Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Многообразие зараженности клещей Ixodes persulcatus и антропогенный пресс 17
Глава 1.1. Антропогенный пресс и окружающая среда 17
Глава 1.2. Патогенные микроорганизмы иксодовых клещей 29
Глава 1.3. Генетический полиморфизм иксодовых клещей 39
Глава 2. Материалы и методы 44
Глава 3. Генетическая гетерогенность популяции /. persulcatus 52
Глава 4. Определение зараженности клещей I. persulcatus патогенными для человека микроорганизмами 65
Глава 5. Аномалии развития экзоскелета, антропогенный пресс и зараженность патогенными микроорганизмами 87
Заключение 102
Выводы 109
Практические рекомендации 111
Список литературы 113
- Патогенные микроорганизмы иксодовых клещей
- Генетический полиморфизм иксодовых клещей
- Генетическая гетерогенность популяции /. persulcatus
- Определение зараженности клещей I. persulcatus патогенными для человека микроорганизмами
Патогенные микроорганизмы иксодовых клещей
Только появление первых молекулярно-биологических тестов (Rosa, Schwan, 1989) позволило обнаружить микроорганизмы группы Borrelia burgdorferi sensu lato не только в /. scapularis (Picken, 1992), но и в других представителях иксодовых клещей. С появлением метода ПЦР-генотипирования представители рода Borrelia были обнаружены в Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis (Feir et al., 1994), D. reticulatus, Haemophysalis punctata (Hubbard et al., 1998), Rhipicephalus sanguineus (Hubbard et al., 1995). Обнаружение боррелий в клещах рода Ixodes позволило предположить, что большинство видов только этого рода является переносчиками Borrelia burgdorferi sensu lato (Barthold, 1998). К настоящему времени, боррелий обнаружены в /. columnae, I. dentatus, I. pacificus, I. tanuki, I. turdus (Piersing et al., 1990a; Fukunaga et al., 1996), I. hexagonus (Hubbard et al., 1998), I. ovatus (Kawabata et al., 1993), I. persulcatus (Alekseev et al., 1998), I. ricinus (Rijpkeema et al., 1995, 1996a, 1996b; Cinco et al., 1996; Kirsten et al., 1997; Missone et al., 1998b), I scapularis (Rosa and Schwan, 1998; Johnson et al., 1991; Guttman et al., 1996), I. uriae (Olsen et al., 1993).
Особый интерес при изучении проблемы инфекций, передаваемых иксодовыми клещами, представляют возбудители не только уже достаточно хорошо описанных вирусных клещевых энцефалитов и боррелиозов, но и относительно малознакомых в повседневной клинико-диагностической практике трансмиссивных клещевых инфекций эрлихиозов и бабезиозов (Chang et al., 1998; Fahrimal et al, 1992; Higgins, Azad, 1995). Как показали исследования проведенные в последние годы, вышеперечисленные инфекции являются актуальными для Российской Федерации (Дубинина, Алексеев, 1999; Зюзя и др., 1999; Коренберг, 1999; Лукин, Грабарев, 2000). Классические труды по природно-очаговым инфекциям достаточно полно описали проблему клещевого энцефалита, представляющего опасность для населения на огромной территории от Дальнего Востока до Северо-западного региона России (Павловский, Соловьев, 1940; Павловский, 1964). Ряд очагов клещевого энцефалита находится на территории Ленинградской области, а некоторые из них входят в городскую черту г. Санкт-Петербурга.
Существенный практический интерес не только для ученых, но и для врачей-клиницистов представляет описанный сравнительно недавно для территории Российской Федерации иксодовый клещевой боррелиоз. По всей видимости, боррелиозными патогенами клещи /. persulcatus поражены повсеместно в пределах ареала обитания (Lesnyak et al., 1998). Возможные отличия в популяциях клещей заключаются, скорее всего, не в наличии или отсутствии зараженности боррелиями, а в том какими из представителей рода Borrelia преимущественно поражена та или иная популяция (Cinco et al., 1998; Hubalec, Halouzka, 1998; Missone, Van Impe, Hoet, 1998b; Schouls, Van do Pol, Rijpkema, 1999). В настоящее время у иксодовых клещей описан целый ряд представителей рода боррелия (Liveris, Gazuman, Schwartz, 1995). Изначально, использование ДНК-ДНК гибридизации в сочетании с антигенным картированием, т.е. серотипирование моноклональными сыворотками к наружным мембранным белкам OspA и OspB (Bergstrom, Bundoc, Barbour, 1989), позволило выделить три вида боррелий: В. burgdorferi sensu stricto, В. afzelii, В. garimi (Baranton et al., 1992; Marconi and Garon, 1992; Canaca et al., 1993). Позднее было охарактеризовано еще несколько видов боррелий: В. andersoni (бывшая геногруппа 21123), В. lusitaniae (бывшая геногруппа PotiB2), В. valaisiana (бывшая геногруппа VS116), В. hermsii, В. japonica (Postic et al., 1994, 1997; Le Fleche et al., 1997; Wang et al., 1997). Разумеется, что эта таксономия не полна и описание в самое ближайшее время еще значительного количества видов боррелий весьма вероятно (Faruki Н., 1994; Rosa, Hogan, Schwan, 1997). Этиологическими агентами болезни Лайма в различных ее проявлениях являются первые три из перечисленных видов рода Borrelia (Guy, Stanek, 1991; Eiffert et al., 1995), поскольку только они в настоящее время выделены от больных с полным симптомокомплексом иксодового клещевого боррелиоза (Assous et al., 1993; Van Dam et al., 1993; Demaerschalck et al., 1995; Rijpkema et al., 1997; Missone, Hoet, 1998a). Остальные виды были изолированы из клещей, большинство из них успешно размножались в млекопитающих или птицах в лабораторных условиях (Nakao et al., 1994, 1995; Postic et al., 1994; Picken et al., 1995; Gern et al., 1998; Saint Girons et al., 1998).
Генетический полиморфизм иксодовых клещей
Изучение методом изоферментного анализа популяционной гетерогенности стало общепризнанным инструментом популяционной генетики и молекулярной биологии (Hopkinson, Harris, 1971; Harris, 1975). Впервые к проблеме генетического полиморфизма клещевой популяции на примере /. ricinus обратился J. A. Healy (1979). В качестве маркера гетерогенности им был взят фермент а-глицерофосфатдегидрогеназа (а-GPDH; Е.С. 1.1.1.8), участвующий в процессе быстрого восстановления NAD в цикле гликолиза при мышечном сокращении, что способствует выработке АТФ посредством флавин-зависимого окисления оксалоацетата в митохондриях. Автору удалось описать 4 аллеля сс-GPDH, различающихся по своей электрофоретической подвижности. При этом два из них были минорными и встречались в популяциях /. ricinus в крайне незначительном числе случаев. В качестве фенотипического проявления генетической гетерогенности оценивалась устойчивость особей к высыханию, а также локомоторная активность клещей. Оказалось, что гетерозиготные по двум мажорным аллелям самки обладают наибольшей локомоторной активностью и наименьшей устойчивостью к высыханию. Наиболее важным, как представляется, следует считать установленный факт фенотипического проявления генетической гетерогенности клещевой популяции.
Дальнейшее исследование этой проблемы привело к изучению гетерогенности популяции /. ricinus по локусу другого активного участника метаболических процессов в организме иксодид - фермента малатдегидрогеназы (MDH; Е. С. 1.1.1.37). Использование малатдегидрогеназы в качестве маркера генетической гетерогенности известно не только у человека и млекопитающих (Kitto, Wassarman, Kaplan, 1966), но и у насекомых (Ayala et al., 1974), но для изучения клещей было применено впервые. Обнаруженные 4 аллели (Jensen et al., 1999) не различались по встречаемости среди разных возрастных групп, но достоверно отличались по суточной активности. При сравнении между собой клещей, собранных в различные периоды суток, обнаружилось, что некоторые генотипы встречаются чаще в определенное время, например, только утром, совершенно не проявляя активности в другое время суток. Таким образом, было доказано, что клещевая популяция гетерогенна не только по временным параметрам (активность зависит от времени суток), но и по генетическим (различные генотипы активны в разное время суток).
Географическая гетерогенность популяции клеща /. ricinus была выявлена с использованием другого метода анализа генетического полиморфизма: газовой хроматографии углеводов кутикулы иксодид. Estrada-Репа A. et. al. (1998) выделили 10 отличающихся друг от друга групп клещей собранных в различных странах Европы. Полученные результаты хорошо согласуются с географической изоляцией клещей внутри ареала обитания и в то же время изоляты внутри вида находятся гораздо ближе друг к другу, чем по отношению к близкородственному, но, тем не менее, другому виду - /. persulcatus. При оценке способности различных изолятов к заражению спирохетами В. afzelii выяснилось, что изоляты из Германии, Ирландии и Испании в высокой степени восприимчивы к заражению, что является, по всей видимости, видовой характеристикой, но интенсивность заражения у всех трех изолятов была различной. Эта особенность может служить дополнительным свидетельством в пользу того, что генетически гетерогенные группы по-разному восприимчивы к патогенам. Приведенные данные могут свидетельствовать в пользу ранее высказанной гипотезы (Estrada-Pena et al., 1996), что преобладание разных видов спирохет в различных регионах Европы (например, Borrelia lusitaniae в Португалии) может быть связано именно с географической изоляцией выделенных фенотипов.
Данные по генетическому полиморфизму у близкого к /. ricinus таежного клеща отсутствовали. Первыми шагами в исследовании гетерогенности популяции /. persulcatus следует считать работы по изучению фенотипической неоднородности этих клещей на примере обнаружения аномалий экзоскелета (Alekseev, Dubinina, 1993). Установлено, что аномалии хитинового экзоскелета распространены повсеместно на всем ареале обитания /. persulcatus, но частота встречаемости подобных фенотипических проявлений прямо пропорциональна антропогенному прессу, т. е. загрязнению промышленными поллютантами мест обитания таежного клеща (Алексеев, Дубинина, 1997). Сходные по характеру аномалии были обнаружены в популяции клещей /. ricinus на Куршской косе (Калининградская обл.) и в Дании (Zharkov et al., 2000).
Обнаружение фенотипических отличий оказалось тесно связано с зараженностью /. persulcatus патогенными боррелиями. Оказалось, что клещи с аномалиями экзоскелета чаще заражены боррелиями, по сравнению с нормой, и, кроме того, такие зараженные аномальные особи обладают повышенной двигательной активностью по сравнению с зараженными боррелиями клещами без аномалий экзоскелета (Alekseev et al., 1999).
Генетическая гетерогенность популяции /. persulcatus
Генетическую гетерогенность популяции клещей Ixodes persulcatus оценивали по локусу фермента малатдегидрогеназы (MDH; Е. С. 1.1.1.37). Методом изоферментного анализа установлено наличие нескольких электрофоретипов (ЭФ-типов) фермента малатдегидрогеназы, различающихся по своей подвижности в полиакриламидном геле. Часть из выявленных ЭФ-типов представлена на рис.1. Всего было выявлено 6 ЭФ-типов представленных на рис.2 римскими цифрами I-VI. Часть ЭФ-типов представлена монозиготными генотипами (единичные полосы на фореграмме), часть ЭФ-типов - гетерозиготными генотипами, которые выявляются, учитывая димерную структуру фермента, в виде тройных полос на фореграмме. В дальнейшем, для более точного определения, их обозначили как генотипы, поскольку каждый выявленный ЭФ-тип соответствовал определенному генотипу. Поскольку было выявлено всего три возможных аллельных пары (нижняя строка на рис.2), то аллели были обозначены по мере их обнаружения арабскими цифрами 1, 2 и 3. Генотипы I, II и III являются гомозиготами (аллельные пары 1.1, 2.2 и 3.3, соответственно), а генотипы IV, V и VI - гетерозиготами (аллельные пары 1.2, 2.3 и 1.3). Частота встречаемости аллелей была следующей: аллель 1 - 0,764; аллель 2 - 0,067; аллель 3 - 0,169. Поскольку в исследуемой популяции явно доминировали носители аллели 1, то генотипы I, IV и VI были объединены в условную геногруппу I, а все остальные генотипы, не несущие этой аллели - в геногруппу II. Встречаемость генотипов в исследуемой популяции клещей была различной. Наиболее часто за период наблюдения 1998-2000 гг. (рис. 3) встречались генотипы I - 64% и IV - 21%, на их долю приходится 85% всех клещей, остальные 15% распределились следующим образом: III - 5%, VI -4%,V-3%HII-3%. На протяжении всего периода наблюдения (сезоны 1998-2000 гг.) состав популяции по генотипам сколько-нибудь значительно не изменялся (Таблица 3). При анализе суточной активности за весь сезон сбора клещей различных генотипов обнаружены незначительные статистически недостоверные отличия по частоте встречаемости особей различных генотипов в разное время суток (Таблица 4).
Следует отметить, что в районе сбора клещи наиболее активны во второй половине суток, т.е. с 11.00 до 23.00, при этом наиболее опасным, с точки зрения вероятности нападения клещей, является время с 14.00 до 17.00. При более детальном рассмотрении данных о суточной активности клещей, обнаруживается крайняя схематичность такого представления о потенциальной опасности того или иного времени суток с точки зрения заражения человека клещевыми инфекциями. При анализе суточной активности по месяцам отмечены следующие особенности: пик суточной активности клещей в течение сезона смещается в сторону более позднего времени (рис. 4). В начале сезона активности клещей (апрель) клещи чаше всего встречались в период времени с 11 до 14 часов. В мае месяце, этот пик смещается на период с 14 до 17 часов. В июне четкий максимум не отмечается, но наибольшее количество клещей приходится на вечернее время с 17.00 до24.00. А к концу периода активности /. persulcatus (июль), пик смещается на период времени с 17.00 до 20.00. Такое смещение пика активности можно объяснить тем, что в начале сезона, когда температура подстилки, которая еще не прогрелась после холодного периода, достаточно низкая, клещи активны в наиболее теплое время суток. Соответственно, при дальнейшем повышении среднесуточных температур и прогревании подстилки, пик активности смещается на более позднее время. Дальнейшее повышение дневного максимума температуры воздуха и снижение атмосферной влажности в мае смещают пик активности на более позднее время, когда температура воздуха начинает снижаться, а влажность атмосферы, наоборот, - повышаться. Тенденция сохраняется в июне и достигает наибольшей выраженности в самый теплый месяц года - июль, когда максимальная встречаемость клещей наблюдается в вечернее время: с 17.00 до 24.00 (60,6% от общего числа). Таким образом, на протяжении сезона активности таежного клеща, наиболее опасное для посещения человеком лесных массивов время смещается с полуденного (11.00-14.00) периода в начале сезона до вечернего (17.00-20.00) к концу сезона. В течение всего сезона активности клещей, за весь период наблюдения, при анализе встречаемости отдельных генотипов, также не обнаружены какие-либо достоверные различия. Однако, при анализе встречаемости геногруппы I на протяжении всего сезона сбора клещей (апрель-июль), обнаружена следующая закономерность: на протяжении сезона встречаемость геногруппы I снижается (рис. 4), а геногруппы II, соответственно, - достоверно (р 0.01) возрастает более чем в 2 раза (с 6,1% до 12,9%). Данные по частоте обнаружения дисплазий экзоскелета среди клещей различных генотипов (табл. 6) показывают, что среди различных генотипов клещей нет достоверных отличий по встречаемости аномалий на протяжении всего периода наблюдения. Небольшие отличия во встречаемости аномалий экзоскелета в геногруппах I и II оказались недостоверны (% =2,845): в геногруппе I аномалии встречаются в 30,5% случаев (259 из 848 особей), а в геногруппе II - в 28,6% (28 из 98).
Определение зараженности клещей I. persulcatus патогенными для человека микроорганизмами
При определении зараженности клещей /. persulcatus патогенными для человека микроорганизмами были обнаружены следующие виды: вирус весенне-летнего клещевого энцефалита (RSSE), Borrelia burgdorferi sensu lato, В. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, возбудитель моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ), возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза человека (ГЭЧ), Babesia sp. Всего патогенные для человека микроорганизмы обнаружены в 33% обследованных таежных клещей. Зараженность /. persulcatus вирусом клещевого энцефалита, определенная методом иммуноферментного анализа (ИФА) составила 0,8%, а методом ПЦР - 1,6%, что объясняется более высокой чувствительностью метода ПЦР по сравнению с ИФА, с одной стороны, а также тем, что в клещах возможно обнаружение дефектных вирусных частиц с неполной сборкой. Во всех особях, где антиген вируса клещевого энцефалита был найден методом ИФА, он также был обнаружен методом ПЦР. В таком случае, вполне очевидно, что методом ПЦР РНК RSSE обнаруживается в 2 раза чаще, чем антиген вируса методом ИФА. В 80% случаев вирус обнаруживался одновременно с каким-либо другим патогенным микроорганизмом и только в 20% случаев в виде моноинфекции. Причем в варианте микстинфекции (рис. 7), встречается как двойное (вирус и боррелия), так и тройное инфицирование (вирус, боррелия и эрлихия; или вирус, боррелия и бабезия). При исследовании методом микроскопии в темном поле (ТМ) в 29,2% клещей были обнаружены живые спирохеты. Число спирохет в 250 полях зрения колебалось от 1-2 до 260 особей (в среднем — 1,94±0,6 спирохет/клещ). На протяжении сезона активности клещей (апрель-июнь) наблюдается тенденция к снижению числа клещей зараженных спирохетами. Корреляционный анализ описывает эту связь как Х=2,195 - 0,095 Y (р 0,001), где X - количество клещей, зараженных спирохетами, Y — время сбора. Коэффициент корреляции отрицательный, что отражает снижение доли зараженных спирохетами клещей к концу сезона.
При проведении анализа методом флуоресцирующих антител (МФА) к групповому антигену ОМР В. burgdorferi sensu lato специфическое свечение, говорящее об обнаружении спирохет именно рода Borrelia, обнаружено в 32,8% случаев. МФА, по сравнению с темнопольной микроскопией, является более специфичным и более чувствительным видом исследования, что позволяет выявить большее число случаев инфицирования клещей боррелиями. Число боррелий, обнаруживаемых в 10 полях зрения, колебалось от 1 до 760 (в среднем - 2,7+0,6 боррелий/клещ). При оценке данных о зараженности клещей спирохетами вообще (данные получены методом ТМ) и боррелиями (метод МФА), в частности, обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на значительную долю совпадений (67,3%) результатов полученных обеими методами, в 1/3 случаев наблюдается расхождение в оценке зараженности (табл.8). Так, в 18,3% (468/2557) МФА выявлял боррелий (МФА+), притом, что анализ методом ТМ не обнаруживал спирохет (ТМ-), а в 14,4% методом ТМ были обнаружены спирохеты (ТМ+), которые не являлись боррелиями группы В. burgdorferi s. 1., поскольку использование моноклональных антител не приводило к выявлению боррелийного антигена с помощью МФА (МФА-). Первую группу результатов (МФА+ ТМ-) можно объяснить, как уже было упомянуто выше, значительно более высокой чувствительностью МФА по сравнению с ТМ, с одной стороны. С другой стороны, следует учитывать тот факт, что МФА позволяет обнаруживать как живых боррелий, так и нежизнеспособные бактериальные клетки, а метод ТМ выявляет только живых спирохет.
Существование второй группы результатов (МФА- ТМ+) позволяет предположить, что «паразитокосмос» таежного клеща /. persulcatus значительно богаче по ви довому составу, чем представляется на данный момент. Поскольку обнаружение микроорганизмов, морфологически сходных с боррелиями группы В. burgdorferi s. 1., но при этом обладающих иной антигенной структурой (поскольку моноклональные антитела против родоспецифического антигена не реагируют с мажорным гликопротеином клеточной стенки), говорит о существовании спирохет принадлежащих к группе (или группам) отличающихся от В. burgdorferi s. 1. При использовании для детекции патогенных для человека микроорганизмов метода ПЦР были идентифицированы три представителя группы В. burgdorferi sensu lato: В. afzelii, В. garinii, В. burgdorferi sensu stricto. Последний из перечисленных видов (возбудитель собственно болезни Лайма) впервые обнаружен нами на территории Российской Федерации (Семенов А. В. и др., 2001). Всего боррелии выявлены в 32,9% клещей.
