Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в России возросла частота встречаемости женского бесплодия, патологии и невынашивания беременности (Кулаков В.А 2004, Кузьменко Е.Т., 2008) Современные темпы прироста населения России по определенным причинам настолько снизились, что задача повышения рождаемости выросла в ранг актуальной медико-социальной проблемы
Факторами, способными оказать негативное влияние на женскую
репродуктивную функцию, являются: алкоголизм, курение, наркомания, стрессы, снижение иммунитета (Айламазян Э К. 1996,2000, Сухих Г.Т, Вакько Л В, 1997, Серов В.Н., Пауков СВ. 1998, Малышева 3 В. 2000) Роль вирусных инфекций на этапах онтогенетического развития яичников, в том числе внутриутробном, когда происходит становление овогенеза и его первый ответственный этап - профаза 1-го деления мейоза, у человека не изучена.
Современные научные исследования сосредоточены в основном на изучении внутриовариальных и интрафолликулярных механизмов регуляции фолликулогенеза, поскольку данные механизмы играют ведущую роль в селекции половых клеток для овуляции, модулируя центральные нейро-гуморальные сигналы, воздействующие на яичники (Вихляева Е.М 1997) Исследований, посвященных изучению роли вирусных инфекций (в том числе - герпес-вирусной инфекции) в развитии женского бесплодия, сравнительно немного, и такие важные вопросы как структурно-функциональное состояние яичников, качество фолликулогенеза и селекции половых клеток для овуляции, состояние центральной и внутрияичниковой регуляции фолликулогенеза при герпес-вирусной инфекции практически не решены.
Вирус простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2), входящий в семейство Herpesviridae, является нейро- и эпителиотропным (Исаков В А. Рыбалкин СБ. Романцов М Г. 2006), в связи с чем вполне возможно его направленное негативное влияние на гистофизиологию яичников, в осуществлении которой эпителиальные тканевые производные играют ведущую роль.
ВПГ-2 является этиологическим фактором генитального герпеса, занимающего по данным ВОЗ третье место среди инфекций, передающихся половым путем (Тарасова Л А., Сорокина Н.С, Лагутина Г.Н 1999). В России генитальным герпесом страдает 6-10% населения (Исаков В А. Рыбалкин СБ. Романцов М.Г. 2006). Помимо риска
инфицирования плода во время беременности и родов, ВПГ-2 может поражать органы малого таза, в том числе - яичники, матку и маточные трубы (Молочков В.А . 2005), однако персистенция ВПГ-2 в клетках этих органов остается недоказанной
Все вышеизложенное определяет актуальность изучения герпес-вирусной инфекции в проблеме репродукции и является основой выбора цели и задач настоящего исследования.
Цель исследования - изучить морфо-функциональное состояние яичников морских свинок в экспериментальной модели рецидивирующего генитального герпеса
Задачи:
-
Провести сравнительный морфологический и количественный анализ процессов фолликулогенеза и атрезии в яичниках интактных морских свинок и животных в периоды ремиссии и обострения генитального герпеса;
-
Выявить особенности атрезии фолликулов в условиях генитального герпеса;
-
Дать оценку ультраструктурной организации овоцитов и соматических клеток фолликулов на разных стадиях развития (и атрезии) в норме и эксперименте;
-
Оценить состояние стромального компонента яичников в условиях влияния вируса простого герпеса 2-го типа;
-
Выявить характер реактивных изменений внутриовариальной сети в модели генитального герпеса,
-
Произвести иммуноцитохимическую детекцию антигенов вируса простого герпеса 2-го типа в фолликулах и строме яичников животных с рецидивирующим гениальным герпесом.
Основные положения, выносимые на защиту
-
В экспериментальной модели рецидивирующего генитального герпеса в яичниках морских свинок возникают нарушения фолликулогенеза и селекции доминантных фолликулов;
-
Наиболее выраженные изменения фолликулогенеза происходят при обострении генитального герпеса по сравнению с периодом ремиссии;
-
Атретический процесс в условиях действия ВПГ-2 имеет специфические проявления, отличающие его от физиологической атрезии,
-
ВПГ-2 персистирует в соматических клетках атретических фолликулов, эпителии внутриовариальной сети, фибробластах;
5. Выявленные реактивные изменения яичников в виде активации атрезни и кистообразованиа фолликулов, структурно-функциональных изменений стромы и внутриовариальной сети являются следствием действия ВПГ-2 и лежат в основе ановуляции в экспериментальной модели генитального герпеса.
Научная новизна
Впервые проведено исследование гистофизиологических особенностей яичников половозрелых морских свинок в экспериментальной модели рецидивирующего генитального герпеса.
Получена новая информация о состоянии фолликулогенеза, структурном статусе стромы яичников и изменениях интраовариальной сети у инфицированных морских свинок в периоды ремиссии и обострения герпетической инфекции. Получены свидетельства активации гибели овариальных фолликулов на всех стадиях развития и выявлены существенные отличия атретического процесса у инфицированных животных от гистологических и ультраструктурных параметров физиологической атрезии.
Полученные результаты иммуноцитохимической детекции антигенов ВПГ-2 позволили впервые определить его клеточные и субклеточные мишени в яичнике и подтвердить причинно-следственную связь между ВПГ-2 и результатами гистологического исследования гонад.
Практическая значимость
Использованная в диссертационной работе экспериментальная модель рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекции у морских свинок может применяться в исследованиях системы репродукции при ВПГ-2-инфекции, а также при проведении доклинических испытаний фармакологических препаратов, предназначенных для лечения и профилактики герпес-вирусных инфекций.
Выявленные изменения тканевых и клеточных систем яичников у подопытных морских свинок могут служить базисом для дальнейших научных исследований герпес-вирусных инфекций в этио-патогенезе женского бесплодия
Апробация и внедрение результатов
Результаты исследования доложены на 2-м Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения-2007'; 2-й Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008); 14-й
конференции "Актуальные проблемы патофизиологии" (С-Петербург, 2008), 22-й конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2008); 50-м Международном Симпозиуме по гистохимии (Швейцария, Интерлейкен, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 - в центральной печати.
Объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4-х глав: обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение и выводов; изложена на И1 страницах машинописного текста. Материалы иллюстрированы S таблицами и 4S рисунками. Библиографический указатель содержит 234 источников; из них 86 отечественных и 148 зарубежных авторов.
Для создания экспериментальной модели рецидивирующего генитального герпеса в качестве лабораторных животных были использованы морские свинки, весом 450-500г, которые были получены из центрального вивария ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Экспериментальная модель рецидивирующего генитального герпеса (Stanberry L.R. 1982) создана сотрудником лаборатории цитокинов к.б.н. А М. Ивановой под руководством зав лаб. цитокинов д б н. А.Н. Наровлянского
Все исследования на животных выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977), а также с "Международными правилами использования животных в экспериментах" (1991).
Работа с животными и их интравагинальное инфицирование ВПГ-2 проводились с соблюдением правил противовирусной безопасности.
Для инфицирования животных использовали штамм MS вируса простого герпеса 2-го типа в концентрации 10 PFU, в дозе 0,1 мл (Stanberry L.R. 1989).
Обострение рецидивирующего генитального герпеса у морских свинок достигалось путем общего однократного 10-минутного ультрафиолетового облучения морских свинок (Stanberry L.R. 1989) с использованием ультрафиолетовой лампы (60 Вт)
Взятие материала производили от животных, получивших передозировку паров хлороформа
Объектом исследования служили ISO яичников морских свинок. Экспериментальные группы
Для изучения изменений в яичниках под влиянием ВПГ-2 типа в условиях in vivo нами использована модель рецидивирующего генитального герпеса как экспериментальный эквивалент хронического инфекционного процесса у человека
Свидетельством того, что гениальный герпес у морских свинок приобрел хроническую рецидивирующую форму было периодическое появление у животных характерных мелковезикулярных высыпаний на гилеремированных и отечных наружных гениталиях
Морские свинки были распределены на 3 группы 1-я группа (контроль) состояла из интактных половозрелых самок морских свинок (пЗО), которые содержались изолированно от инфицированных животных,
во 2-ю группу входили половозрелые самки (пЗО), инфицированные ВПГ-2, и находящиеся в стадии ремиссии рецидивирующего генитального герпеса;
3-ю группу составили инфицированные ВПГ-2 типа половозрелые самки морских свинок (пЗО) в стадии обострения рецидивирующего генитального герпеса
У всех морских свинок забирались вагинальные мазки для определения фазы эстрального цикла. Мазки окрашивали 1% раствором метиленовой сини и микроскопировали.
Методы исследования
Для решения поставленных задач использованы методы'
световой микроскопии серийных гистологических срезов яичников;
трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов яичников;
метод морфометрии;
иммуноцитохимический метод
Для светооптического исследования яичники морских свинок фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, дегидратировали в батарее спиртов восходящей концентрации и ксилоле, заливали в парафиновые блоки. Готовили серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
Морфометрический анализ основывался на фундаментальных работах Автандилова Г.Г. (1969, 1973, 1989, 2000), Сгефанова СБ. (1974) и заключался в маркировании и подсчете фолликулов на компьютерных изображениях серийных
срезов яичников. Определялось общее содержание фолликулов в яичниках, процентное соотношение здоровых и атретических фолликулов по стадиям развития В качестве критериев инициации атрезии применялся критерий численности пикнотических ядер фолликулярных эпителиоцитов в срезах фолликула (A.HiershfieId,1973).
Для оценки степени активности атретического процесса нами предложен индекс атрезии фолликулов, который вычислялся как отношение количества всех атретических форм фолликулов к общему числу фолликулов, присутствующих в яичнике
Морфометрировался каждый пятый срез яичников; увеличения микроскопа варьировали в зависимости от величины измеряемого объекта. При подсчете примордиальных и первичных однослойных фолликулов общее увеличение микроскопа составляло - х400; первичных многослойных фолликулов - х200; вторичных фолликулов - ХІ00.
Подсчитывались также общая площадь яичников и площадь кистозного комплекса яичников (совокупности фолликулярных кист и кист из канальцев внутриовариальной сети), определялось их соотношение. Измерения производили с помощью микрометрической сетки с шагом 1,25 мм. Площадь одного малого квадрата сетки при общем увеличении микроскопа х 32 была равна 0,0488 кв.мм. Общая площадь яичника и кистозного комплекса вычислялась как произведение количества малых квадратов, приходившихся, соответственно, на весь яичник и кистозный комплекс на известную площадь.
С8етооптический анализ и фотосъемку гистологических препаратов производили с помощью микроскопа "Axiostai plus" (фирма "ZEISS") с набором объективов 3,2х, 10х,20х,40х,100х
Для ультраструктурного анализа использован метод трансмиссионной электронной микроскопии
Яичники морских свинок префиксировали по методу Ито-Карновски (Уикли Б С. 1975), отмывали в какодилатном буфере, дофиксировали в 1% растворе Os04 в течение 1 часа с последующей отмывкой в какодилатном и малеатном буферах и дальнейшей обработкой 1% раствором уранилацетата. После дегидратации в спиртах восходящей концентрации материал заливали в метакрилатную смолу LR White. На ультратоме LKB-I11 готовили полутонкие срезы, которые окрашивали 1% раствором метиленовой сини и буры. На полутонких срезах определяли участки для прицельной заточки Ультратонкие срезы (300-500А) контрастировали 1% раствором уранилацетата и цитрата свинца по методу Рейнольдса (Уикли Б.С. 1975).
Детекция вируса простого герпеса 2-го типа в клетках яичников производилась с помощью непрямой иммуноцитохимической реакции с использованием поликлональных кроличьих антител к ВПГ-2 (НПФ "ЛабДиагностика"). Готовые неконтрастированные ультратонкие срезы на медных сетках промывали 10 в дистиллированной воде и 30' инкубировали в 5% растворе нормальной сыворотки (бычий сывороточный альбумин). В течение последующих 2-х часов сетки инкубировали с антителами к ВПГ-2 в термостате при температуре 37 "С. Для контроля неспецифического связывания антител отдельные сетки были оставлены в 5% растворе нормальной сыворотки на 2 часа при комнатной температуре. Далее сетки промывались в фосфатном буфере 2 раза по 15', после чего ультратонкие срезы инкубировали с кроличьими антителами, коньюгированными золотом (10нм) в течение 1 часа с последующей промывкой в фосфатном буфере (2 раза по 15 ). Ультратонкие срезы в течение 10 ' фиксировали в растворе Ито-Карновски, промывали в дистиллированной воде 5 и контрастировали 15 в 1% спиртовом растворе уранилацетата и 4 - в растворе цитрата свинца. После проведения иммуноцитохимической реакции ультратонкие срезы анализировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B при инструментальном увеличении в диапазоне от 15000 до 40000.
Все полученные данные подвергались статистической обработке с помощью IBM PC и компьютерной программы "Statistica 6,0". Учитывались и анализировались следующие основные параметры: среднее арифметическое значение (М), ошибка среднего арифметического значения (±т) и среднее квадратичное отклонение (±с) Оценка достоверности различий сравниваемых показателей проводилась с использованием t - критерия Стьюдента, когда распределение подчинялось нормальному закону, и непараметрических критериев (Вилкоксона, Манна-Уитни) - в случаях выборки п < 30.
