Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1. Краткие сведения о систематическом положении, распространении,
особенностях развития и морфологии Echinococcus granulosus и
Echinococcus mutoloculans 12
Систематическое положение Е.granulosus и E.multiloculans 12
Географическое распространение Е.granulosus и E.multiloculans.. 12
Цикл развития возбудителей эхинококкозов 13
Личиночная стадия эхинококка (метацестода) 15
Морфология и развитие паразита на имагинальной стадии 22
Яйцо 26
Штаммовая изменчивость Echinococcus 29
Моделирование эхинококкозов 37
Моделирование ларвальных эхинококкозов 37
Моделирование имагинального эхинококкоза 41
4. Химиотерапия экспериментального имагинального альвеолярного
эхинококкоза 42
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 46
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
1. Выделение протосколексов эхинококка 46
Методика получения протосколексов E.granulosus 46
Методика получения протосколексов E.multilocularis 48
Подсчет количества протосколексов в инокуляте 50
2. Получение стробил E.multilocularis 51
Методика заражения золотистых хомяков протосколексами E.multilocularis 51
Методика определения инвазии стробилярньгми E.multuocularis.. 51
Подсчет количества стробил E.multilocularis в тонком кишечнике хомяков 52
Диагностическая интестинотомия у лабораторных грызунов 52
Методика выделения стробил E.multilocularis 53
3. Морфологические исследования протосколексов и стробил
эхинококка 54
Подготовка протосколексов и стробил эхинококка к измерениям.. 54
Методика исследования хоботковых крючьев протосколексов и взрослых цестод 54
Методика определения восприимчивости белых мышей к внугрибрюшинному заражению протосколексами E.granulosus... 55
Поддержание изолятов E.granulosus и E.multuocularis в лабораторных условиях 56
Методика воспроизведения инвазии стробилярными E.multilocularis у котят с искусственной обтурацией общего желчного протока.. 58 Методика медикаментозной иммуносупрессии лабораторных
грызунов : 58
Методика культивирования стробилярной стадии Н.папа у
золотистых хомяков 59
Методика трансплантации стробил альвеолярного эхинококка
лабораторным грызунам 59
Методика проведения опытов по химиотерапии кишечных
цестодозов 60
Препарат Г-1739 (флузамид) 62
Масляный раствор трихлорофена 65
Кукурбин и микрокапсулированный альбендазол 65
Полимерная форма гексаметилентетрамина 65
Препараты Г-1741, Г-1742, Г-1743, Г-1744, Г-1745, полимерная
форма глицерина, официнальная суспензия альбендазола,
микрокапсулированный комплекс альбендазола и кобальта 66
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 67
Характеристика изолятов Echinococcus granulosus 67
Характеристика изолятов E.granulosus по морфологии крючьев
протосколексов 67
Восприимчивость белых мышей к внутрибрюшинному заражению
протосколексами E.granulosus от іфомежуточньїх хозяев разных ви
дов 70
Результаты опытов по поддержанию изолятов E.granulosus на ларваль-
ной стадии развития в лабораторных условиях 73
Характеристика изолятов Echinococcus muMlocularis у лабораторных
грызунов 75
Характеристика географических изолятов E.multilocularis на ларваль-
ной стадии развития 76
Характеристика изолятов E.multilocularis на стробилярной стадии развития паразита в кишечнике у экспериментально зараженных
иммуносупрессированных золотистых хомяков 80
Результаты опытов по поддержанию E.multilocularis на стробилярной стадии развития у экспериментально зараженных лабораторных
грызунов 84
Искусственная трансплантация стробил E.multilocularis иммуно-
супрессированным и интактным лабораторным грызунам 87
Выяснение роли желчи шготоядных в становлении кишечной
инвазии E.granulosus 91
Эффективность оригинальных методов диагностики эксперимен
тального ларвального и кишечного эхинококкоза 92
Диагностическая лапаротомия при экспериментальных ларвалъных эхинококкозах лабораторных грызунов 93
Диагностическая интестинотомия при экспериментальных: кишечных гелъминтозах лабораторных грызунов 93
8. Экспериментальная химиотерапия кишечных альвеолярного
эхинококкоза и гименолепидоза 93
Препарат Г-1739 (флузамид) 94
Масляный раствор трихлорофена 99
Полимерная форма гексаметилентетрамина 100
Кукурбин и мгофокапсулированный альбендазол 102
Препараты Г-1741, Г-1742, Г-1743, Г-1744, Г-1745, полимерная форма глицерина, официнальная суспензия альбендазола, микрокапсу-лированный комплекс альбендазола и кобальта 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 111
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЕ 135
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цистный и альвеолярный эхинококкозы являются одними из наиболее опасных зооашропогельминтозов. Распростра-нение в России цистного и альвеолярного гидатидоза за 1986-1995 годы остается примерно на одном уровне - около 1,1 случаев на 100 тысяч населения. За последние годы этот показатель может несколько увеличиться по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальных условий жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля (Коваленко Ф.ГГ. и др., 2002).
Проблема профилактики и лечения имагинальных эхинококкозов собак - главного источника заражения людей и животных ларвальными эхинокок-козами, до настоящего времени не утратила актуальности, поскольку методы профилактики эхинококкозов собак еще на разработаны, а известные методы лечения этих инвазий основаны на применении препаратов, лишенных ови-цидной активности (Лукашенко Н.П., 1975). Изучение вопросов патогенеза, профилактики, лечения имагинальных эхинококкозов, а также пггаммовых особенностей возбудителей заболевания производится только на собаках и кошках, использование которых сопряжено с опасностью заражения экспериментаторов и обслуживающего персонала, необходимостью в специальном оборудовании и большими финансовыми затратами (Thompson R.C.A. et al., 1991b; Jenkins D.J., Romig Т., 2000).
Программы контроля, связанные с регулярным медикаментозным лечением собак, также должны проводиться с учетом того факта, что штаммы E.granulosus и географические изоляты E.multilocularis различаются по скорости созревания и началу выделения инвазионных яиц (КшпагаШаке L.M. et al., 1983; Thompson R.C.A. et al., 1984). При этом необходимо учитывать различия изолятов эхинококка в патогенности для человека и животных.
В свете вышеизложенного актуальными представляются исследования по оптимизации экспериментальной модели имагинального альвеолярного
6 эхинококкоза (альвеококкоза) на лабораторных грызунах, характеризующейся высокой интенсивностью и экстенсивностью инвазии и полным развитием паразита до стадии формирования инвазионных яиц (Коваленко Ф.П., 1976; Kamiya М. & Sato Н., 1990а, 1990b; Коваленко Ф.П. и др., 1990). Она может быть использована для скрининга и изучения средств профилактики и лечения эхинококкозов собак. По сравнению с используемыми для данных целей плотоядными новая модель более удобна, безопасна и экономична.
Цель и задачи исследований
Исследования проведены с целью характеристики доступных изолятов E.granuiosus и E.miutilocularis на ларвальной и имагинальной стадиях развития и изыскания химических соединений, обладающих терапевтической активностью при имагинальных эхинококкозах.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Воспроизвести экспериментальные модели ларвальных эхинококкозов на лабораторных грызунах, изучить особенности морфологии и развития ларвоцист использованных изолятов Е. granulosus и E.multilocularis.
Усовершенствовать метод культивирования имагинальной стадии E.multilocularis на лабораторных грызунах.
Охарактеризовать три географических изолята E.multilocularis на ларвальной и имагинальной стадиях по особенностям морфологии, роста и развития у лабораторных грызунов.
Осуществить скрининг противоцестодных агентов среди известных анттельминтных препаратов, их оригинальных лекарственных форм и новых химических соединений на экспериментальной модели имагинального альвеолярного эхинококкоза на золотистых хомяках.
7 Научная новизна.
Разработан оригинальный метод культивирования имагинальной стадии E.multilocularis у лабораторных грызунов, обеспечивающий повышенную продуктивность модели в отношении стробил эхинококка.
При экспериментальных имагинальных альвеолярном эхинококкозе и гименолепидозе установлена способность незрелых стробилярных фор-м цестод выживать в верхнем отделе пищеварительного тракта (желудок, двенадцатиперстная кишка), приживаться и продолжать развитие в тонком кишечнике иммуносупрессированных грызунов-реципиентов до стадии формирования инвазионных яиц на фоне медикаментозной иммуносупрессии.
При экспериментальном имагинальном альвеолярном эхинококкозе лабораторных грызунов показана возможность прямой диагностики инвазии путем оперативного вскрытия тонкой кишки, лаважа её содержимого и оценки наличия инвазии и степени зрелости паразита с сохранением жизни экспериментального дефинитивного хозяина.
Показана пригодность модели кишечного эхинококкоза на грызунах для скрининга новых противоцестодных препаратов.
На экспериментальных моделях кишечных эхинококкоза и гименоле-пидоза золотистых хомяков выявлена противоцестодная активность масляного раствора трихлорофена, флузамида, кукурбина, препаратов Г-1741, Г-1742, а также лекарственных форм альбендазола (офици-нальной суспензии альбендазола и микрокапсулированного комплекса альбендазола и кобальта).
На экспериментальных моделях кишечных цестодозов установлены ранние проявления специфической активности эффективных противо-цестодозных препаратов до элиминации цестод из кишечника инвази-рованных животных (в течение первого часа после введения препаратов).
Предложена совокупность морфологических и биологических критериев для характеристики изолятов Е. multilocularis на ларвальной (восприимчивость к вторичному заражению, скорость роста ларвоцист и их продуктивность в отношении протосколексов) и имагннальной (минимальный срок созревания цестод до стадии формирования инвазионных яиц, минимальный срок формирования предпоследней проглотти-ды) стадиях развития.
При экспериментальных ларвальных эхинококкозах показана возможность диагностической лапаротомии грызунов для ревизии всех отделов брюшной полости и взятия биоптата с сохранением жизни животным (белые мыши и крысы, хлопковые крысы).
При экспериментальном альвеолярном эхинококкозе выявлена атипичная инвазивность протосколексов E.multilocularis Восточно-Европейского изолята для белых крыс при парентеральном заражении. Практическая значимость
По материалам диссертационной работы разработаны «Методические рекомендации по трансплантации ларвоцист и стробил эхинококков лабораторным грызунам» одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» РАСХН 05.12.2002 г.
Характеристика изолятов эхинококка по совокупности морфологических критериев и особенностей развития на ларвальной и имагиналь-ной стадиях, позволяющая дифференцировать их физиологические варианты, оказалась важной в ряде прикладных аспектов:
изоляты E.granulosus из южных регионов России (ог овцы и человека) удобны для поддержания паразита в лабораторных условиях на ларвальной стадии развития ввиду их высокой инвазивности для белых мышей;
экспериментально зараженные ларвальным E.multilocularis Восточно-Европейского изолята лабораторные грызуны (хлопковые и белые крысы) оказались удобными продуцентами большого количест-
9 ва протосколексов для воспроизведения моделей ларвального и има-гинального альвеококкозов и нужд биотехнологии; - при моделировании имагинального альвеококкоза использование протосколексов E.multilocularis Восточно-Европейского и Камчатского изолятов, характеризующихся поздними сроками развития стробил до стадии формирования инвазионных яиц (25-31 да.), позволяет осуществлять 5-6 безопасных для экспериментатора пассажей стробилярных цестод и использовать модель для ускоренного скрининга противоцестодных препаратов, что обеспечивает высокую продуктивность и малую затратность исследований.
Выявленный феномен успешной искусственной трансплантации кишечных гельминтов открывает возможность пассирования кишечных цестод и нематод та всех стадиях развития вместо традиционного воспроизведения всего жизненного цикла паразитов у экспериментальных хозяев, что обеспечивает оптимизацию моделей за счет сокращения срока их воспроизведения, длительного поддержания изолятов возбудителей в лабораторных условиях и их высокой рентабельности.
Выявленная возможность пассирования ларвального E.granulosus на лабораторных грызунах (белые мыши и крысы) методом оперативной трансплантации ларвоцист с сохранением жизни доноров обеспечивает поддержание изолятов паразита в лабораторных условиях до 2-х лет для экспериментальных исследований.
Методы диагностических лапаротомии и интестинотомии при экспериментальных ларвальных эхинококкозах и имагинальном альвеокок-козе обеспечивают контроль за наличием инвазии и активностью хи-миотерапевтических препаратов с сохранением жизни животных, что снижает затратность исследований.
Применение модели имагинального альвеолярного эхинококкоза на золотистых хомяках для скрининга противоэхинококковьгх препаратов вместо традиционно используемых для этих целей собак и кошек зна-
10 чительно повышает рентабельность, безопасность и удобство исследования. Выявление на экспериментальной модели овицидной и ларвицидной активности масляного раствора трихлорофена в отношении Н.папа открывает перспективы его применения для лечения кишечных цестодо-зов вместо празиквантела, лишенного этих свойств. Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:
Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» РАСХН (20-22.02.01., 22-24.05.02., 04-06.12.02., Москва).
Научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (23-24.05.01., 22-23.05.02., ВИГИС, Москва).
Ш Международной Российско-иранской конференции «Сельское хозяйство и природные ресурсы», (18-20.09.02., Москва).
X Международном конгрессе паразитологов (4-9.08.02., Ванкувер, Канада).
Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (2001 -2002 гг.).
Основные положения, выносимые на зашиту
Характеристика изолятов эхинококка по особенностям морфологии и развития ларвальной и стробилярной стадий паразитов у лабораторных грызунов обеспечивает выявление признаков специфических географических изолятов (E.multilocularis) или особенностей изолятов в зависимости от вида промежуточного хозяина (E.granulosus).
Новый метод моделирования имагинального альвеолярного эхинококкоза на золотистых хомяках повышает надежность модели за счет повышенной ее продуктивности в отношении стробил эхино-
11 кокка по сравнению с известными аналогами и обеспечивает большее ее удобство для скрининга новых противоцестодных препаратов.
Оригинальный метод искусственной трансплантации кишечных цестод обеспечивает возможность пассирования гельминтов на стадии стробил на лабораторных грызунах и создания тем самым удобной и экономичной модели, пригодной для ускоренного скршпшга противоцестодных препаратов.
На моделях экспериментальных кишечных цестодозов золотистых хомяков выявлена высокая терапевтическая активность новых химических соединений (флузамид, препараты Г-1741, Г-1742), оригинальных лекарственных форм известных антгельминтиков (альбен-дазол, трихлорофен) и препарата растительного происхождения (ку-курбин), эффективность которых составляет 94,2 - 100%.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ и 2 работы приняты к публикации.
Объем и структура диссертация. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 197 источников, в том числе 35 отечественных и 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 28 рисунками.
