (2,0%), витамины (1,5%). У 9,7% детей, больных БА, отмечался отек Квинке на лекарственные препараты (антибиотики, нестероидные противовоспалительные препараты), фрукты, морепродукты, яйцо, орехи, как проявление поливалентной аллергии. В нашем исследовании к редким клиническим проявлениям была отнесена инсектная аллергия, наблюдавшаяся у трех мальчиков (1,5%). У большинства детей наблюдалось сочетание аллергических болезней.
Среди наиболее частых причин, вызывающих приступы заболевания, ряд авторов выделяет физическую нагрузку, которой подвержены 60-90% детей [Национальная программа, 2012], аллергены домашней пыли – 54,2%-85,0% [Bjornsson E. et al., 1995; Цибулькина В.Н., 2005; Национальная программа, 2012], аллергены шерсти кошек и собак – 37,5%-63,6% детей [Цибуль-кина В.Н., 2005]. С приемом пищевых продуктов связывают обострения 7,0% детей с БА [Балаболкин И.И., 2006]. Респираторные вирусные инфекции являются ответственными почти за 80-85% всех обострений БА у детей [Grissell T.V. et al., 2005; Gavala M. et al., 2011].
С тяжестью БА спектр факторов, провоцирующих эпизоды бронхоспаз-ма, расширялся: физическая нагрузка (р 0,001), изменение метеоусловий (р=0,001), табачный дым (р 0,001), резкие запахи (р=0,009), пищевые аллергены (р=0,04). Острые респираторные заболевания достоверно чаще провоцировали приступы удушья у детей с отягощенным аллергологическим анамнезом (р=0,022).
Наличие сопутствующих соматических заболеваний оказывает существенное влияние на тяжесть и течение БА. Данные литературы свидетельствуют о том, что заболевания ЖКТ, эндокринной, сердечно-сосудистой систем, ЛОР-органов, острые респираторные вирусные инфекции могут отягощать течение БА, уменьшать эффективность проводимой терапии и контроль над заболева 75 нием [Юхтина Н.В., 1998; Лягина А.А., Косякова Н.И., 2006; Аршба С.К., 2008; Чернуцкая С.П. и др., 2008; Галимова Е.С. и др., 2010; Войтенкова О.В., 2011; Сидорова Л.Д. и др., 2011]. Анализ частоты сопутствующей патологии у детей основной группы с различным течением БА выявил достоверные различия между группами наблюдения (р 0,05) (табл.3.4.). Тяжесть БА коррелировала с частотой соматических заболеваний (р=0,002). У детей с тяжелой формой БА соматическая патология была выявлена в 97,6% случаев. Для определения спектра сенсибилизации в период ремиссии основного заболевания детям с БА были проведены скарификационные пробы с аллергенами. Пробы с бытовыми аллергенами были поставлены у 75,0% (n=147) детей, с эпидермальными у 16,3% (n=32), с пищевыми у 7,1% (n=14), с пыльцевыми аллергенами у 34,7% (n=68) пациентам, в том числе с пыльцой деревьев 27,6% (n=54), с пыльцой луговых трав 23,0% (n=45), с пыльцой сорных трав 20,4% n=40) и с пыльцой маревых трав 11,2% (n=22).
В нашем исследовании среди пациентов с БА у 66,8% детей регистрировалась сенсибилизация к бытовым аллергенам (рис.3.5.). Второе место по частоте встречаемости занимала гиперчувствительность к пыльце деревьев, которая определялась у 21,9% детей с БА. Реже всего наблюдалась сенсибилизация к эпидермальным аллергенам, пыльце маревых и пищевым аллергенам. Таблица 3.4
Средний уровень общего IgE в сыворотке крови детей основной группы в различные возрастные периоды имел следующие значения: 4-6 лет -458,07±68,68 МЕ/мл, 7-Ю лет - 457,83±43,42 МЕ/мл, 11-14 лет - 462,07±35,65 МЕ/мл, 15-18 лет - 460,12±58,99 МЕ/мл (р 0,05) (рис. 3.7.).
Средние показатели иммунограммы детей основной группы выглядели следующим образом: IgA - 1,29±0,05 г/л, Ig М г/л -- 1,31±0,05 г/л, IgG г/л -11,86±0,27, ЦИК - 24,6±0,82 у.е. Анализ уровня средних значений иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови не выявил достоверной зависимости их от тяжести течения БА (р 0,05) (табл. 3.6.). Рис. 3.7. Средний показатель уровня сывороточного IgE (МЕ/мл) у детей с
Дефицит синтеза IgА является частым спутником атопии. Недостаточность гуморального иммунитета приводит к снижению местной защиты слизистых дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. По нашим данным 16,3% (n=32) детей основной группы имели селективную недостаточность IgА, которая отмечалась преимушественно (63,8%) у детей с легким течением БА. В анамнезе детей с данной патологией в 86,1% встречалось указание на кожные проявления аллергии. Дети основной группы с селективной недостаточностью IgА имели прямую корреляционную связь с нарушением функции внешнего дыхания по показателю ОФВ1 (р=0,02) и указанием в анамнезе на БА у родственников (р=0,047).
На сегодняшний день терапия БА направлена на устранение воспаления слизистой оболочки бронхов, уменьшение их гиперреактивности, восстановление бронхиальной проходимости и устранение бронхоспазма [Лещенко И.В., 2008]. Наиболее эффективными препаратами для контроля БА являются ИГКС.
На момент обследования все дети основной группы получали ИГКС в суточной дозе от 100 до 1000 мкг. по флутиказону пропионату, из них: 36,7% (n=72) находились на монотерапии ИГКС, 63,3% (n=124) - на комбинированной терапии (ИГКС+длительнодействующий 2-агонист). Средняя суточная доза ИГКС составила 277,1±41,4 мкг. Доза ИГКС зависела от тяжести (р=0,002) и периода заболевания (р=0,008), наличия сопутствующей ЛОР-патологии (р=0,01). Еще 41 пациент, поступивший по поводу обострения заболевания, получал комплексное лечение с дополнительными ингаляциями 2-агонистов короткого действия (преимущественно беродуал) через небулайзер. Монотерапию ИГКС получали 68,2% пациентов с контролируемым течением БА, 46,0% с частичным контролем. Комбинированные препараты чаще назначались детям с неконтролируемым течением астмы (83,7%) (табл. 3.7).
Анализ ассоциации полиморфного варианта rs2240017 гена транскрипционного фактора T-bet (TBX21) с развитием бронхиальной астмы
Генетический полиморфизм ацетилирования может влиять на патогенез различных многофакторных заболеваний, в том числе и БА [Lin H.J. et al., 1994; Голденкова-Павлова И.В. и др., 2001; Hamdy S.I. et al., 2003]. Следовательно, различные аллельные варианты гена NAT2 могут модулировать риск развития БА у лиц различной этнической принадлежности.
У детей с БА и здоровых респондентов из РБ нами проведен анализ трех полиморфных вариантов гена NAT2: rs1799929 (c.481С Т), rs1799930 (c.590G A (p.Arg197Glu)), rs1799931 (c.857G A (p.Gly286Glu)), которые соответствуют аллелям NAT2 5, NAT2 6 и NAT2 7. Данные аллели определяют фенотип медленного ацетилирования. Фенотип медленного ацетилирования преобладает на Ближнем Востоке (Египет, Морокко), где частота медленных ацетиляторов составляет 70,%. Среди негроидных популяций частота медленных ацетиляторов варьирует от 18,0 до 80,0%. В популяциях европеоидов эта частота составляет 50%, у монголоидного населения – 10-15% [Бочков Н. П., 2011]. По данным Голденковой-Павловой И.В. и соавт. распространенность «быстрых» и «медленных» ацетиляторов среди жителей г. Москвы статистически значимо не различается и составляет 44% и 47%, соответственно [Гол-денкова-Павлова И.В. и др., 2006].
Проведенный нами анализ распределения частот аллелей полиморфного варианта rs1799929 (c.481С Т) гена NAT2 не выявил достоверных отличий между основной группой и группой сравнения в общей выборке (р 0,05) (табл. 3.30.). Частота аллеля rs1799929 T в группах здоровых и больных БА была сопоставима и составила 33,17% и 34,5%, соответственно.
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs1799929 (c.481С Т) гена NAT2 в зависимости от степени тяжести заболевания, нами была выявлена ассоциация генотипа rs1799929 Т/Т со
Аллель rs1799929 Т определялся с частотой 32,05% у лиц с легкой формой БА, 40,79% – со средне-тяжелой формой и 34,15% у респондентов с тяжелой формой заболевания (табл. 3.30). Нужно отметить, что с увеличением тяжести заболевания у детей с БА частота гомозиготного генотипа rs1799929 С/С уменьшалась с 44,44% до 39,02%, а гетерозиготного генотипа rs1799929 С/Т увеличивалась с 47,01% до 53,66%.
Наши данные не согласуются с результатами исследования, которое показало, что аллель NAT2 481Т является протективным, а его отсутствие связано с развитием БА у детей [Makarova S.I. et al., 2000]. В работе Алимовой Ю.Б. и соавт. достоверных отличий в распределении частот генотипов по гену NAT2 в популяции и у больных БА не было выявлено [Алимова Ю.Б. и др., 2012].
Таким образом, в результате проведенного исследования полиморфного варианта rs1799929 (c.481С Т) гена NAT2 обнаружена ассоциация гомозиготного генотипа rs1799929 Т/Т со средне-тяжелым течением БА.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs1799930 (c.590G A (p.Arg197Glu)) гена NAT2 не выявило достоверных отличий между основной группой и группой сравнения в общей выборке (р 0,05). Частота аллеля rs1799930 А в группах здоровых и больных БА детей составила 26,73% и 29,85%, соответственно (табл. 3.33.-3.34.).
Исследование данного полиморфного варианта гена NAT2 не выявило ассоциаций с возрастом, полом и эффективностью терапии у детей с БА (р 0,05). Обнаружена ассоциация гетерозиготного генотипа rs1799930 C/A с легким снижением ЖЕЛ у больных БА – 65,71% по сравнению с 39,6% в группе здоровых индивидов (2=7,13; p=0,008; OR=2,92; CI95% 1,31-6,53), и гомозиготного генотипа rs1799930 А/A с умеренным/значительным снижением ЖЕЛ – 22,73% у больных, 6,93% в группе сравнения (2=5,12; p=0,02; OR=3,95; CI95% 1,12-13,9) (рис. 3.27.).
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs1799930 (c.590G A) гена NAT2 у больных БА с разной степенью тяжести заболевания, нами не было выявлено значимых отличий от здоровых индивидов (р 0,05) (табл. 3.32.). Частота аллеля rs1799930 A варьировала от 26,83% у детей с тяжелой формой БА до 30,34% у больных с легким течением заболевания.
При исследовании полиморфного варианта rs1799931 (c.857G A (p.Gly286Glu)) гена NAT2 не обнаружено значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между здоровыми индивидами и детьми с БА. Частота аллеля rs1799931 A и генотипа rs1799931 A/А составила 12,05% и 2,56% в общей выборке больных детей и 9,9% и 0,99% в группе сравнения. Полиморфный локус rs1799931 гена NAT2 не выявил также ассоциаций с возрастом, полом, данными ФВД и эффективностью терапии у детей с БА (р 0,05).
Выявлена ассоциация аллеля rs1799931 A (22,5%) с риском развития обострения БА по данным суточной вариабельности ПСВ (9,9%; p=0,03; OR=2,64; CI95% 1,10-6,33).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs1799931 гена NAT2 у больных БА с разной степенью тяжести выявил увеличение частоты аллеля rs1799931 A и генотипа rs1799931 A/А у детей с тяжелой БА (15,83% и 4,88%) по сравнению с группой сравнения (9,9% и 0,99%, соответственно) (табл. 3.34.).
Известно, что за развитие бронхиальной астмы ответственны не менее 100-150 генов, но достаточно малое число генов может определять основной вклад в генетическую этиологию данного заболевания. Для прогнозирования риска развития БА недостаточно оценивать влияние отдельных полиморфных локусов. Основу многофакторных заболеваний составляет взаимодействие генетических и средовых факторов. Такое взаимодействие приводит к формированию сложных генных сетей, в которых выделяют главные (центральные) гены, обеспечивающие координацию функций остальных элементов, и дополнительные (вспомогательные) гены, называемые иногда «гены–модификаторы», которые ускоряют и усугубляют патологический процесс [Колчанов Н.А. и др., 2000]. Для моделирования взаимодействия генов нами были использованы программы MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction) [Ritchie M.D. et al., 2001] и GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou X.Y. et al., 2007]. Программы MDR и GMDR были разработаны для поиска ген-генных и ген-средовых взаимодействий, в их основе лежит принцип редукции размерных величин. В программах MDR/GMDR мультилокусные генотипы суммируются в группы повышенного и пониженного риска развития заболевания, что позволяет уменьшить размерность числа рассчитываемых параметров. Важным преимуществом метода MDR/GMDR является возможность статистической оценки воспроизводимости тестируемых моделей, а также расчет точности предсказания модели путем отделения части данных в качестве независимого тестируемого набора. Таким образом, из всех предложенных вариантов моделей путем многократных проверок выбирается оптимальная модель ген-генного взаимодействия, которая с наибольшей точностью и низкой вероятностью ошибки прогнозирует наличие или отсутствие предрасположенности к заболеванию.
