Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы данные официальной статистики, представляемые органами управления здравоохранения разных стран, свидетельствуют о росте распространённости аллергических болезней, в том числе и бронхиальной астмы (БА), как во взрослой, так и в детской популяциях [Биличенко Т.Н., 1997; Научно-практическая программа. Бронхиальная астма у детей, 2004; Баранов А.А., 2011]. Однако, увеличение доли пациентов, страдающих БА, по данным официальных медицинских отчётов, может быть объяснено разными факторами. Так, например, рост распространённости болезни в популяции был зарегистрирован после внедрения в реальную клиническую практику международных регламентирующих документов по диагностике и лечению астмы, появления медицинских стандартов ведения таких больных, реализации образовательных программ для пациентов.
Результаты крупных стандартизированных (International Study of Asthma and Allergy in Childhood - ISAAC) эпидемиологических исследований относительно распространённости астмы в детской популяции, проведённых в 53 странах мира с интервалом в 5 лет и более, не подтверждают данных официальной статистики о росте распространённости БА в целом в популяции, хотя в некоторых регионах (отдельные города и населённые пункты Англии, Германии, США, России и др.) такая тенденция была обозначена исследователями [Neil Pearce, 2004; Мачарадзе Д.Ш., 2005; Намазова-Бакранова Л.С., 2009].
В этой связи сегодня актуальным является обсуждение вопроса относительно влияния на распространённость астмы и аллергии социально-экономических условий, а также многочисленных внешнесредовых факторов. Согласно данным отдельных эпидемиологических исследований, в течение последних десяти лет значительный рост распространённости аллергических болезней отмечается в развитых странах, в то же время уровень аллергопатологии в развивающихся регионах остается на прежнем уровне [., 2004; ., 2004; ., 2006]. Такие данные могут быть объяснены с позиции «гигиенической гипотезы», т. е. являются обусловленными различным уровнем жизни людей, когда экспозиция аллергенов, особенности питания и наличие гельминтной инфекции могут модифицировать риск развития аллергии [Strachan D.P., 1989].
Некоторыми исследователями показано, что от различных внешнесредовых факторов, например, гельминтной инвазии, зависит не только распространённость астмы в популяции, но и выраженность клинических проявлений болезни [ et al., 2000; Flohr et al., 2010]. По всей видимости, это может быть обусловлено модулирующим влиянием гельминтов на иммунную систему человека [ et al., 2007; Yang J et al., 2007; et al., 2010; Flohr et al., 2010]. Данные экспериментальных исследований демонстрируют обратную взаимосвязь наличия длительной гельминтной инвазии и активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА [ et al., 2009; , at al., 2010].
В настоящее время известно, что ключевую роль в патогенезе БА играет персистирующее воспаление респираторного тракта, следствием которого являются типичные симптомы болезни – приступы экспираторного удушья, одышка, кашель, а выраженность и частота вышеуказанных симптомов рассматриваются как основные критерии при оценке степени тяжести заболевания [GINA, 2009]. Говоря о персистирующем атопическом воспалении респираторного тракта, как о ключевом понятии в патогенезе астмы, нельзя не отметить роль апоптоза в формировании и поддержании воспалительного процесса.
Накопление эозинофилов в очагах воспаления зависит от ряда факторов, таких как селективная адгезия и миграция, а также повышение жизнеспособности в ответ на воздействие факторов роста (ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-6). Внутриклеточные медиаторы, высвобождаемые эозинофилами при БА, как известно, обладают гистотоксическим эффектом, вызывая повреждение тканей и воспаление дыхательных путей. Для ограничения этого повреждающего действия в нормальных условиях эозинофилы элиминируются путём апоптоза [Lamb, J.P. at al., 2005; Walsh GM at al., 2005]. Однако, отмечено, что при БА эти клетки гибнут преимущественно по некротическому пути (супрессия апоптоза), высвобождая медиаторы воспаления и провоспалительные цитокины.
В связи с этим, апоптотическая гибель эозинофилов рассматривается как важный механизм ограничения воспалительного процесса. Сегодня мы располагаем собственными данными (n=100, возраст 11,3±0,71 лет, проспективное исследование) относительно особенностей регуляции системы апоптоза эозинофилов при астме у детей. Установлено, что степень апоптоза эозинофилов у пациентов, страдающих БА, ассоциирована с клиническими проявлениями болезни, функциональными параметрами и показателями, отражающими степень воспалительной активности дыхательных путей [Огородова Л.М. с соавт., 2005].
Результаты проведённых нами исследований свидетельствуют, что при астме у детей апоптотическая активность эозинофилов снижена за счёт высокой экспрессии антиапоптотических эффекторов (bcl-2, bcl-xL, bcl-w, ИЛ-5) и конституитивно низкой активности мРНК проапоптотических факторов (bах, bcl-xS, bak, p53), что обусловливает увеличение клеток, гибнущих по некротическому пути, а, следовательно, приводит к поддержанию воспалительной активности в дыхательных путях за счёт гистотоксического эффекта, оказываемого провоспалительными медиаторами эозинофилов [Zhai D. At al., 2003; Огородова Л.М. с соавт., 2005]. При этом назначение противовоспалительной терапии БА ассоциировано не только с восстановлением клинических и функциональных параметров болезни, но и увеличением апоптотической активности эозинофилов [Сазонов А.Э. с соавт., 2006].
На сегодняшний день опубликовано достаточное количество данных относительно влияния гельминтной инвазии на степень апоптотической активности иммунокомпетентных клеток, в том числе эозинофилов и мононуклеаров периферической крови. Многие исследователи полагают, что это защитный механизм, реализуемый глистами для собственной «маскировки» от иммунной системы хозяина (человека) [ et al., 2010]. Так, в некоторых исследованиях показано, что инвазия ленточного червя Taenia crassiceps ассоциирована с увеличением апоптотической активности эозинофилов периферической крови человека [Copitin N. et al., 2010]. Подобные эффекты описаны at al. (2010), et al. (2010) у животных in vivo и in vitro (кровь животных и человека), при этом авторы предполагают, что активация каспазного каскада в клетках иммунной системы обусловлена экскреторно-секреторными продуктами гельминта (ЭСП – продукты жизнедеятельности).
Другие исследователи описывают эффект, индуцирующий апоптоз, при инвазии лёгочного сосальщика Paragonimus westermani [Shin MH, 2000; et al., 2004]. Установлено, что регуляция апоптотической активности при данном гельминтозе, прежде всего, связана с активацией каспазы-3 ЭСП и снижением экспрессии ИЛ-5, ИЛ-3 и ГМКСФ, при этом авторы приводят данные об отсутствии зависимости степени апоптоза эозинофилов периферической крови человека от фазы инфекции и количества особей гельминта.
Усиление апоптоза эозинофилов и нейтрофилов описано при шистосоматозе (Schistosomes). Исследователи указывают на два возможных механизма увеличения апоптотической активности – активация каспазного каскада в клетке (каспаза 3) и взаимодействие ЭСП гельминта с FAS – рецептором [ et al., 2005]. Подобные исследования проведены для Fasciola hepatica, Trichinella spiralis, Ascaris, Filarial, Heligmosomoides polygyrus (нематоды), при этом, результаты, представленные авторами относительно активации апоптоза иммунокомпетентных клеток (эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты), являются сопоставимыми [Matsumoto K. At al., 2007; Muoz-Guzmn M.A. at al., 2010; Park H.K. at al., 2011].
Помимо приведённых данных относительно влияния гельминтной инвазии на механизмы регуляции апоптотической активности иммунокомпетентных клеток, в специализированной медицинской литературе есть информация, свидетельствующая о модифицирующем влиянии гельминтозов на уровень провоспалительных маркеров (ИЛ-5, ИЛ-4) и клинические параметры, отражающие активность воспаления дыхательных путей при астме [Огородова Л.М. с соавт., 2002]. Так, в исследовании, опубликованном Евдокимовой Т.А. с соавт., 2002 (n=150, возраст от 6 до 16 лет) показано, что при БА, сочетанной с описторхозной инвазией, пациенты имеют меньшую степень гиперреактивности дыхательных путей, большие значения ОФВ1 и ПСВ в сравнении с неинфицированными детьми, страдающими астмой. При этом в случае сопутствующего паразитоза отмечены достоверно низкие значения ИЛ-5 и ИЛ-4 в периферической крови пациентов, меньшее количество эозинофилов назального секрета и индуцированной мокроты в сравнении с детьми без гельминтной инвазии. Проведение дегельминтизации (через 4 недели наблюдения) было ассоциировано с увеличением реактивности бронхов к метахолину и повышением уровня провоспалительных цитокинов в периферической крови пациентов.
Исследования, опубликованные Flohr et al. (2010), также свидетельствуют о снижении уровня провоспалительных цитокинов при различных аллергических болезнях в хроническую фазу гельминтной инвазии, а также об увеличении активности апоптоза Т-клеток, экспрессии ИЛ-10 и ИЛ-2. По всей видимости, заражение человека гельминтами может рассматриваться как фактор, предотвращающий прогрессирование воспаления при атопической БА.
Таким образом, приведённые данные свидетельствуют, что гельминты вносят существенный вклад как в распространённость астмы в популяции, так и в особенности клинического течения болезни (модулируют воспалительную активность в дыхательных путях). Учитывая тот факт, что Западная Сибирь является гиперэндемичным очагом описторхоза, а поражённость местного населения данным гельминтом на отдельных территориях достигает 44-97%, изучение роли гельминтных инвазий в механизмах регуляции воспаления при БА у детей является актуальной задачей в гиперэндемичных по распространенности гельминтозов регионах [Балашева И.И., с соавт., 1990; Бронштейн А.М. с соавт., 2004; Огородова Л.М. с соавт., 2009; Колчанов Н.А., 2010]. Изучение эпидемиологической характеристики механизмов регуляции апоптоза эозинофилов в популяции детей, больных БА, и здоровых пациентов в зависимости от гельминтной инвазии позволит сформулировать новые положения гигиенической гипотезы и представит возможность идентификации молекулярных мишеней для разработки методов первичной профилактики астмы у детей, проживающих в гиперэндемичных регионах по О. felineus.
Цель: установить особенности регуляции апоптоза эозинофилов при хроническом описторхозе как механизма, определяющего клинико-эпидемиологическую характеристику бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном очаге О. felineus.
Задачи:
-
Оценить уровень заболеваемости хроническим описторхозом и распространённость гельминтной инвазии О. felineus в детской популяции Томской области в зависимости от района проживания детей.
-
Изучить уровень заболеваемости и клинические особенности течения бронхиальной астмы, сочетанной с инвазией О. felineus, и без гельминтоза в детской популяции по данным регистра больных астмой и программы мониторинговой диспансеризации детей Томской области «ДИСПАН».
-
Оценить продукцию цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИФН- ), а также уровень мРНК супрессоров (bcl-2, bcl-xL, ИЛ-5) и агонистов (bах, bcl-xS, p53) апоптоза эозинофилов у здоровых, при бронхиальной астме сочетанной с инвазией О. felineus и без неё в популяции детей г. Томска и Томской области.
-
Изучить активность каспазы - 3 в эозинофилах периферической крови у детей, больных бронхиальной астмой, инфицированных О. felineus и без гельминтной инвазии; сопоставить полученные результаты с аналогичными параметрами в группе здоровых детей.
-
Установить вклад описторхоза в механизмы регуляции апоптоза эозинофилов периферической крови у детей, страдающих бронхиальной астмой, сопоставить полученные результаты с аналогичными параметрами в группе здоровых детей.
-
Провести сравнительный анализ клинико-функциональных параметров бронхиальной астмы у детей, проживающих в регионе с высокой и низкой распространенностью описторхозной инвазии, и изучить ассоциацию этих параметров с показателями апоптоза в группах детей с наличием или отсутствием инвазии О. felineus.
-
Изучить эффективность используемой фармакотерапии бронхиальной астмы у детей в популяции с низкой и высокой распространённостью О. felineus и сопоставить полученные данные с показателями апоптотической активности эозинофилов (как маркёра воспалительной активности).
Научная новизна. Впервые в российской клинической практике выполнено клинико-эпидемиологическое исследование бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном регионе по О. felineus. Впервые с целью верификации наличия инвазии О. felineus применен ПЦР – анализ (полимеразная цепная реакция), установлено, что распространенность гельминтоза, вызываемого О. felineus, в детской популяции в Томской области составляет 27,68%. Впервые на основании данных ПЦР – анализа проведено разделение районов Томской области на эндемичные и гиперэндемичные территории по уровню распространённости инвазии О. felineus.
Приоритетными являются данные о клинико-эпидемиологической характеристике бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном очаге О. felineus. Впервые проведён анализ заболеваемости бронхиальной астмой в детской популяции Томской области (n=143853, возраст от 0 до 17 лет) в зависимости от уровня распространённости инвазии О. felineus. Установлено, что данный показатель значимо различался в эндемичных и гиперэндемичных районах, при этом заболеваемость астмой была ниже в территориях, имеющих высокие показатели распространённости О. felineus (эндемичные районы – 90,95 на 1000 населения соответствующего возраста, гиперэндемичные районы – 57,15 на 1000; p<0,001).
Впервые показано, что пациенты, страдающие бронхиальной астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, имеют меньшую степень неспецифической реактивности дыхательных путей, а также низкую интенсивность кожной реакции при проведении кожных аллергопроб (prick-тест) в сравнении с детьми, больными изолированной астмой.
Новыми являются данные об особенностях цитокинового профиля у детей, страдающих астмой в зависимости от наличия инвазии О. felineus. Установлено, что хронический описторхоз сопряжён с низким уровнем провоспалительных цитокинов Th2 – профиля (ИЛ-4, ИЛ-5) и высоким содержанием ИЛ-2 и ИЛ-10. Впервые представлены данные (полученные на репрезентативной выборке) свидетельствующие об угнетении Тh2 – варианта иммунного ответа у детей, больных астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, что ассоциировано с низкой активностью воспаления у таких больных (низкая неспецифическая реактивность дыхательных путей, низкая интенсивность кожной реакции при проведении prick - тестирования).
Впервые проведен анализ апоптотической активности эозинофилов при бронхиальной астме у детей на фоне сопутствующей хронической инвазии О. felineus. Установлено, что изолированная астма характеризуется высоким уровнем мРНК антиапоптотических (ИЛ-5, bcl-2) и конститутивно низкой экспрессией мРНК проапоптотических модуляторов апоптоза (bax, bcl-xS, p53), что сопряжено с массивной гибелью эозинофилов по некротисческому пути, и как следствие этого, с гистотоксическим влиянием медиаторов, выделямых эффекторными клетками воспаления. В случае наличия сочетанной патологии (БА + хронический описторхоз) содержание мРНК антиапоптотичсеких эффекторов (ИЛ-5, bcl-2) резко снижено и сопоставимо с аналогичными параметрами в группе контроля, что свидетельствует о значимом протективном влиянии хронической инвазии О. felineus на регуляцию воспаления при астме у детей.
Получены новые данные об активности ключевого фермента, запускающего каспазный каскад – каспаза-3 при астме, сочетанной с хронической инвазией О. felineus. Важное теоретическое значение имеют экспериментальные данные, демонстрирующие, что наличие хронического описторхоза при бронхиальной астме сопряжено с увеличением активности каспазы-3 в эозинофилах периферической крови в сравнении с пациентами, страдающими изолированной астмой, что свидетельствует о восстановлении механизмов регуляции программируемой клеточной гибели эффекторных клеток на фоне гельминтной инвазии. Впервые сопоставлены данные, характеризующие степень акивности апоптоза эозинофилов с клиническими параметрами болезни у детей, страдающих бронхиальной астмой в зависимости от наличия хронической инвазии О. felineus. Установлено, что активность каспазы-3 и уровень мРНК антиапоптотических эффекторов обратнопропорциональны степени реактивности дыхательных путей, и как следствие этого, степени активности воспаления при астме.
Полученные данные корреспондируют с результатами некоторых зарубежных исследований, проведённых в популяциях пациентов, страдающих астмой в сочетании с другими трематодозами, что подчёркивает научную ценность и воспроизводимость полученных в рамках нашего исследования результатов.
Практическая значимость. Полученные данные об особенностях эпидемиологической характеристики бронхиальной астмы в детской популяции в Томской области (в очаге, эндемичном по О. felineus) могут быть рекомендованы к использованию при планировании эпидемиологических исследований в аналогичных территориях (эндемичность по гельминтной инвазии). Также представленные в работе результаты, касающиеся особенностей заболеваемости астмой у детей в эндемичном очаге гельминтоза, должны учитываться при исследовании влияния внешнесредовых факторов риска и планировании диагностических и лечебных мероприятий органами управления здравоохранением.
Полученные данные относительно особенностей клинической характеристики астмы у детей на фоне хронического гельминтоза (низкий уровень неспецифической реактивности дыхательных путей, низкая интенсивность реакции при кожном аллергологическом тестировании) должны учитываться в реальной клинической практике при диагностике астмы в случае наличия инвазии О. felineus у детей.
Установленные механизмы регуляции программируемой клеточной гибели эозинофилов при астме в зависимости от наличия гельминтной инвазии позволяют предположить, что дегельминтизация может привести к увеличению активности аллергического воспаления в дыхательных путях, повышению уровня реактивности дыхательных путей, что требует изменения протоколов ведения таких пациентов, дополнительного мониторинга контроля бронхиальной астмы, изменения объёма противовоспалительной терапии.
Установленные особенности регуляции апоптоза эозинофилов у детей, страдающих бронхиальной астмой, сочетанной с гельминтной инвазией (низкий уровень провоспалительных цитокинов, сниженная экспрессия мРНК антиапоптотических эффекторов, высокая активность каспазы-3) и ассоциированные с апоптотической активностью клинические параметры астмы, характеризующие активность воспаления (низкая степень неспецифической реактивности дыхательных путей и интенсивность реакции при проведении кожного аллерготестирования) могут быть использованы как теоретические знания для разработки новых фармакологических стратегий лечения и профилактики бронхиальной астмы и других аллергических болезней у детей.
Используемые в работе методы (ПЦР – диагностика О. felineus, оценка уровня мРНК антиапоптотических и проапоптотических эффекторов, определение активности каспазы-3) могут быть рекомендованы для применения в реальной клинической практике с целью верификации инвазии О. felineus, а также для детекции активности воспаления при бронхиальной астме у детей.
Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на XIII Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Томск, 2009 г.), XIV Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Москва, 2010 г.), XVI Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Москва, 2011 г.), X Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2009 г.), на XII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2011 г.), на проблемной комиссии по педиатрии, на заседаниях кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета СибГМУ (г. Томск, 2009 - 2011 г.г.).
Внедрение полученных результатов. Полученные результаты используются в работе Областного детского центра клинической иммунологии и аллергологии (ОГУЗ «Областная детская больница», г. Томск), отделении клинической иммунологии и аллергологии МЛПУ №4 г. Новокузнецка. Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета для студентов педиатрического, лечебного, медико-биологического факультетов, на кафедре общей врачебной практики ФПК и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, кафедре фармакологии, клинической фармакологии с курсом аллергологии и клинической иммунологии ГОУ ВПО ХМАО-Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», на кафедре педиатрии медицинского института ГОУ ВПО ХМАО-Югры «СурГУ».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, включая 20 статей в журналах, реферируемых ВАК РФ, 1 из которых опубликована в зарубежном журнале, цитируемом в базе данных Web of Science. Издана 1 монография, 5 клинических рекомендаций для педиатров «Аллергология и иммунология», 1 учебное пособие, рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по специальности 040200 - педиатрия.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 248 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и 21 таблицей. Список источников цитируемой литературы включает 337 работ, из которых 53 отечественных и 284 зарубежных публикаций.
