Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Криптококк и криптококкоз 11
1.1 Характеристика комплекса видов Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii 11
1.2 Патогенность криптококков 16
1.2.1 Основные факторы патогенности С. neoformans и С. gattii 16
1.2.2 Другие факторы патогенности С. neoformans 20
1.3 Клинические варианты и факторы риска развития криптококкоза 23
ГЛАВА 2 Штаммы С. neoformans и врожденный иммунный ответ 26
2.1 Взаимодействие С. neoformans с макрофагами 26
2.1.1 Паттерн-распознающие рецепторы 26
2.1.1.1 Маннозный рецептор 27
2.1.1.2 Дектин-1 29
2.1.1.3 Toll-рецепторы 31
2.2 Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе 32
2.2.1 Компоненты комплемента 32
2.2.2 Антитела 33
2.3 Факторы микробоцидности макрофагов 34
2.3.1 Кислородзависимые факторы микробоцидности 34
2.3.1.1 Образование активных продуктов кислорода 34
2.3.1.2 Реактивные промежуточные продукты азота 36
2.3.2 Кислороднезависимые факторы микробоцидности 37
2.4 Медиаторы иммунного ответа 38
2.5 Резистентность к антифунгальным препаратам при криптококковой инфекции з
Экспериментальная часть
ГЛАВА 3 Объекты и методы исследования 46
3.1 Объекты исследования 46
3.1.1 Штаммы Cryptococcus neoformans 46
3.1.2 Экспериментальные животные 47
3.2 Методы исследования 48
3.2.1 Морфология культур С. neoformans 48
3.2.2 Видовая идентификация Cryptococcus neoformans 48
3.2.3 Определение вирулентности криптококков на лабораторных животных 50
3.2.4 Определение фенолоксидазной активности С. neoformans 51
3.2.5 Получение перитонеальных макрофагов и культивирование их in vitro 51
3.2.6 Определение фагоцитарной активности макрофагов 52
3.2.7 Методы определения факторов микробоцидности 53
3.2.7.1 Продукция нитроксид анионов 53
3.2.7.2 Продукция супероксид анионов в тесте с нитросиним тетразолием 54
3.2.8 Определение уровня продукции цитокинов макрофагами 55
3.2.9 Определение цитотоксической активности перитонеальных макрофагов 56
3.2.10 Методы определения чувствительности С. neoformans к антифунгальным агентам различного происхождения 56
3.2.10.1 Определение чувствительности С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу (CLSIМ44-А) 56
3.2.10.2 Определение чувствительности к протегринам методом серийных разведений 58
3.2.11 Методы статистического анализа полученных данных 59
ГЛАВА 4 Морфо-биологическая характеристика штаммов С. neoformans 61
4.1 Происхождение изолятов С. neoformans 61
4.2 Морфологическая и биологическая характеристика клинических изолятов С. neoformans 64
4.3 Определение патогенности криптококков на экспериментальных животных 68
ГЛАВА 5 Взаимодействие штаммов C.neoformans разной вирулентности с перитонеальными макрофагами in vitro 71
5.1 Фагоцитарная активность макрофагов в отношении С. neoformans 71
5.2 Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на продукцию факторов микробоцидности перитонеальными макрофагами 77
5.2.1 Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на способность макрофагов к продукции супероксиданионов in vitro. 11
5.2.2 Влияние штаммов С. neoformans на способность макрофагов продуцировать нитроксидные радикалы in vitro 78
5.3 Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к штаммам С. neoformans разной вирулентности 82
5.4 Оценка спектра цитокинов, вырабатываемых макрофагами, при взаимодействии с криптококками in vitro 84
5.5 Чувствительность штаммов С. neoformans разной вирулентности к азоловым препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения 89
ГЛАВА 6 Заключение 94
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Перспективы дальнейшей разработки темы 109
Список литературы по
- Патогенность криптококков
- Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе
- Определение фенолоксидазной активности С. neoformans
- Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к штаммам С. neoformans разной вирулентности
Патогенность криптококков
В настоящее время к основным факторам патогенности криптококков относятся: способность к образованию полисахаридной капсулы и меланина, рост при 37 С, экспрессия уреазы, фосфолипазы и тип спаривания [263, 274] . Особые споры ведутся о способности криптококков к образованию полисахаридной капсулы и меланина, как о хорошо известных и изученных составляющих патогенности с одной стороны и, оказывающих множественное, разнонаправленное действие на иммунную систему макроорганизма, с другой [27, 74, 34, 126]. Помимо основных факторов вирулентности, существует большое количество белков и ферментов, которые недавно стали ассоциировать с вирулентностью криптококка.
Адаптация микроорганизмов к окружающей их среде часто ассоциируют с выработкой свойств, которые помогают выживать в определенных условиях. Одним из таких свойств, характерным для многих микроорганизмов, являются их капсулы. В окружающей среде, капсула играет важную роль в защите организма против неблагоприятных условий, например таких, как обезвоживание [255].
Клетки С. neoformans микроскопически в тканях и в культуре характеризуются как капсулированные сферические дрожжи. Размер капсулы зависит от штамма и условий культивации. Штаммы с капсулой среднего размера чаще всего имеют диаметр клетки 4-10 мкм, слабо капсулированные штаммы - 2-5 мкм, в то время как диаметр клетки сильно капсулированных изолятов достигает 80 мкм [58]. Размер криптококковой капсулы изменяется в зависимости от условий окружающей среды. У природных изолятов С. neoformans редко определяется большая капсула, в отличие от клинических. Микромицеты, для того, чтобы они смогли бы проникнуть в альвеолы через верхние дыхательные пути, должны иметь диаметр менее 4 мкм [58]. Однако, при развитии инфекции, капсула динамически увеличивается в размере и изменяется в зависимости от локализации процесса. Например, ткани легких и головного мозга, действуют как активный индуктор роста капсулы [209]. Размер капсулы может также экспериментально модулироваться путем выращивания С. neoformans на жидком бульоне Сабуро в присутствии сыворотки, или в среде с низким содержанием железа [230, 280]. Эти условия существуют во внутренней среде макроорганизма и могут, таким образом, способствовать увеличению капсулы [185].
Криптококковая капсула состоит в основном из полисахарида, при этом содержание воды в ней составляет 99 % всего веса. Полисахаридная капсула обладает отрицательным зарядом, обусловленным карбоксильным остатком глюкуроновой кислоты в полисахариде. Полисахариды капсулы - физически организованные волокна, которые можно наблюдать при электронной микроскопии [57, 226]. Плотность волокон и молекул полисахарида изменяются согласно пространственному расположению.
Капсула состоит из двух типов полисахаридов: глюкуроноксиломаннана (GXM) и галактоксиломаннана (GalXM). GXM составляет приблизительно 90-95%, a GalXM - 5-8% от общей массы полисахарида. Кроме того, в составе капсульного полисахарида идентифицировано 1-3 % маннопротеинов и следы сиаловых кислот. Роль этих компонентов в архитектонике капсулы остается неизвестной [217].
На основании анализа GXM, выделенного из супернатанта грибов, установлено, что этот компонент имеет высокую молекулярную массу со сложной структурой. Средняя молекулярная масса может варьировать от 1700 до 7000 kDa в зависимости от штамма. Структурно, главная цепь GXM состоит из линейного а-(1,3)-маннана с Р-(1,2)-глюкуроновым кислотным остатком, формируя основной кор, который является повторяющейся единицей для всех серотипов. Маннозные остатки могут быть 6-О-ацетильными и могут быть заменены на ксилозильные единицы Р-(1,2)-или Р-(1,4) - происхождения, в зависимости от серотипа. Соотношения ксилозы, маннозы и глюкуроновых кислотных остатков изменяются в зависимости от серотипа в пропорции 1:3:1, 2:3:1, 3:3:1 и 4:3:1 для серотипов D, А, В и С, соответственно.
GalXM содержит в своей основе а-(1,6) - галактан и четыре коротких олигосахаридных ответвленных структуры, состоящих из а-(1,3) - маннозы и а-(1,4) - маннозы, Р-галактозидазы с различным количеством Р-(1,2)- или Р-(1,3) -ксилозных групп [193]. Композиционным анализом GalXM, подтвержденным газовой хроматографической масс-спектрометрией, показано содержание в полисахариде: ксилозы -22 %; маннозы -29 % и галактозы-50 % [88].
В некоторых экспериментальных исследованиях установлено, что штаммы без капсулы менее вирулентны, чем клетки грибов с большой капсулой, поэтому изучению влияния капсульного полисахарида С. neoformans на течение инфекционного процесса посвящено много экспериментальных работ. Важность капсулы как фактора вирулентности подтверждается и тем фактом, что штаммы С. neoformans, у которых отсутствует капсула, значительно реже вызывают заболевание криптококкозом [30]. Однако, хотя наличие капсулы и способствует значительному вкладу в вирулентность С. neoformans, это - не единственное условие. Многие из non-neoformans криптококков обладают капсулой и не являются патогенными [185]. Также, в одном из исследований, штамм С. neoformans без капсулы являлся причиной персистирующей инфекции головного мозга безтимусных мышей, чего не наблюдалось у мышей только с дефектами врожденного иммунитета [58]. Из этого следует, что при существенном повреждении иммунитета даже штаммы без капсулы сохраняют потенциал вирулентности [185].
Показано, что этот структурный полимер обладает иммуномодулирующими свойствами и способствует выживанию криптококков в пределах макроорганизма [255, 204]. Например, капсула ингибирует фагоцитоз С. neoformans макрофагами в отсутствии опсонинов [170] и препятствует перевариванию в фагосоме [261]. Высокие уровни антигенов капсульного полисахарида в спинномозговой жидкости могут изменять осмолярность ЦСЖ [109]. Кроме того, показано, что капсульный материал подавляет миграцию фагоцитов (например, нейтрофилов) [102, 101, 107], вмешивается в цитокиновую секрецию [55, 56], способен напрямую ингибировать Т-клеточную пролиферацию [278] и препятствовать созреванию и активации дендритных клеток [258, ПО].
Способность С. neoformans к выработке меланина была обнаружена Штайбом в 1960-ые годы [216]. Меланин - отрицательно заряженный, гидрофобный пигмент с высоким молекулярным весом, который сообразуется путем окислительной полимеризации фенольных составляющих [59]. Синтез меланина у С. neoformans катализируется лакказой в присутствии некоторых о-дифенольных составляющих, таких как 3,4-дигидрофенилаланин (L-ДОФА) [275]. Лакказа - гликопротеин, локализующийся в клеточной стенке гриба. Такая локализация выгодна для криптококка по двум причинам [271, 273]. Во-первых, возникает препятствие для проникновения в цитоплазму потенциально токсичных побочных продуктов меланогенеза, и, во-вторых, отложение меланина на клеточной стенке защищает криптококк от токсинов, антибиотиков и других вредных факторов. В действительности, меланизированные штаммы С. neoformans гораздо более устойчивы к антифунгальным препаратам (амфотерицину, флуконазолу, каспофунгину), чем немеланизированные [106]. Следовательно, меланогенез развился для обеспечения защиты от воздействия вредных условий окружающей среды [242, 272]. Другими авторами продемонстрировано, что клетки С. neoformans, выделенные из мозговой ткани больных криптококкозом - меланизированные [111], а исследования по разрушению гена, ответственного за образование меланина, указывают, что меланин-продуцирующие С. neoformans являются более вирулентными [59]. Важно обратить внимание на тот факт, что некоторые non-neoformans криптококки, например Cryptococcus podzolicus, также способны образовывать меланин [26], хотя и не являются патогенными [185, 215].
Различные виды меланинов обладают иммуномодулирующей активностью посредством ингибирования синтеза провоспалительных цитокинов [103, 36, 41, 251]. Меланизированные клетки более резистентны к поглощению и киллингу фагоцитами [103]. Вероятное объяснение этого феномена состоит в том, что фагоцитоз нарушается за счет снижения электрического заряда клеточной стенки, и, благодаря своим электрохимическим свойствам, меланин может выступать как донором, так и акцептором электронов [194, 198]. Также меланин защищает патогены от воздействия таких факторов микробоцидности как выработка фагоцитарными клетками супероксиданиона и оксида азота. Было показано, что меланин имитирует действие супероксиддисмутазы, дополнительно препятствуя действию "респираторного взрыва" [229].
Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе
Успех антифунгальной этиотропной терапии зависит от определения чувствительности выделенных от больного грибов к противогрибковым препаратам. Всего в арсенале противогрибковых средств насчитывается свыше ста наименований и более двадцати форм лекарственных препаратов [16]. Основными препаратами, применяемыми при лечении криптококкоза в настоящее время являются амфотерицин В (АмВ) и флуконазол. Амфотерицин В относится к антифунгальным препаратам широкого спектра действия из ряда полиенов и является препаратом выбора при лечении большинства инвазивных микозов. АмВ обладает мощным фунгицидным эффектом, обусловленным прямым и необратимым связыванием с эргостерином клеточной мембраны грибов и индукцией активных форм кислорода в клетке. Главным достоинством АмВ является медленное развитие к нему резистентности, несмотря на сорокалетний опыт широкого применения. Поэтому неэффективность лечения, связанная с развитием устойчивости к АмВ, явление редкое. Однако большим недостатком амфотерицина В является его способность вызывать нефротоксичность, возможные дисфункции нервной системы и другие побочные явления. Флуконазол - препарат из группы азолов, обладает высокой специфичностью по отношению к зависимым от цитохрома Р450 ферментам грибов. Поэтому при использовании флуконазола не наблюдают побочного действия на синтез стероидов и других метаболических процессов, связанных с этими цитохромами. Но в последние годы растет резистентность штаммов криптококка к препарату и в настоящее время устойчивость достигает порядка 15 % [250, 5]. Вориконазол -синтетическое производное флуконазола, триазол, который обладает широким спектром противогрибковой активности. Вориконазол продемонстрировал высокую активность против С. neoformans in vitro, и в настоящее время уже доказана его клиническая эффективность [269, 270, 183]. Однако появляются новые данные, свидетельствующие о постепенном развитии устойчивости штаммов С. neoformans к вориконазолу [20, 212]. Высокая токсичность амфотерицина В и растущая резистентность штаммов криптококка к флуконазолу [85, 156] подчеркивают необходимость улучшения имеющихся методов лечения и возможность применения новых препаратов [81].
Поиск новых подходов к терапии криптококкоза в связи с ростом СПИД-ассоциированных заболеваний и развитием резистентности С. neoformans к антифунгальным препаратам, рассматривать новые и, возможно, более эффективные агенты с антикриптококковой активностью в качестве перспективных объектов для фармакологических исследований. В настоящее время в условиях in vitro в качестве таких объектов рассматриваются различные катионные пептиды, обладающие антимикробной активностью. Синтетический катионный пептид - доластин -10 проявляет фунгицидную активность против С. neoformans, используя в качестве мишени интрацеллюлярный тубулин. Из этой группы пептидов доклиническое испытание проходит микопрекс (Хота), полученный из человеческого BPI-фактора, продуцируемого нейтрофилами [16]. Естественные антимикробные пептиды животного происхождения включают в себя дефенсины, кателицедины, протегрины, цекропины, магейнины и др. Конечным результатом микробоцидного действия рассматриваемых пептидов является деполяризация мембран, нарушение их целостности, ведущее к утечке ионов из клетки и нарушению процессов жизнедеятельности микроорганизмов, приводящее к их гибели. Таким образом, антимикробное действие пептидов не связано с каким-либо известным в настоящее время энзиматическим механизмом [11].
Сходным образом действуют описанные отечественными исследователями совместно с американскими учеными катионные пептиды из нейтрофилов свиньи - протегрины [223]. Известны три основные фракции протегринов PG-1, PG-2, PG-3, являющиеся близкими изоформами. Молекулярная масса протегринов составляет 2000 Da. Благодаря этому, протегрины являются более перспективным объектом для химического синтеза и фармакологических исследований, чем дефенсины. Антимикробная активность PG-1 сопоставима с таковой дефенсина кролика NP-1 [223]. Но в других работах было показано, что не все штаммы С. neoformans являются восприимчивыми к дефенсину кролика NP-1. Остается неясным, влияет ли капсула на восприимчивость С. neoformans к NP-1. Получены данные, по которым установлены аналогичные показатели MIC50 и MFC и для штаммов с выраженной полисахаридной капсулой и для штаммов без капсулы, которые колебались от 3,75 мкг/мл до 15 мкг/мл [123]. Противоположные данные были получены авторами, которые изучали чувствительность биопленок С. neoformans к разным классам антимикробных пептидов, производимых фагоцитарными клетками. Было определено влияние особенностей строения капсулы разных штаммов криптококков на их чувствительность к дефенсинам, протегринам и магейнинам. Установлено, что величина капсулы биопленок разных штаммов грибов колебалась в широких пределах и не влияла на чувствительность криптококков к антимикробным пептидам. Но в данной работе было выявлено, что биопленки без меланина были более восприимчивы к антимикробным пептидам, чем биопленки с высоким содержанием меланина [190].
Данных отечественной и зарубежной литературы о чувствительности штаммов С. neoformans в зависимости от вирулентности к антимикробным пептидам протегринам, мы не обнаружили.
Таким образом, взаимодействие криптококков с макрофагами является центральным эффекторным механизмом в формировании иммунного ответа к С. neoformans [139, 159, 214]. В большинстве случаев проведенные исследования по оценке особенностей этого взаимодействия были основаны на сравнении небольшого числа штаммов С. neoformans, являющихся, в том числе, и генетически-модифицированными авирулентными мутантами. Поэтому для понимания механизмов врожденного иммунного ответа необходима оценка вирулентности штаммов С. neoformans, полученных от больных криптококкозом и её влияние на все этапы фагоцитарного процесса при непосредственном взаимодействии макрофагов с криптококками.
Определение фенолоксидазной активности С. neoformans
Клетки макрофагов в концентрации 1х106/мл вносили в лунки 96-луночного планшета в количестве 0,1 мл. Добавляли равный объем среды RPMI с 10% ЭТС без ЛПС или с ЛПС в дозе 1 мкг/мл ; инкубировали 18 ч при 37 С С02-инкубаторе. Затем супернатант удаляли, к макрофагам добавляли 100 мкл культуры С. neoformans в концентрации 1х105/мл (соотношение 10:1), и равный объем полной среды. Во всех опытах проводилась постановка контроля криптококков без макрофагов. Через 48 часов совместной инкубации макрофагов и криптококков в С02-инкубаторе полученный супернатант удаляли. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета вносили 100 мкл 0,02% додецил-сульфат натрия (Sigma), суспендировали и лизат добавляли в пробирки. Клетки дополнительно отмывали в 200 мкл стерильной дистиллированной Н20. Из полученной смеси готовили разведение в соотношении 1:10, затем 100 мкл образца засевали на чашки Петри с плотной средой Сабуро, с последующей инкубацией в термостате при 37 С в течение 72 часов. Каждый эксперимент проводили в двукратной повторности. Киллерную активность оценивали как процент жизнеспособных клеток грибов после инкубации с макрофагами по сравнению с контрольным ростом грибов без макрофагов.
При определении чувствительности к противогрибковым препаратам диско-диффузионным методом (CLSI М44-А) использовали бумажные диски диаметром 6 мм, пропитанные флуконазолом - содержание препарата в диске 25 мкг (Oxoid) и вориконазолом, - содержание препарата в диске 1 мкг (Oxoid) [67]. Взвеси С. neoformans приготавливали из выращиваемых в течение 3 суток при +37С культур на агаре Сабуро в чашках Петри, затем клеточную массу снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с 0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 ЕД по Мак-Фарланду. Взвесь распределяли по всей поверхности чашки с агаром Мюллера-Хинтон с добавлением 2% глюкозы и 0,5 мкг/мл метиленового синего одноразовым стерильным тампоном (хлопок-дерево). Инкубацию проводили при 35 С 18-24 часа [67]. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли с помощью микробиологического анализатора ВІОМІС Vision (Giles Scientific, США) по образующейся зоне задержки роста. Для контроля качества постановки опытов по определению чувствительности к антимикотическим препаратам использовали штамм Candida parapsilosis АТСС 22019. Диаметр зоны подавления роста грибов для флуконазола составлял более 23 мм, для вориконазола - более 28 мм [67, 14].
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к флуконазолу и вориконазолу приведены в таблице 4.
Протегрины PG-1, PG-2, PG-3 - антимикробные пептиды лейкоцитов свиньи, близкие изоформы с молекулярной массой 2000 Da, были получены сотрудниками отдела общей патологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН Кокряковым В.Н. и Кораблевой Е.С. Для получения использовали метод кислотной экстракции с последующей очисткой с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [223].
Чувствительность криптококков к суммарной фракции протегринов определяли методом серийных разведений путем совместной инкубации 1хЮ4 кл/мл С. neoformans с различными концентрациями PG-1,2,3 в стерильном растворе фосфатно-солевого буфера (0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 мкг/мл) [12]. После 30 мин инкубации при 37 С, 100 мкл взвеси засевали на чашки с агаром Сабуро и инкубировали 72 ч при 37 С. В контрольных образцах, вместо протегринов, использовали аналогичное количество раствора фосфатно-солевого буфера. Антифунгальную активность протегринов оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) с последующим определением минимальной фунгицидной концентрации (MFC50) для каждого штамма С. neoformans. За величину MFC50 принимали наименьшую концентрацию суммарной фракции протегринов, при которой погибало 50% криптококков. Минимальную фунгицидную концентрацию определяли путем построения графиков зависимости фунгицидной активности протегринов от концентрации пептидов по усредненным значениям трех независимых экспериментов
Статистическую обработку полученных в результате экспериментов медико-биологических данных проводили с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 6.0).
В соответствии с целями и задачами исследования, а также с учетом специфики анализируемых переменных [1,2, 15, 18] нами выполнялись: - построение и визуальный анализ графиков и диаграмм разброса данных; - построение гистограмм разброса данных; - расчет элементарных статистик (средние значения, ошибки средних, среднеквадратические отклонения, размах разброса данных); - построение и визуальный анализ корреляционных полей связи между анализируемыми параметрами; - расчет корреляционных матриц на основе линейной корреляции и непараметрических методов. сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводилось с помощью непараметрических методов %2. Сравнение количественных характеристик в исследуемых группах осуществлялось с использованием критериев Манна-Уитни с указанием медианных значений показателей с интерквартильным размахом 25%-75%, Me (Lq - Hq) [1, 18].
Анализ выживаемости животных проводили на основе определения выживаемости по методу Каплана-Мейера.
Для сравнения двух групп использовался многовыборочный критерий, который представляет собой развитие критерия Вилкоксона, обобщенного Геханом [15, 18].
Для визуализации структуры полученных результатов, использовали графические возможности системы Statstica for Windows, включая построение кривых выживаемости по методу Каплана-Мейера, и модуль построения диаграмм Microsoft Office. Количественные показатели в исследуемых подгруппах были представлены в форме «Box & Whisker Plot» с отражением среднего значения, ошибки среднего и стандартного отклонения для указанного параметра [15,18].
Используемые в работе методы статистического анализа не требуют специального контроля достаточности количества наблюдений, все допустимые оценки и заключения делаются при автоматическом учете фактически имеющихся данных [2, 18]. Критерием статистической достоверности полученных результатов считали общепринятую в медико-биологических исследованиях величину р 0,05 [1,2, 15, 18].
Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к штаммам С. neoformans разной вирулентности
В работу были включены 12 штаммов С. neoformans (РКПГ №№: Y 1106, Y 1178, Y 1165, Y 1090, Y 1216, Y 1262, Y 1272, Y 1257, Y 1271, Y 1276, Y 1175, Y 1164). При оценке морфо-биологических особенностей штаммов С. neoformans изучили их патогенность на животных (мыши линии Balb/c). Нами установлено, что все исследованные штаммы обладали разной степенью вирулентности. После наблюдения в течение 70 дней, сроки гибели 50% животных, зараженных одной дозой патогена (1х106/мл), для разных штаммов С. neoformans составили от 8 до 65 дней. На основании полученных данных, все исследованные штаммы в зависимости от сроков гибели мышей, были разделены на две группы (р 0,05). Полученные данные совпадают с результатами других исследователей о различиях клинических изолятов С. neoformans по степени вирулентности [3].
Попытки применения протеомного типирования криптококков в медицинской микологии начались несколько лет назад и в настоящее время ещё не имеют широкого распространения. В отечественной и зарубежной литературе отражены немногочисленные исследования в этой области [228, 192, 118, 8]. Методом MALDIOF-MS мы подтвердили не только вид криптококков, включенных в эксперимент, но и установили варианты С. neoformans, что недоступно при проведении традиционных методов идентификации грибов. Хотя в современной микологии «золотым стандартом» диагностики микромицетов является метод мультилокусного сиквенирования (MLST), наряду с ним, применение MALDIOF-MS рассматривается как альтернативный метод диагностики, обладающий преимуществом с точки зрения экономической целесообразности и более быстрого получения результатов исследования. Проведенная ранее идентификация 3-х из исследованных штаммов (РКПГ Y 1164, Y 1165, Y 1175) методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и Sau96 [5], и полное совпадение с результатами по определению вида и варианта для этих трех штаммов криптококков методом MALDIOF MS. В настоящее время используемый метод еще не внедрен в рутинную практику микробиологических лабораторий, но открывает перспективы для дальнейших исследований в этой области, в том числе и по определению вирулентности методами протеомного анализа.
Следует заметить, что данные о влиянии вирулентности штаммов С. neoformans на особенности иммунного ответа при взаимодействии с клетками врожденного иммунитета ограничены. Одни авторы считают, что это связано с состоянием иммунной системы макроорганизма, другие придерживаются мнения о необходимости учитывать факторы вирулентности патогена [29, 5]. Полученные экспериментальные данные указывают, что выявленные различия в иммунном ответе при взаимодействии с криптококками связаны со степенью вирулентности штаммов.
Нами установлено, что все исследованные штаммы соответствовали классической триаде факторов вирулентности С. neoformans: способности к росту при температуре макроорганизма (37 С), способности к капсулообразованию и меланинообразованию. Способность исследованных С. neoformans к росту при физиологических температурах тела не менее важна, чем любые другие факторы патогенности. При сравнении С. neoformans с другими представителями рода Cryptococcus было выявлено, что многие криптококки обладают факторами вирулентности, такими как капсула и лакказа, но при этом они не являются патогенными только потому, что они не способны к росту при температуре тела млекопитающих [26]. Одним из важных факторов патогенности криптококков является их способность к капсулообразованию [255]. В проведенном нами исследовании при микроскопии у всех штаммов С. neoformans выявляли полисахаридную капсулу, размер которой варьировал от 1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм. Полученные результаты согласуются с данными зарубежной литературы о роли капсулы как одного из основных факторов патогенности [92, 180, 284]. В окружающей среде капсула также играет важную роль в защите организма против неблагоприятных условий, таких, как обезвоживание [255], поэтому существующая гипотеза отечественных ученых об общебиологической роли капсулы С. neoformans сохраняет свою актуальность [7].
Способность криптококков к меланинообразованию оценивали при выращивании на среде с L-ДОФА при t 28 С и 37 С. Все исследуемые культуры уже на 1-е сутки инкубации при t 28 С проявляли фенолоксидазную активность. Активность фермента при температуре инкубации 28 С была значительно выше, чем при 37 С. В нашей работе установлено, что штаммы С. neoformans проявляли разную фенолоксидазную активность, их способность к меланинообразованию in vitro не коррелировала со степенью вирулентности. С одной стороны, полученные результаты не вполне согласуются с данными о том, что меланин-продуцирующие штаммы С. neoformans являются более вирулентными [59]. С другой стороны, они совпадают с аналогичными результатами в других исследованиях, в том числе с теми, в которых криптококки, не относящиеся к патогенным, способны образовывать меланин [26]. Это можно объяснить штаммными различиями С. neoformans в сочетании факторов патогенности и выраженности их действия.
Это не вполне согласуется с данными отечественной и зарубежной литературы, согласно которым меланин рассматривается как один из основных факторов патогенности [185, 60].
С течением времени грибы приобрели различные способы уклонения от защитных механизмов иммунной системы макроорганизма. Выбор способа выживания зависит от продукции специфических факторов патогенности и/или от условий, которые эти патогены находят в организме-хозяине. Однако механизмы, посредством которых криптококки уклоняются от поглощения фагоцитами и разрушения внутри фаголизосом клетки, остаются мало изученными [30].
Можно предположить, что исход взаимодействия между грибами и макрофагами зависит от состояния иммунной системы макроорганизма и степени вирулентности грибов. В этом отношении, фагоцитоз грибов макрофагами можно рассматривать как главный механизм врожденной иммунной системы, контролирующий возникновение инфекции, и ее исход.
