Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Антигены цестод и гуморальный иммунный ответ хозяина
1.1. Литературная справка 12
1.1.1. Распространение цистицеркозов 12
1.1.2. Антигены цестод 22
1.1.3. Методы фракционирования полных антигенных Экстрактов 33
1.1.4. Культуральные методы получения антигенов 40
1.2. Собственные исследования 44
1.2.1. Материалы и методы исследований 44
1.3. Результаты исследований 58
1.3.1. Водно-солевые экстракты цестод, их диагностичеекая ценность 61
1.3.2. Экскреторно-секреторные антигены гельминтов 83
1.3.3. Метаболиты клеточных культур гельминтовФракции антигенных экстрактов при хроматографических разделениях - 87
Глава 2. Естественная резистентность и особенности клеточного иммунитета при цистицеркозах животных 121
2.1. Литературная справка 121
2.2. Материалы и методы исследований 144
2.3. Результаты исследований 153
Глава 3. Иммунодиагностика цистицеркозов и тениидозов животных - 239
3.1. Литературная справка 239
3.2. Собственные исследования 254
3.2.1. Материалы и методы 254
3.2.2. Результаты собственных исследований 260
Выводы 285
Практические предложения 288
Список литературы 289
Приложения 334
- Распространение цистицеркозов
- Культуральные методы получения антигенов
- Водно-солевые экстракты цестод, их диагностичеекая ценность
- Метаболиты клеточных культур гельминтовФракции антигенных экстрактов при хроматографических разделениях
Введение к работе
Стремительное развитие научно-прикладных направлений иммунологии и молекулярной биологии оказывает мощное влияние на методологические подходы к изучению паразито-хозяинных отношений при тканевых гельминтозах и разработку методов их диагностики. В настоящее время в научной литературе собрано значительное количество экспериментальных фактов, которые отражают аспекты иммунной реакции хозяина на антигены цистицерков. Сложность антигенной структуры метацестод и тений усугубляется наличием в них компонентов, перекрестно реагирующих с антигенами хозяина (В.К. Бережко, 2003; А.С. Бессонов, 2004; В.В. Клименко, 2004; A.Ito, 1999). Разностороннее изучение белковых компонентов цистицерков, их половозрелых форм в онтогенезе современными аналитическими методами является необходимым условием для уточнения механизмов влияния гельминтов на иммунологическую перестройку хозяина. Анализ антителогенеза при цистицеркозах разных видов животных современными иммунохимическими методами позволяет определить принципиальные подходы к иммунодиагностике и оказывается необходимым для обоснования применения конкретных тест-систем. Создание эффективных диагностикумов является важнейшей практической задачей ветеринарии и медицины (А.В.Успенский, 2004; J.C.Allan, 1993; Р. Dorny, 2002).
Характеристика методов очистки диагностических антигенов гельминтов необходима для разработки иммунохимических тестов. Технология получения диагностически ценных метаболитов клеточной культуры цестод является примером быстрого внедрения науки в практику и продолжением развития фундаментальных исследований на качественно новом уровне.
В настоящее время иммунитет при паразитарных болезнях часто определяется как состояние "адаптационной толерантности", проявляющееся
развитием защитных реакций в организме хозяина без полного уничтожения всех особей паразита (А.С. Бессонов, 2004; P. Ortiz, 1982; С. Arme, 1988). Однако еще недостаточно изучены особенности молекулярных и клеточных процессов, протекающих при цистицеркозах в ходе развития инвазии. Очень слабо изученными являются вопросы включения различных звеньев иммунитета в процессе онтогенеза метацестод, их способность нейтрализовать возможные нарушения гомеостаза хозяина. Многие проявления иммунитета имеют универсальное значение. С другой стороны, часто отмечается специфика защитных реакций хозяина, связанная со своеобразием характера взаимоотношений в системе "паразит-хозяин" при гельминтозах. Огромное значение в эффективности и агрессивности иммунных реакций имеет степень взаимной адаптации двух изначально антагонистических организмов (В.К. Бережко, 1994; Э.Х. Даугалиева, 1997; С.А. Беэр, 2003; К.Г. Курочкина, 2003; О.И. Мамыкова, 2004; K.Tackmann, 1994). Поэтому изучение влияния модели цистицеркозной инвазии на факторы естественной резистентности и иммуноморфологические характеристики клеток, органы иммуногенеза при спонтанных и экспериментальных инвазиях животных реализуют диалектические подходы к уточнению паразито-хозяинных отношений.
Современные методы иммунохимического анализа позволяют использовать для диагностики инфекционных и паразитарных болезней как поли-, так и моноклональные антитела (Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, 1996; С.Н. Белозеров 2000; Э.А. Гаева, 2000; Р.Т. Маннапова 1998; Л.А. Написанова 2004; Е. Draelants, 1995; W. Kerckhoven 1998). Разработка корректной иммунологической диагностики в ситуации, когда заболевание вызвано близкородственными цистицерками и тениями, предполагает создание родоспецифических тест-систем. Решение данной проблемы приведет к своевременному выявлению гельминтозов, а также обеспечит биологическую безопасность окружающей среды и мясопродуктов.
Цель работы - разработать теоретические положения развития адаптивно-приобретенного (вторично-исходного) равновесия в системе паразит-хозяин при цистицеркозах. Провести анализ физико-химических характеристик антигенов, гуморального и клеточного иммунного ответа при онтогенезе паразита в промежуточном и дефинитивном хозяине, научно обосновать применение тест-систем для иммунодиагностики цистицеркозов и тениидозов животных.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Определить белковый состав водно-солевых экстрактов, полученных из разных морфологических структур в онтогенезе гельминтов.
Определить антителогенез у экспериментально инвазированных цистицерками животных.
Определить антигены гельминтов и гуморальные белки хозяина, способные перекрестно реагировать с циркулирующими в крови антителами.
Изучить особенности факторов естественной резистентности при экспериментальном цистицеркозе овец и свиней.
Оценить количественные изменения Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов в крови при экспериментальном и спонтанном цистицеркозе свиней и овец.
Определить динамику Т-лимфоцитов, их популяций и В-лимфоцитов в органах иммуногенеза.
Провести морфометрический анализ структурных компонентов брыжеечного лимфатического узла, селезенки, тимуса.
Изучить количественные изменения клеток костного мозга при экспериментальном цистицеркозе свиней и овец.
Провести оценку сравнительной диагностической эффективности тестов при цистицеркозах свиней, овец на основе ИФР и дот-ИФР.
Дать оценку диагностической эффективности ИФР и дот-ИФР для
определения копроантигенов при кишечной инвазии тениями собак.
Научная новизна. Впервые методами электрофореза в SDS-PAGE (ДСН-ПААГ), иммуноблоттинга определены физико-химические свойства белковых компонентов антигенных экстрактов гельминтов, а также стадио- и видоспецифичные белки метацестод и тений. На основе экспериментальных данных и комплексного исследования иммуно- и онтогенеза при цистицеркозах в системе паразит-хозяин проведен мониторинг антигенов гельминтов и выявлены закономерности их влияния на систему иммунитета при экспериментальных и спонтанных инвазиях. Эти данные подтверждены исследованиями, проведенными на молекулярном, клеточном и органном уровнях. Научная новизна исследований подтверждена патентом на изобретение №2219551 "Способ получения диагностического антигена цестод", 20.12.2003.
Впервые установлено влияние динамики антигенных молекул гельминтов, изменяющихся в процессе онтогенеза, на активность и пропорциональные отношения субпопуляций иммунокомпетентных клеток, морфометрические характеристики иммунокомпетентных органов.
Дополнены основные положения теории "адаптационной толерантности" при гельминтозах, а также предложена схема механизма биологического равновесия в системе паразит-хозяин.
Разработаны принципы иммунодиагностики метацестодозов и тениидозов животных. Впервые разработана диагностическая тест-система на основе дот-ИФР для диагностики антител в крови к возбудителю цистицеркоза свиней и овец (C.taenuicollis). Впервые разработана родоспецифическая тест-система на основе дот-ИФР для выявления копроантигена тений плотоядных.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных теоретических положений развития иммунного ответа хозяина в онтогенезе паразита предложена схема двусторонней адаптивной
толерантности, инициирующая формирование адаптивно-приобретенного равновесия в системе паразит-хозяин.
Проведен мониторинг антигенных свойств белков различных стадий развития гельминтов. На основе изучения антителогенеза при цистицеркозах охарактеризованы диагностические возможности групп белков гельминтов с различными физико-химическими свойствами, показана их диагностическая ценность в разных временных рамках развития тканевых личинок цестод.
Для изучения иммунологических процессов в ходе развития инвазии определено состояние факторов естественной резистентности и установлены структурно-функциональные характеристики центральных и периферических органов иммуногенеза, выявлены процентные соотношения Т- и В-лимфоцитов, их субпопуляций в крови. На основе полученных данных расширены представления о возможных направлениях патогенеза гельминтозов по пути развития аутоиммунных заболеваний животных.
Совместно с коллективом ученых-гельминтологов ВИГИС разработан метод культивирования на искусственных питательных средах клеток цестод для получения их диагностически ценных метаболитов.
На основе анализа диагностических свойств антигенов и сравнительных испытаний эффективности ИФР и дот-ИФР определены принципиальные подходы к выявлению цистицеркозов и тениидозов животных. Предложены схемы ИФР с целью выявления антител в крови к антигенам возбудителя цистицеркозов сельскохозяйственных животных. Разработана методика эффективного определения копроантигенов на основе дот-ИФР, позволяющая выявлять инвазию за месяц до выделения зрелых проглоттид во внешнюю среду.
Результаты научных разработок, положения и выводы вошли в методические рекомендации "Обнаружение копроантигенов тениид собак на основе dot-ELISA", одобренные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 24.12 2002 г. в разработку патента на изобретение №2219551 "Способ получения диагностического антигена цестод" 20.12.2003.
Результаты исследований представлены в учебном пособии «Патогенез и иммунодиагностика гельминтозов». - М.: МГУПБ, 2004. - 52 с. Материалы диссертации используются в цикле лекций по курсу «Инвазионные и паразитарные болезни животных» в разделе «Общая паразитология».
Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР МГУПБ и в рамках кафедральной программы (регистрационный номер 4-9-00-В). Часть исследований проводилась в рамках программы ВИГИС по Российской координационной НТП, заданию 3 - «Разработать новые теоретически обоснованные принципы профилактики паразитарных болезней животных и охраны окружающей среды от паразитов; осуществить поиск экологически безопасных средств, обеспечивающих оздоровление хозяйств с учетом современных достижений биологии, биотехнологии, иммунологии и генетики».
Апробация работы. Результаты научных и экспериментальных исследований доложены на международных научных форумах: 9 - 12-й Московские Международные ветеринарные конгрессы, Москва (2001 - 2004 гг.); 1 - 5-й Международной научно-практической конференции МГУПБ, Москва (1999 - 2004 гг.); Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 2003 г., Москва; Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.05.00; 01.06.00; 20-22.02.01; 22-24.05.02; Москва), заседаниях Ученого совета ВИГИС (1998-2004).
Основные положения, выносимые на защиту:
Сравнительный анализ белковых и антигенных компонентов в
онтогенезе цистицерков и тений (C.bovis, C.taenuicollis, T.saginatus,
T.hydatigena).
Способы получения диагностического антигена.
Динамика антителогенеза и состояние естественной резистентности
животных при экспериментальной инвазии цистицерками.
Иммуноморфологические изменения периферической крови и
органов иммуногенеза в динамике инвазии метацестодами.
Теоретические вопросы развития цистицерков за счет наличия общих белков и рецепторов клеточных структур в системе паразит-хозяин.
Сравнительная диагностическая эффективность ИФР и дот-ИФР при метацестодозах и тениидозах животных.
Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликованы 42 печатные работы, в которых отражено основное содержание диссертации.
Объем работы. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения трех глав собственных исследований, к каждой главе дается краткая литературная справка, обсуждение, заключение, практические результаты, теоретические положения. Содержит 32 таблицы, 51 рисунок. Список литературы включает 450 источников, из них 252 отечественных и 198 зарубежных авторов.
Распространение цистицеркозов
Цистицеркозы сельскохозяйственных животных широко распространены во всех странах мира. Наиболее хорошо изучены цистицеркозы, обусловленные личинками свиного и бычьего цепней, при которых человек является окончательным хозяином. Данные гельминтозы занимают особое место среди ларвальных тениидозов, так как относятся к зоонозам и представляют серьезную проблему для здравоохранения и ветеринарной медицины. Цистицеркозы свиней и жвачных в настоящее время диагностируются посмертно во время ветеринарно-санитарной экспертизы туш и внутренних органов на мясокомбинатах. В "Ежегоднике по заболеваниям животных", который выпускается под эгидой ФАО/ВОЗ/МЭБ, публикуются данные по распространению цистицеркозов-зоонозов разных стран. В монографиях А.С.Бессонова "Тениаринхоз-цистицеркоз" (1988) и "Тениоз Taenia solium-цистицеркоз" (1996) подробно рассмотрены вопросы эпизоотологии двух опасных зоонозов, а также их распространения по всему миру. Страны, имеющие общую границу с Россией, в большинстве своем являются бывшими республиками СССР. Многие данные по распространению цистицеркозов в них можно получить из литературных источников, опубликованных на русском языке. Эпизоотологическая ситуация по некоторым паразитарным заболеваниям в странах бывшего Советского Союза становится угрожающей и в силу сложившихся экономических и социальных условий может существенно влиять на возникновение эпизоотии среди стран-соседей (А.С. Бессонов, 2004). Нами был проведен анализ данных по распространению цистицеркозов, полученных из литературных источников, Центрального статистического управления МСХ РФ и Департамента государственного ветеринарного надзора при Министерстве здравоохранения России. Скопившаяся за последние тридцать пять лет (1965 - 2001 гг.) информация о степени инвазированности сельскохозяйственных животных цистицеркозами в основном отражает закономерности эпизоотического процесса на территории России. В Российской Федерации сведения по распространению тениоза и тениаринхоза, цистицеркозов свиней и крупного рогатого скота достаточно противоречивы. Официальные статистические данные, по мнению Н.Е. Косминкова (1991), позволяют говорить о некотором снижении экстенсивности цистицеркозной инвазии крупного рогатого скота. Вместе с тем, в ряде регионов (Якутия, Алтай, Восточная Сибирь, Кавказ и некоторые другие) снижение экстенсивности инвазии скота данным гельминтозом происходит в настоящее время довольно медленно или даже остается на прежнем уровне. В Центральном Федеральном округе по разным литературным источникам тениаринхоз-цистицеркоз и тениоз-цистицеркоз регистрируют довольно часто (А.С. Бессонов, 1996, 2004; Отчетные данные статистического управления, 2001). Н. П. Родионов (1975) указывал, что уровень инвазии крупного рогатого скота C.bovis в Тамбовской области, составил 0,7 %. В.И. Селезнева (1975) сообщала об уровне зараженности скота 0,7 % в 1968 г. и 0,2 % в 1972 г. Н.С. Архипова и СО. Мовсесян (1973) отмечали рост заражённости скота С. bovis в период с 1965 по 1970 гг. с 0,3 до 0,63 %. Статистика тениаринхоза в Тамбовской области за 1968-1972 гг. свидетельствовала о стабильном уровне заражаемости населения в пределах 0,018-0,021% (В.И. Селезнева, 1975). В Воронежской области в 1965-1970 гг. наблюдалось увеличение экстенсивности цистицеркоза с 0,12 до 1,2% и регистрация заболеваемости населения тениаринхозом в ряде районов области. В Курской области тениаринхоз снизился в перид 1962-1973 гг. с 0,008 до0.003% (Л.И. Прокопенко, А.А. Фролова, 1975а). В 1973 г. в Тамбовской области отмечены единичные случаи цистицеркоза у свиней, а в Курской области Я. Зиморой (1975) установил спонтанное заражение кабана C.cellulosae.
Анализ данных по ветеринарно-санитарной экспертизе туш за пять лет с 1972 по 1976 гг. показал, что наибольшее количество финнозных туш крупного рогатого скота выявлено на Московских мясокомбинатах. Выявлено 9997 туш (или 2 % к переработанным), 7179 (2,0 %), 8754 (2,0 %), 8231 (1,5 %), 7059 (0,5 %) соответственно. С 1996 по 1999 гг. в Московской области на мясокомбинатах цистицеркоз у крупного рогатого скота по данным ветеринарно-санитарной экспертизы обнаруживали в 144; 124; 327 и 126 случаев соответственно. В эти же годы на Липецком мясокомбинате было выявлено наибольшее количество финнозных туш крупного рогатого скота по Центральному Федеральному округу - 1353; 771; 455; 563 соответственно.
Цистицеркоз свиней распространен в Центральном Федеральном округе достаточно широко. По материалам ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов убоя в Рязанской области регистрировали в 1996 г. -12; 1997 - 6; 1998 - 4; 1999 - 3 случая заболевания. Такое же снижение случаев свиного цистицеркоза отмечено в Липецке: 21; 5; 5, а в 1999 г. отмечали увеличение количества выявленных цистицеркозных туш до 18. В Московской области за этот период времени было выявлено 195 цистицеркозных туш свиней (С. cellulosae).
В Москве постоянно регистрируются случаи болезни двух опасных гельминтозов. В Московском дневном гельминтологическом стационаре ежегодно регистрируют 33-42 больных тениаринхозом, среди которых значительную часть составляют иностранцы. А. М. Бронштейн и др. (1993) сообщили, что трое из пяти вылеченных ими больных тениозом (Т. solium) пациентов проживали в Москве и Московской области. По мнению авторов,миграция населения оказывает большое антропогенное влияние на окружающую среду и эпидемиологию цистицеркозов.
По данным Центрального статистического управления МСХ РФ, цистицеркозы овец и коз достаточно широко распространены в Центральном регионе России. Однако в виду того, что дефинитивными хозяевами этих гельминтов являются плотоядные и они мало опасны для человека, то статистика случаев цистицеркозов часто скрывается руководством мясокомбинатов. Вместе с тем, всегда надо помнить, что наряду с цистицеркозами овец и коз, может регистрироваться и эхинококкоз, особо опасное заболевание для человека. Поэтому необходимо обеспечить тщательную ветеринарно-санитарную экспертизу на мясокомбинатах с целью выявления и диагностики возбудителя эхинококкоза.
Вспышки цистицеркозов овец и коз отмечались в Тульской области. В 1993 году было зарегистрировано 323 случая инвазии. В этом же году в Липецкой области было обнаружено 474 цистицеркозные туши овец и коз. Наиболее благополучными по данным заболеваниям являются Московская и Калужская области, где с 1992 по 2000 гг. не обнаружено ни одной цистицеркозной туши. С другой стороны, по данным ЦСУ МСХ РФ, на Московских мясокомбинатах в 2000 г. выявлено 12 случаев метацестодной инвазии овец и коз.
В Северо-Западном Федеральном округе, на Крайнем Севере России, несмотря на широкое развитие свиноводства, цистицеркоз свиней, вызываемый С. cellulosae, не регистрируется (А.С. Артамошин, А.А. Фролова, 1990).
Культуральные методы получения антигенов
Использовать культуры клеток или тканей гельминтов для решения прикладных задач ветеринарии и биотехнологии было предложено достаточно давно. Культуральные работы по гельминтологии можно разделить на два направления: 1) удерживание в искусственной питательной среде определенных стадий развития гельминтов - цистицерков и сколексов, яиц и онкосфер и 2) культивирование отдельных клеток, которые могут быть получены из различных частей стробилы или определенных стадий развития паразитов. Антигены, полученные первым способом, можно назвать культуральными экскреторно-секреторными, а вторым - метаболитами клеточных культур.
В.И. Тараканов (1983) получил пролиферацию клеток герминативной оболочки и протосколексов эхинококковых пузырей до образования гроздьевидных скоплений на 7-14 дни в средах Лейбовича, Уайта и Грейса с добавлением 10 % фетальной сыворотки. Т. Sakamoto (1978) проводил эксперименты по культивированию клеток герминативной оболочки альвеококка в среде NCTC-135. При добавлении экстракта дрожжей и фетальной сыворотки автор наблюдал пролиферацию клеток к 14 дню культивирования.
Soule et al. (1983) изучали состав экскреторно-секреторных продуктов C.bovis, культивируемых в среде NCTC-135. Авторами обнаружен антиген, который давал положительную реакцию с сыворотками экспериментально зараженных бовисными цистицерками телят. При цистицеркозе крупного рогатого скота наиболее высокими диагностическими качествами обладали секреторно-экскреторные продукты по сравнению с общим антигенным экстрактом T.saginatus.
Одним из важных направлений работы in vitro с гельминтами является культивирование в искусственных питательных средах онкосфер тений. Этапы развития онкосфер E.granulosus, T.hydatigena, T.serialis, T.pisiformis и T.ovis и гистологию метацестод детально описали D.D. Heath и J.D. Smyth (1970). Авторам удалось добиться развития личинок до формирования сколексов с продолжающимся ростом цист.
Вполне естественно, что многие исследователи испытывали полученные метаболиты гельминтов в качестве диагностических или протективных антигенов. M.D. Rickard и A.J. Adolph (1977) разработали методы культивирования онкосфер in vitro (T.ovis). Авторами предложено использовать специфические культуральные антигены онкосфер для дифференциальной диагностики цистицеркозов домашних животных.
СТ. Edwards и Y.I. Herbert (1982) испытали лиофилизированный онкосферальный секреторный антиген M.multiceps с целью защиты овец от различных личиночных форм цестод. Секреторный антиген, полученный культивированием онкосфер, можно было использовать для вакцинации овец сразу против четырех видов метацестод (Т. ovis, Т. hydatigena, E.granulosus, M.multiceps).
Н.Е. Косминков с соавт. (1986) для вакцинации овец против ценуроза использовали онкосферы М. multiceps и их метаболиты, после двухсуточного культивирования в среде 199 с добавлением в нее сыворотки крови крупного рогатого скота. Аналогичные эксперименты были проведены Т.И. Скрынниковой (1993). Автором получены положительные результаты при использовании в качестве вакцины онкосферально-секреторного антигена M.multiceps.
О.A. Onawunmi и G.C. Coles (1980) иммунизировали трех ягнят концентрированной культуральной жидкостью T.hydatigena, предварительно эмульгировав ее, с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Ягнятам через три недели после иммунизации выпаивали жидкость, содержащую 2000 яиц. При убое животных у двух вакцинированных овец не былообнаружено цист гельминтов, а у одного - нашли 13 цист, в то время как у контрольных животных в среднем выявляли по 236 личинок в каждой туше.
M.D. Richard, J.L.Brumley, G.A.Andersen (1982) для приготовления протективных антигенов использовали онкосферы Taenia hydatigena, культивированные in vitro в течение 14 дней. После окончания культивирования процистицерки разрушали ультразвуком. Животные, иммунизированные полученной культуральной средой, показали среднее снижение степени инвазии (51,6 %) по сравнению с контрольными.
Н.И. Шумова (1994) проводила эксперименты по удержанию онкосфер T.hydatigena в искусственных питательных средах. Практической стороной ее исследований оказалось применение двухсуточной культуральной жидкости вместе с процистицерками в качестве протективных антигенов. Автор делает заключение, что для предотвращения заболевания овец тенуикольным цистицеркозом целесообразно дважды иммунизировать ягнят с интервалом в 21 день двухсуточной культурой процистицерков T.hydatigena в дозе 2000 экземпляров на одно введение.
Характерным свойством пролиферирующих клеток является их способность к делению. У клеток животного происхождения митотический цикл составляет примерно 10 - 24 ч. Н.П. Лукашенко, В.В. Бржевский и др. (1965) культивировали герминативную оболочку альвеококка и наблюдали появление в среде 199 отдельных клеток паразита. Через 12 ч клетки начинали делиться, имели 18 диплоидных хромосом и находились в стадии метафазы или телофазы. Т. Sakamoto et al. (1967), M.D. Rickard, K.J. Bell (1971), M. Stay, R. Wahl, W.H. Beierwaltes (1984) проводили работы с культурами клеток гельминтов и сделали заключение о возможности использования этих методов для получения необходимого антигенного материала и конкретных биопрепаратов.
Следует отметить, что клеточная технология получения антигенного материала гельминтов имеет ряд преимуществ: клетки можно получать из различных стадий развития или морфологических компонентов гельминтов,длительное время сохранять их функционирование и отбирать биологический материал в динамике развития клеточной популяции.
Таким образом, культивирование клеток гельминтов с целью получения диагностических антигенов, которые к тому же могут обладать протективными свойствами, является достаточно перспективным направлением.
Водно-солевые экстракты цестод, их диагностичеекая ценность
Полученные первичные экстракты представляли собой набор соматических (потенциальных) антигенов, растворы белков в фосфатно-солевом буфере. Раствор имел вид нетягучей, мутноватой жидкости с концентрацией по белку до 7 мг/мл. Полученные экстракты хорошо разводились в буферных растворах до необходимой концентрации по белку. Также их можно было легко концентрировать даже методом испарения при комнатной температуре. Методы разрушения тканей гельминтов и экстракции белковых молекул, которые мы использовали, оказались эффективными и легко выполнимыми. Наибольший выход белка в экстракты мы получали при гомогенизации тканей гельминтов в специальном устройстве Поттера-Эвельгейма. Однако, поскольку данный гомогенизатор стеклянный, то не является долговечным и в лабораториях может отсутствовать. В этом случае легко применить второй испытанный нами способ - поэтапного замораживания и оттаивания с растиранием тканей гельминтов, который вполне может использоваться в лабораторной практике с целью получения белковых экстрактов гельминтов. Хранение всех экстрактов при -20 С, как и их лиофилизация, не снижали диагностической ценности, по крайней мере, в течение двух лет.
Все полные экстракты соматических антигенов мы проверяли на присутствие диагностических компонентов в ИФР на полистироловых планшетах, используя идентичную коллекцию сывороток крови. Контролем служили 10 сывороток от спонтанно зараженных C.bovis и 5 - от C.tenuicollis голов крупного рогатого скота, 10 сывороток - от свиней, спонтанно инвазированных C.tenuicollis, 10 сывороток - от спонтанно инвазированных C.tenuicollis овец. Положительным контролем являлись сыворотки крови от экспериментально зараженных животных: 9 телят на 36 день инвазии C.bovis, 3 телят, экспериментально зараженных C.taenuicollis, 9 поросят -C.tenuicollis, 9 ягнят - C.tenuicollis на 40 день инвазии. Отрицательнымконтролем служили 100 сывороток крупного рогатого скота из благополучной по цистицеркозу зоны и по 50 сывороток от свиней и овец, не пораженных C.tenuicollis (по данным ветеринарно-санитарной экспертизы мясокомбинатов).
Как видно из данных, представленных в табл. 1, экстракты зрелых концевых члеников, имели 100%-ную чувствительность при экспериментальной инвазии. Причем, с помощью T.hydatigena успешно диагностировали цистицеркозы крупного рогатого скота (C.bovis и C.taenuicollis), а также цистицеркозы свиней и овец (C.taenuicollis). Экстракт, полученный из концевых проглоттид T.saginata, также во всех четырех случаях имел 100%-ную чувствительность при экспериментальной инвазии. Подобные результаты имели место и при использовании из передней части стробилы T.hydatigena и T.saginata.
Интересно, что экстракты, полученные из цистицерков C.tenuicollis показали незначительно, но все-таки более низкую чувствительность, чем таковые из стробилы T.hydatigena. Например, при диагностике экспериментального бовисного цистицеркоза из 9 инвазированных телят было выявлено только 8. В остальных случаях экспериментальной гомологичной инвазии - цистицеркозы свиней и поросят выявляли в 100% случаях.
Экстракт, полученный из метацестод Е. granulosus, показал достаточно низкую чувствительность при диагностике экспериментальных цистицеркозов. Из 9 инвазированных телят только 5 дали положительный ответ. Из трех телят инвазированных C.taenuicollis сыворотки двух показали положительный результат. Сыворотки крови от 9 экспериментально инвазированных поросят и ягнят дали положительные ответы в 4 и 5 случаях, соответственно. Очевидно, результаты зависят от соотношения диагностически ценных компонентов в экстрактах и возможно отсутствия некоторых из них.
При спонтанной инвазии C.bovis наиболее чувствительными оказались антигены из концевой части T.saginatus. Белки мигрирующих форм T.hydatigena выявляли у 5 из 10 спонтанно инвазированных C.bovis коров. С другой стороны, этот же антиген при спонтанной инвазии C.tenuicollis крупного рогатого скота показал очень высокую чувствительность, им выявлено 9 из 10 зараженных животных. Более того, тесты для диагностики спонтанных цистицеркозов свиней и овец были лучшими, если использовали в качестве антигена экстракт разрушенных личиночных форм. При цистицеркозе овец наилучшим антигеном оказался водно-солевой экстракт из мигрирующих личинок, наиболее низкую чувствительность показал антиген из концевой части стробилы T.saginata.
Антигены, полученные из E.granulosus, перекрестно реагировали с двумя сыворотками коров, спонтанно зараженных C.bovis, и с двумя сыворотками крови овец, зараженных C.tenuicollis. Сыворотки крови от инвазированных свиней не давали перекрестных положительных ответов с эхинококкозным антигеном.
При исследовании сывороток крови незараженных голов крупного рогатого скота наибольшее число ложно-положительных ответов получено с антигеном концевых проглоттид T.saginata. Значительно меньшее число ложно-положительных реакций мы получили при испытании на этой же коллекции сывороток антигенов из мигрирующих форм личинок.
При исследовании сывороток крови от свиней, неинвазированных гельминтами, наименьшее число ложно-положительных ответов нами получено при использовании антигенов из концевых проглоттид T.hydatigena (5 из 50). В случаях, когда применяли антигены из передней части T.saginata, было получено 8 ложно-положительных ответов из 50 исследуемых проб.
Следует отметить, что антигены, полученные из E.granulosus показали довольно много ложно-положительных ответов на сыворотках крови незараженных животных - 19 из 100 обследованных голов коров, 9 из 50 обследованных свиней, 10 из 50 обследованных овец (табл. 2).
Таким образом, антигенные экстракты, полученные в фосфатно-солевом буфере, обладали достаточно широким набором диагностических компонентов, что и позволяло с их помощью диагностировать цистицеркозные заболевания крупного рогатого скота, овец и свиней при экспериментальной и спонтанной инвазии, гомологичными и гетерологичными антигенами. Антигенные экстракты из различных морфологических структур тений и стадий развития, а также трех видов гельминтов имеют общие компоненты, которые можно использовать для диагностики гетерологичных гельминтозов. С другой стороны, содержание неспецифических компонентов и возможно белков хозяина обеспечивает довольно большое количество ложно-положительных реакций.
Таким образом, наибольшее количество диагностических компонентов было обнаружено в следующих экстрактах: личинок Т.пЭКС4 и концевых проглоттид Т.ЮКС1 (для обнаружения животных с тонкошейным финозом), а также концевых проглоттид T.s3KCl (для обнаружения животных с бовисным цистицеркозом).
Иммунодиффузия в гельПрименив реакцию двойной диффузии в агаровом геле с сыворотками от спонтанно инвазированных C.bovis коров против антигенного экстракта задней части стробилы T.saginatus, мы обнаружили четыре антигенных компонента. Им соответствуют комплексы антиген-антитело, обладающие различной скоростью диффузии и образующие линии преципитации между
Метаболиты клеточных культур гельминтовФракции антигенных экстрактов при хроматографических разделениях
Они имели высокий уровень ответа в ELISA при исследовании как спонтанной, так и экспериментальной инвазии 0,8 и 1,4, соответственно. Интересно отметить, что при экспериментальном и спонтанном заражении ягнят T.hydatigena сыворотки крови имели антитела, которые можно было выявлять метаболитами гетерологичных гельминтов - клеток протосколексов E.granulosus.
Метаболиты, полученные из клеток мигрирующих личинок (Мет.4), были активными и показывали значения в ELISA - 0,7 при спонтанной и 1,2 при экспертиментальной инвазии. К тому же с этим антигеном были наиболее хорошо воспроизводимые результаты реакции.На рис. 16 показано взаимодействие клеточных метаболитов (Met.4) с сыворотками зараженного цистицеркозом и незараженного ягненка. Как видно из рисунка у зараженного животного образуются антитела на антигенные компоненты молекулярной массы 35; 5 и 67 кДа.
Рис.16. Результаты иммуноблоттинга с сыворотками крови овецТаким образом, лучшей питательной средой оказалась ДМЕМ, наиболее продуктивной культурой клеток была признана культура, полученная из быстрорастущих личинок 4-дневного возраста. Лучшие диагностические свойства выявлены у метаболитов - Met.4, полученных на 10-й день культивирования клеток 4-дневного возраста личинокФракции антигенных экстрактов при хроматографических разделениях
Хроматографическим способом - гельфильтрацией при разделении водно-солевых экстрактов гельминтов на Toyopearl HW-55 (Fine) с использованием УФ- Экстракты стробил тений (T.h.l и T.h.2) разделялись на четыре белковых пика менее рельефно, чем экстракты мигрирующих личинок (T.h.4). Полученные фракции белков включали в себя содержимое 10 пробирок по 2 мл в каждой. Наиболее активными были компоненты с молекулярной массой около 85 кДа. Во всех разделенных экстрактах имелись подобные компоненты, однако эффективность их применения в ELISA в качестве диагностических антигенов была разной. При диагностике экспериментального бовисного цистицеркоза оптимальным было применение в качестве диагностического антигена 85 кДа, полученного из T.h.l. В случаях диагностики спотанного бовисного цистицеркоза наиболее выгодно можно было применять фракцию с меньшей молекулярной массой20 - 40 кДа. Высокомолекулярные фракции 100 кДа часто давали ложноположительные реакции. С целью диагностики цистицеркоза овец (C.taenuicollis) с большей эффективностью применяли гомологичные антигены - при спонтанной инвазии - 20 кДа и ниже, а при экспериментальной инвазии 60-90 кДа, выделенные из экстрактов мигрирующих личинок.
Как видно, из хроматограмм, полученных на FPLC (рис. 19-21), экстракты гельминтов имеют достаточно разные белковые спектры. Наименьшее количество пиков имеет экстракт из мигрирующих личинок T.hydatigena. С учетом минорных компонентов нам удалось получить 7 разных групп белков. Более массивные группы белков были выделены в экстракте личинок (пузырей) Е.granulosus. К тому же пиков было больше и, вместе с минорными компонентами, мы легко насчитывали 11 разных групп белков.
Наиболее удачное разделение на фракции нам удалось провести с экстрактом Т.п.ЭКС 1. Мы получили 10 пиков, каждый из которых представлял собой большую группу белков, так что количество минорных компонентов равнялось двум. Необходимо отметить, что все исследуемые экстракты имели много общих по физико-химическим свойствам белков. Поэтому белки, выходящие по фракциям, были максимально приближены друг к другу по времени выхода с колонки. К сожалению, количество белка обнаруженное в каждой фракции не позволяло оценить ее диагностическую ценность в ELISA.
Ионообменная хроматография, проведенная при разделении водно-солевых экстрактов гельминтов, показала, что все исследуемые пробы имели одинаковые группы антигенов. Нами было выделено три фракции, разделенные по принципу электростатического взаимодействия белковых молекул с сорбентом. Следует отметить, что только две из трех фракций обладали антигенной активностью. Фракция №2 содержала более чем один пик, и это было установлено впоследствии при инообменной хроматографии на FPLC. Внутри рода между видами исследуемых тений и цистицерков было выявлено сродство антигенных компонентов и возможность их использования в диагностике гомологичных и гетерологичных гельминтозных болезней. Наибольшей активностью в ELISA обладала фракция, полученная при элюции между 0,2 и 0,4 М. Фракции второго пикаобладали большей преципитирующей активностью в иммунодиффузии. Третья фракция показала отсутствие специфичности в ELISA и не выявляла ни одной положительной сыворотки от экспериментально зараженных животных.
Афинная хроматография на сефарозе 4В обеспечивала выход одного пика белка, который имел слишком разнообразные по размеру, заряду молекулы и мог быть использован в качестве диагностического антигена только при цистицеркозе тенуикольном у овец и свиней. При использовании аффинного антигена с сыворотками крови от животных старше 1 года нами было получено около 40 % ложноположительных реакций, которые не подтверждались результатами ветеринарно-санитарной экспертизы мясокомбинатов. Диагностический тест, в котором использовался аффинный антиген, выявлял 6 из 10 спонтанно зараженных C.taenuicollis овец, а у свиней 7 из 10. Наиболее точные результаты нами были получены при постановке реакции с сыворотками крови ягнят текущего года рождения. При попытке использовать аффинный антиген для диагностики гетерологичной инвазии мы получили 50 % чувствительности и 60 % специфичности.
В дальнейшем мы использовали метод аффинной хроматографии только для истощения антигенных экстрактов от белков хозяина, что позволяло нам повысить специфичность диагностической реакции.
