Содержание к диссертации
Введение
Часть І. Обзор литературы
Глава 1.1. Классификация вирусов герпеса. Общая характеристика вируса герпеса простого и его репродукция в клетке 12
1.1.1. Особенности строения вирионов ВГП 14
1.1.2. Репродукция вируса герпеса простого в клетке 17
Глава 1.2. Врожденный иммунитет при герпетической инфекции 24
1.2.1.Механизмы противогерпетического врожденного иммунного ответа 24
1.2.2. Противомикробные пептиды 32
Глава 1.3. Генитальный герпес: клиника и лечение 37
1.3.1. Возникновение, развитие и течение герпетической инфекции.37
1.3.2. Противогерпетические препараты 39
1.3.3. Суперлимф - иммуномодулирующий препарат с антимикробным и противовирусным действием 43
Часть II. Собственные исследования.
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Перевиваемая линия клеток Vero 46
2.2. Вирусы герпеса простого 1 и 2 типов 47
2.3. Характеристика препарата Суперлимф и его фракций 49
2.4. Метод электронной микроскопии 50
2.5. Выделение из клеток Vero общей ДНК 52
2.6. Выделение из клеток Vero общей РНК 53
2.7. Реакция обратной транскрипции 54
2.8. Полимеразная цепная реакция 54
2.9. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека: 56
2.10. Определение содержания цитокинов в культурах мононуклеарных клеток методом иммуноферментного анализа 57
2.11. Статистическая обработка результатов 58
Глава 3. Результаты и обсуждение 59
3.1.Разработка экспериментальной модели для оценки противогерпетического действия препарата Су пер лимф 59
3.1.1. Оценка действия препарата Суперлимф на клетки Vero.60
3.1.2. Влияние препарата Суперлимф на цитопатическое действие вируса герпеса простого в культуре клеток Vero 63
3.2. Механизмы противогерпетического действия препарата Суперлимф в культуре клеток Vero 74
3.2.1. Электронно-микроскопические исследования действия препарата Суперлимф на репродукцию ВГП-1 в культуре клеток Vero 74
3.2.2. Изменение репликации вирусной ДНК в клетках Vero, обработанных препаратом Суперлимф 79
3.2.3. Изучение изменения уровня экспрессии вирусных белков (ІСР0 и тимидинкиназы) при действии препарата Суперлимф 83
3.2.4. Оценка влияния отдельных фракций препарата на цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 90
3.2.5. Сравнительная характеристика противовирусного действия рекомбинантного ИФНсс и препарата Суперлимф 96
3.3. Исследование прямого действия препарата Суперлимф на вирионы ВГП-1 97
3.4. Изучение влияния препарата Суперлимф на выработку ИЛ-12 и ФНОа мононуклеарными клетками периферической крови больных генитальным герпесом 101
Заключение 107
Выводы 117
Список литературы 118
Приложение 128
- Репродукция вируса герпеса простого в клетке
- Суперлимф - иммуномодулирующий препарат с антимикробным и противовирусным действием
- Влияние препарата Суперлимф на цитопатическое действие вируса герпеса простого в культуре клеток Vero
- Изучение влияния препарата Суперлимф на выработку ИЛ-12 и ФНОа мононуклеарными клетками периферической крови больных генитальным герпесом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Герпетическая инфекция является одним из наиболее распространенных и опасных вирусных заболеваний человека. Легкость инфицирования, латентное и пожизненное течение, развитие вторичного иммунодефицита, а также других серьезных осложнений, делают актуальной разработку методов эффективной профилактики и лечения заболеваний герпесвирусной этиологии [Баринский И.Ф. и др. (1986), Yasin В. et al. (2000)].
Механизмы врожденного иммунного ответа при вирусной инфекции характеризуются способностью к быстрому индуцированию, относительно низкой специфичностью и состоят из трех основных фаз. В первой из них вирус подвергается атаке комплемента, природных антител и противомикробных пептидов. Во второй фазе в действие включаются интерфероны 1 типа (а и р), секретируемые инфицированными эпителиальными клетками. Наконец, в третьей фазе борьбу с вирусом продолжают быстро мобилизованные клеточные эффекторы - нейтрофилы, макрофаги и естественные киллеры и секретируемые ими цитокины [Duerst R et al. (2003)].
Вторичный иммунодефицит, развивающийся при герпетической инфекции, характеризуется избирательным поражением клеток макрофагально-моноцитарного ряда, дефектом в системе интерферонов и других цитокинов.
В связи с этим лечение герпетической инфекции основано на следующих подходах:
-проведении специфической противовирусной терапии
химиотерапевтическими препаратами, блокирующими размножение вируса (ацикловир, валтрекс и др.);
-осуществлении заместительной терапии препаратами интерферонового ряда и индукторами интерферонов;
-применении иммуностимуляторов, активирующих реакции врожденного и адаптивного иммунитета [Ершов Ф.И. и др. (2001), Петров Р.В. идр. (1999)].
В последние годы ведется активный поиск иммунотропных препаратов с прямым противовирусным действием. В середине 80-х годов прошлого столетия Д.Лерером и В.Н.Кокряковым был открыт новый класс низкомолекулярных катионных пептидов - протегринов, обладающих противомикробной активностью. Эндогенные пептиды играют значительную роль в защите организма при бактериальной и вирусной патологии, подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, грибов и некоторых вирусов. Их по праву называют природными или эндогенными антибиотиками [Кокряков В.Н. (1999), Lehrer R. et al. (2002)]. В настоящее время ведутся работы по созданию новых лекарственных препаратов на основе противомикробных пептидов.
На кафедре иммунологии РГМУ разработан оригинальный препарат Суперлимф - иммуномодулятор с прямым противомикробным действием [Ковальчук Л.В. и др. (1995), Ганковская Л.В. и др. (2005)]. По своему составу Суперлимф - это сбалансированный комплекс с активностью ряда цитокинов: интерлейкина-1/3 (ИЛ-1/3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли (ФНО), миграцию ингибирующего фактора (МИФ), трансформирующих факторов роста pi (ТФРР1) и (J2 (ТФРР2) и противомикробных протегрин-подобных пептидов [Ковальчук Л.В. и др. (2003)].
Суперлимф обладает широким спектром влияния на клетки, участвующие в реакциях врожденного иммунитета: макрофаги, нейтрофилы и естественные киллеры. Препарат активирует фагоцитоз, выработку цитокинов и активных форм кислорода моноцитами, индуцирует противоопухолевую активность макрофагов, способствует гибели внутриклеточных паразитов, регулирует миграцию лейкоцитов. Вследствие активации клеток макрофагально-моноцитарного ряда под влиянием Суперлимфа включаются механизмы адаптивного клеточного и гуморального иммунного ответа.
В настоящее время активно изучаются антибактериальные и противовирусные эффекты Суперлимфа. Показано, что препарат, помимо иммуностимулирующего действия, способен непосредственно подавлять рост и
размножение таких микроорганизмов, как St. aureus и Е. соК [Ковальчук Л.В. и ДР. (2003)].
В культуре клеток эндотелия пупочной вены человека, инфицированных вирусом герпеса простого 1 типа (ВГП-1), была показана противовирусная активность Суперлимфа [Щегловитова О.Н. и др. (1999)]. Продемонстрирована высокая эффективность препарата в комплексном лечении генитального герпеса [Сакун Н.Ю. и др. (2000), Ковальчук Л.В. и др. (2005)]. Вместе с тем, механизмы противогерпетического действия препарата Суперлимф до настоящего времени изучены недостаточно.
Цель работы: изучение механизмов противовирусной активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) на модели герпесвирусной инфекции in vitro.
Для достижения указанной цели были поставленны следующие задачи: 1)Разработать экспериментальную модель оценки противогерпетического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф).
2)Оценить протективное действие Суперлимфа на неинфицированные клетки Vero.
3)Исследовать морфологические и молекулярно-биологические механизмы противовирусной активности препарата Суперлимф в экспериментальной системе клетки Vero - вирус герпеса простого (ВГП). 4)Изучить прямое действие препарата Суперлимф на вирионы ВГП-1. 5)Исследовать действие препарата на выработку цитокинов ФНОос и ИЛ-12 (факторов врожденного иммунитета) в культуре стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови больных генитальным герпесом и здоровых доноров.
Научная новизна:
Изучены механизмы противовирусного действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) на модели герпесвирусной инфекции.
Установлено, что Суперлимф повышает устойчивость клеток Vero к заражению вирусом герпеса простого 1 и 2 типов. Протективное действие препарата прямо пропорционально его концентрации в культуре и времени взаимодействия с клетками Vero.
Впервые показано, что Суперлимф подавляет цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 в культуре клеток Vero, а противовирусная активность препарата обусловлена низкомолекулярной фракцией (1,0 - 4,0 kD), содержащей катионные противомикробные пептиды - протегрины.
Установлено, что опосредованное через клетку Vero противовирусное действие Суперлимфа связано с нарушением синтеза вирусной ДНК. Также препарат блокирует дальнейшее распространение инфекции с помощью увеличения экспрессии вирусной тимидинкиназы, за счет чего происходит нарушение проникновения вновь продуцируемых вирионов ВГП в клетку-мишень.
Впервые продемонстрировано прямое противогерпетическое действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (Суперлимф), которое проявлялось в образовании вирионов, лишенных оболочки.
Препарат Суперлимф регулирует выработку ФНОа и ИЛ-12 в культуре мононуклеарных клеток больных генитальным герпесом и здоровых доноров.
Полученные результаты расширяют представления о новых механизмах противовирусного врожденного иммунитета, в частности, об участии противомикробных пептидов в прямом действии на вирионы герпеса простого. Это может служить основой для дальнейших медико-биологических исследований в области изучения механизмов противовирусного действия препарата Суперлимф.
Практическая значимость
Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить действие противовирусных препаратов 1) на неинфицированные клетки-мишени, 2) на репродукция вируса в клетке, 3) на вирус непосредственно.
Полученные данные о противовирусных эффектах препарата Суперлимф открывают новые возможности его использования в профилактике и комплексном лечении герпетической инфекции. Включение препарата в лечение герпетической инфекции позволило сократить продолжительность и частоту рецидивов у больных генитальным герпесом.
Внедрение результатов работы в клиническую практику
Результаты работы внедрены в схемы лечения больных генитальным
герпесом на базах Курского государственного медицинского университета и
Орловской областной клинической больницы.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, отражающих ее основное содержание.
Структура и объем диссертации
Репродукция вируса герпеса простого в клетке
Цикл репродукции ВГП хорошо изучен и имеет отчетливо выраженные стадии:
Первая стадия, включающая в себя проникновение вируса в клетку (92, 155), осуществляется в три этапа (Рис. 2):
1 этап. Непосредственный контакт вируса с клеткой - связывание гликопротеида gC (gB) вирусной оболочки с гепаран-сульфатом мембраны клетки - мишени.
2 этап. Взаимодействие gD оболочки вируса с одним из клеточных рецепторов HVEM (медиатор внедрения вируса герпеса). К HVEM относятся OHOccR (HveA), полиовирусные рецепторы (HveB и HveC) и герпесвирусный иммуноглобулиноподобный рецептор (HigR).
3 этап. Слияние оболочки вируса и мембраны клетки. Предполагается, что в этом процессе принимают участие вирусные гликопротеиды gB, gD и гетеродимер gH-gL. Взаимодействие gD с корецептором ведет к реаранжировке белков на поверхности оболочки вируса. gB и гетеродимер gH-gL образуют перемычку между клеточной мембраной и вирионной оболочкой. В образовавшуюся пору в клетку проникают капсид с белками тегумента (107, 156).
В результате слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны в цитоплазму высвобождаются белки тегумента. Один из них, vhs, подавляет трансляцию клеточных белков, другой, aIF, проникает в ядро и инициирует транскрипцию а-генов ВГП. После проникновения в клетку капсид вместе с белками тегумента попадает в цитоплазму, где перемещается по микротрубочкам. Агенты (колхицин и нокодазол), деполяризующие микротрубочки, блокируют транспорт нуклеокапсидов к клеточному ядру. В настоящее время механизм движения капсида с белками тегумента изучен недостаточно. Установлено, что UL34 присоединяется к 1а цепи динеина нейрона. Однако, фактов участия данного белка в транспорте капсида к ядру пока, не найдено. Нуклеокапсид аккумулируется на ядерной мембране и соединяется с комплексом белков ядерной поры, через которую ДНК вируса проникает в ядро, оставляя в цитоплазме пустой капсид (79, 144). Механизм проникновения вирусной ДНК через ядерную пору до настоящего времени изучен не достаточно.
Вторая стадия включает в себя синтез вирусных белков и репликацию вирусной ДНК. Эти процессы протекают в ядре клетки-хозяина. В течение первых часов после заражения клеточных культур вирусом общая скорость синтеза белка необратимо снижается. Это соответствуют подавлению синтеза белков клетки и следующему за ним периоду синтеза вирусных белков (107, 137).
Транскрипция вирусных генов происходит в упорядоченном каскаде а, Р, yl и у2 генов. Через 2-4 часа после инфицирования, синтезируются первые вирусные белки, кодируемые а-генами. В их состав входят: ICPO, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, а также Us 1.5. Функцией VP16 является активация транскрипции а-генов. Белковые продукты трансляции а-генов ВГП-1 проникают обратно.в ядро и индуцируют экспрессию белков Р-генов. На этой стадии происходит деградация хроматина и его распределение вдоль внутренней поверхности ядерной мембраны (79).
ICPO (infection cell protein) инициирует экспрессию вирусных белков, инактивирует клеточные белки, но не оказывает влияния на репликацию вируса (74, 107, 163, 174). Данный белок связывается и дезорганизует ND10 (nuclear domain 10), который ассоциирован с протеосомальной деградацией белков (107), что может привести к нарушению презентации вирусного антигена. Помимо прочего ICPO способствует деградации центромерного белка С и связывается с циклином D3 (84, 151), что приводит к блокировке перехода метафазы в анафазу. Вирус блокирует апоптоз в клетке-мишени путём связывания ICPO с белком р53 (58). Также, с помощью белка ICPO вирус ингибирует IRF3 и IRF7 (IFN - regulatory factor), тем самым, снижая экспрессию интерферон-стимулированных генов (118, 136).
Синтез белков, кодируемых Р-генами, начинается через 4-8 ч после заражения клеток. Экспрессия (3-генов инициируется а-белками. Среди Р-белков находятся белки, отвечающие за репликацию вирусной ДНК, за метаболизм нуклеотидов и за экспрессию у-генов. Р-гены делятся на два класса: Р1 и Р2. pi-гены экспрессируются сразу же после а-генов. Они представлены UL29 (кодирует ICP8) (51), UL39 (кодирует ICP6) и другими генами. р2-гены, в частности, U[23 (кодирующий вирусную тимидинкиназу) экспрессируются в более отдаленный по сравнению с сс-генами период (107).
Вирусная тимидинкиназа участвует в метаболизме нуклеозидов, негативно регулирует экспрессию Ui24 и gH-гликопротеина вирусной оболочки, участвующего в проникновении вируса в клетку (67, 70, 147, 166). Этот факт связан с тем, что ТК находятся смысловые участки генов UL22 и UL24 (39).
Позже всех экспрессируются у-гены, которые в свою очередь делятся на две группы у і-гены, кодирующие ICP5, gB, gD и у2-гены, кодирующие gC и некоторые другие белки (107).
После экспрессии, некоторые из Р-белков образуют комплексы (репликативные компартменты), в которых происходит репликация вирусной ДНК (ЮЗ) (Рис. 3). В процессе репликации участвуют семь вирусных белков: вирусная ДНК-полимераза (UL30), процессивный фактор (UL42), белок, присоединяющийся к точке ori (UL9) (83), БвДЕК-связывающий белок (UL29) и геликазо-праймазный комплекс, состоящий из трех белков - UL5, UL8 и UL52 (56, 72). Участие клеточных факторов в репликации вирусной ДНК минимально (107, 162).
Суперлимф - иммуномодулирующий препарат с антимикробным и противовирусным действием
В Российском Государственном Медицинском Университете разработан оригинальный иммуномодулятор Суперлимф (ФСП 42-0185-0573-00), который представляет собой стандартизованный комплекс природных цитокинов (КПЦ) и протегриноподобных противомикробных пептидов, выделенный из культур лейкоцитов периферической крови свиньи. В препарате определены активности интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6) фактора некроза опухоли а (ФНОа), фактора, миграцию ингибирующего фактора (МИФ), трансформирующего фактора роста Р (ТФРР). В комплексе не обнаружена активность интерферонов (19).
Суперлимф обладает достаточно широким спектром иммуномодулирующего действия на клетки, участвующие во врожденном-иммунном ответе, воспалении и процессах репарации. Препарат стимулирует фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, выработку ими активных форм кислорода и оксида азота.
Молекулярный механизм действия препарата Суперлимф заключается в активации двух ферментов фагоцитов НАДФН-оксидазы и индуцибильной N0-синтазы, результатом чего является совместная генерация АФК и NO, определяющих факторов противомикробной и противовирусной защиты (18, 60).
Продукция NO ведет, во-первых, к прямому разрушению вирус-инфицированных клеток, во-вторых к увеличению секреции ИЛ-12, который способен многократно увеличивать активность ЕК и индуцировать ими секрецию ИФН-у. Помимо этого, ИЛ-12 стимулирует дифференцировку наивных CD4+ лимфоцитов в ТЫ, продуцирующих ИФН-у, и наивных CD8+ в функционально активные цитотоксические Т-лимфоциты (17, 53).
Показано также, что Суперлимф стимулирует выработку цитокинов макрофагами, регулирует их миграцию, активирует противоопухолевую цитотоксичность и способствует гибели внутриклеточных паразитов. В то же время, препарат регулирует функциональную активность фибробластов, синтез ими коллагена и гликозаминогликанов.
Под воздействием препарата осуществляется приток мононуклеарных фагоцитов в патологический очаг, в связи с чем, воспалительная реакция приобретает локальный и менее выраженный характер. Усиление функциональной активности макрофагов способствует более быстрой резорбции продуктов распада и активации репаративных процессов с полным восстановлением дефекта без образования рубцов (18).
Действие препарата было изучено в экспериментальных моделях in vivo (на кроликах - модель инфицированных ран, проникающих ранений роговицы, щелочного ожога роговицы и на мышах - модель внутриклеточных инфекций), а также in vitro (на бактериальных культурах - E.coli, St. aureus, на модели эндотелиальных клеток пупочной вены, зараженных ВГП-1) (18, 20, 46).
Препарат Суперлимф с успехом применяется в комплексном лечении:
- экзогенных поражений тканей (осложненные раны, термические ожоги, различные повреждения роговицы, проникающие травмы, ожоги, кератиты и др-);
- воспалительно-деструктивных заболеваний слизистых ЛОР-органов (синуситы, отиты, фарингиты, риниты различной этиологии) (18), слизистой пародонта, слизистой мочеполовых органов и др.
- профилактике избыточного рубцевания при антиглаукоматозных операциях и в пластической хирургии,
- заболеваний вирусного и бактериального генеза (16, 19, 20, 36).
Высокая клиническая эффективность препарата Суперлимф заключается в быстром исчезновении воспаления, ранней эпителизации, формировании нежной рубцовой ткани, анальгезирующем эффекте, отсутствии аллергических реакций у больного, ограничении применения антибиотиков и гормональных препаратов, продлении ремиссии при хронических процессах. Препарат предназначен для местного применения. Локальное применение Суперлимфа позволяет обеспечить точную доставку цитокинов в патологический очаг и пролонгировать действие за счет включения каскада цитокиновой продукции в месте введения (17).
Дальнейшая характеристика препарата с помощью проведения гель-фильтрации и масс-спектрометрии позволили выделить и охарактеризовать низкомолекулярную противомикробную протегрин-содержащую фракцию пептидов, которая вызывала прямое бактерицидное действие на Staphylococcus aureus (21).
В культуре клеток эндотелия пупочной вены человека, инфицированной вирусом герпеса простого 1 типа, показано противовирусное действие препарата Суперлимф (46). Продемонстрирована высокая эффективность Суперлимфа в комплексном лечении различных видов герпетической инфекции, включая генитальный герпес, офтальмогерпес и др. (36).
Проведены клинические испытания препарата Суперлимф в лечении генитального герпеса. Препарат эффективно влияет на симптомы обострения герпетической инфекции, приводя к достоверному снижению выраженности боли, зуда, жжения и сокращению средней продолжительности обострения на 2-3 дня в сравнении с «плацебо». При повторном курсе препарат уменьшает продолжительность рецидива до 3-х дней. У 86% пациентов рецидивы не определялись в течение 8-12 месяцев. Проведение комплексной терапии пациенток с генитальной формой хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекцией приводило к нормализации уровня цитокинов в сыворотке крови и слизи цервикального канала (16).
Таким образом, препарат Суперлимф проявил свою высокую эффективность при различных формах инфекционных заболеваний, включая герпетическую инфекцию. Однако механизм угнетения репродукции вируса герпеса под воздействием препарата Суперлимф до настоящего времени был практически не известен.
Влияние препарата Суперлимф на цитопатическое действие вируса герпеса простого в культуре клеток Vero
После изучения влияния Суперлимфа на интактные клетки Vero, были проведены исследования действия препарата на ЦПД вируса герпеса в зараженной культуре клеток. Цитопатический эффект вируса проявлялся в виде образования в культуре характерных многоядерных клеток - симпластов, представляющих собой единую, не имеющую клеточных границ и включающую различное количество ядер, массу цитоплазмы (Рис 13а). Механизм образования симпластов сочетает в себе два процесса - процесс слияния инфицированных клеток и амитоз (6).
В используемой для заражения клеток вируссодержащей жидкости были определены титры ВГП-1 и ВГП-2. Титр ВГП-1 составлял 7,5 ТЦД5о/0,1мл, титр ВГП-2 - 6,7 lgTUZMUwi.
При определении концентраций препарата Суперлимф, вызывающих противовирусный эффект, клетки заражали вирусом в 10-кратных разведениях исходного вируссодержащего материала. Множественность заражения составляла от 1 до 0,00000001 ТЦД5о/кл. Сразу после инфицирования клеток ВГП-1 или ВГП-2, в культуру вносили препарат в концентрациях 1; 5; 10; 25; 50; 100; 150; 200 и 250 мкг/мл. Титры вируса определяли по методу Рида и Менча на 6-е сутки после заражения (24).
В результате было показано, что низкие концентрации препарата - от 1 до 25 мкг/мл, практически не влияют на ЦПД ВГП-1 и ВГП-2. Препарат в концентрации 50 мкг/мл снижает титр ВГП-1 в среднем на 1,0 ТЦД50/0,1мл, а ВГП-2 - на 0,8 ТЦД5о/0,1мл. Максимальный эффект подавления ЦПД вирусов препаратом был установлен в диапазоне доз от 100 до 250 мкг/мл. При этом титры ВГП-1 и ВГП-2 снижались в среднем на 1,5 ТЦД5о/0,1мл. (Рис 14 и 15). Таким образом, нами было установлено, что препарат Суперлимф оказывает выраженное противогерпетическое действие в культуре клеток Vero зараженных вирусом герпеса простого. Степень противовирусной активности препарата, при этом, прямо пропорциональна его концентрации в культуре клеток.
- значение достоверно отличается от контроля (р 0,05), На рисунке 16 представлены совмещённые данные по цитотоксическому и противовирусному действию различных концентраций Суперлимфа через 72 ч после заражения клеток вирусом герпеса. Заражающая доза ВГП-1 составляла 0,01 ТЦД50/кл.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что препарат Суперлимф в дозах 50 - 100 мкг/мл не оказывает достоверного по сравнению с контролем цитотоксического действия, но при этом эффективно подавляет ЦПД вируса в культуре. Таким образом, указанный диапазон доз препарата является оптимальным для проводимых исследований, а предложенная модель оценки его противовирусного действия, по-видимому, может быть эффективно использована в качестве базовой для испытания потенциальных средств терапии вирусных заболеваний.
Эффективность подавления ЦПД вируса в зависимости от используемой схемы эксперимента.
Для оценки цитопатического действия вируса нами были разработаны 3 схемы эксперимента (Рис 17).
Схема 1 - предварительная обработка клеток Vero препаратом с последующим их инфицированием вирусом герпеса простого.
а) в культуру клеток Vero вносили препарат Суперлимф в конечной концентрации 100 мкг/мл;
б) через 1, 3 и 24 ч клетки отмывали от препарата и заражали различными дозами вируса (ОД-0,000001 ТЦД50/кл);
в) через 1 ч после заражения не связавшийся с клетками вирус отмывали.
Схема 2 - предварительное заражение клеток Vero вирусом герпеса с последующим добавлением в культуру препарата.
а) клетки Vero заражали вирусом в дозах от 0,1 до 0,000001 ТЦД5о/кл;
б) через 1 ч после заражения не связавшийся с клетками вирус отмывали;
в) в культуру вносили препарат Суперлимф в конечной концентрации 100 мкг/мл;
Схема 3 - обработка вируса герпеса препаратом с последующим заражением этим вирусом клеток Vero.
а) вирус инкубировали с препаратом Суперлимф (100 мкг/мл) в течение 2-х ч;
б) клетки Vero заражали обработанным, таким образом, вирусом;
г) через 1 ч после заражения не связавшийся с клетками вирус отмывали.
Были использованы следующие контроли: -клетки Vero + среда культивирования;
-клетки Vero + препарат Супер лимф в конечной концентрации 100 мкг/мл;
- клетки Vero + ВГП в дозах 0,1-0,000001 ТЦД50/кл.
Титр вируса в экспериментах определяли на 6-е сутки культивирования.
Установлено, что титр ВГП-1 в опытных культурах клеток были существенно ниже, чем в контроле. Как видно из рисунка, предварительная обработка клеток препаратом в течение 1-3-х ч снижала титр вируса как минимум на 1,0 IgTUZbo- Максимальный противогерпетический эффект был достигнут после предварительной инкубации клеток с препаратом в течение 24 71 х часов. В этом случае разница в титрах вируса в опыте и контроле составила 1,81ёТЦД50/0,1мл.
Титр ВГП-2 в опыте и контроле отличался в среднем на 0,77 ТЦД50/0,1мл (при инкубации клеток с препаратом в течение 1-3 ч) и на 1,5 ТЦД5о/0,1мл (при инкубации в течение 24 ч). Кроме того, следует отметить, что цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 в опыте проявлялось на 24 - 36 ч позже, чем в контроле, т.е. наблюдали отсроченный эффект ЦПД вируса.
Следовательно, можно сделать вывод, что предварительная (до заражения вирусом) обработка клеток препаратом Суперлимф существенно повышает их устойчивость к последующему заражению ВГП. Как выяснилось, степень противовирусной активности препарата зависит от его концентрации в культуральной среде, а также от времени предварительного контакта с клетками. Чем дольше экспозиция клеток с препаратом, тем большей устойчивостью к последующему заражению вирусом они обладают. Таким образом, увеличение противовирусной резистентности эпителиальных клеток слизистых с помощью препарата Суперлимф может предотвращать и (или) ограничивать распространение вирусного агента в организме. Результаты, полученные in vitro, подтверждаются клиническими испытаниями, показавшими высокую эффективность Суперлимфа в комплексном лечении и профилактике генитального герпеса (16, 36).
Еще одним важным аспектом действия препарата Суперлимф является его влияние на синтез вирусного «потомства» инфицированными клетками Vero. Клетки, до их заражения вирусом (согласно схеме 1), инкубировали с препаратом в течение 3-х и 24-х ч. Через 72 ч после инфицирования определяли титр вируса в культуральной среде (таблица 3).
3-х часовая инкубация клеток с препаратом приводила к уменьшению титра вирусного потомства в среднем на 0,8 — 1,0 ТЦД5о, в то время как 24-х часовое взаимодействие уменьшало титр вирусного потомства на 2,0 ТЦД5о/0,1мл, т.е. в 100 раз.
Изучение влияния препарата Суперлимф на выработку ИЛ-12 и ФНОа мононуклеарными клетками периферической крови больных генитальным герпесом
Синтез цитокинов рассматривается как важная функция клеток иммунной системы, участвующих в противовирусной защите. При герпетической инфекции наиболее полно изучены функции системы интерферонов. Для рецидивирующей формы генитального герпеса характерно подавление процессов интерфероногенеза, что выражается в снижении показателей синтеза лимфоцитами ИНФу и резком уменьшении способности лейкоцитов продуцировать интерфероны I типа (45, 134).
В настоящем разделе работы проведено исследование действия Суперлимфа, а также антигенов ВГП-2 на продукцию ФНОа и ИЛ-12 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных генитальным герпесом.
Выбор данных цитокинов был не случаен. ФНОа, ИФНа и ИФН(3, начинают вырабатываться уже в первые часы вирусной инфекции, обеспечивают реализацию врожденных механизмов противовирусной защиты, оказывают прямое вируснейтрализующее действие, которое усиливается ИФНу (77). ИЛ-12, напротив, вырабатывается позже, при развитии вирус-специфического иммунного ответа, преимущественно при рецидивирующей форме заболевания. ИЛ-12 индуцирует выработку ИФНу ЕК и вирусспецифическими ЦТЛ, также играет ключевую роль в дифференцировке ThO в ТЫ - лимфоциты (91).
На первом этапе исследований были отработаны условия оценки продукции цитокинов мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови больных и доноров, подобраны условия культивирования и стимуляции клеток, а также концентрации стимулирующих агентов (ЛПС, антигена ВГП-2 и Суперлимфа).
МНК выделяли с помощью центрифугирования клеток в градиенте плотности фиколл-пака. Концентрацию клеток доводили до 1x10б кл/мл и культивировали в 1 мл полной культуральной среды в течение 48-ми час, после чего отбирали надосадочную жидкость для определения концентрации ИЛ-12 и ФНОа методом ИФА.
Определяли спонтанную и индуцированную секрецию ИЛ-12 и ФНОа у больных генитальным герпесом в стадии ремиссии (п=7) и обострения (п=5). В качестве контроля использовали МНК здоровых доноров (п=10). Стимулирующими агентами служили бактериальный липополисахарид (ЛПС), антигены ВГП-2 и препарат Суперлимф.
МНК доноров и больных генитальным герпесом продуцировали низкий (фоновый) уровень ФНОа (20,0±10,0 пкг/мл). После 48-ми час стимуляции ЛПС выработка ФНОа мононуклеарами здоровых доноров и больных герпесом значительно возрастала (Рис. 34). Стимуляция МНК больных герпетической инфекцией в стадии ремиссии антигенами ВГП-2 приводила к увеличению выработки ФНОа (467,0±63 пкг/мл). В работе Mogensen I et al. показал, что gD ВГП-2, взаимодействуя с HVEM (ФНО рецептор) клетки-мишени, активирует передачу сигналов, ведущих к экспрессии таких провоспалительных цитокинов, как ФНОа, ИЛ-6 и хемокина ИЛ-8 (134, 141). При рецидивирующей вирусной инфекции в стадии обострения, способность МНК продуцировать ФНОа не отличаласьот спонтанной. (Рис. 34).
Стимуляция мононуклеаров Суперлимфом в дозе 10 мкг/мл, увеличивала продукцию ФНОа у больных в стадиях ремиссии и обострения соответственно, в 5 и 3 раза по сравнению с контролем (Рис. 34). ФНОа, наряду с ИФНу, способен оказывать прямое токсическое действие на ВГП и включать механизмы противовирусного врожденного иммунитета. Стимуляция МНК антигеном ВГП- 2 и Суперлимфом вызывала продукцию ФНОа в меньшей степени, чем ВГП и Суперлимф в отдельности.
Необходимо отметить, что МНК здоровых доноров спонтанно продуцировали высокий (194±44 пкг/мл), уровень ИЛ-12 по сравнению с ФНОа (Рис. 35а и 356). При этом в сыворотке крови определялись довольно низкие (физиологические) концентрации ИЛ-12.
Герпетическая инфекция приводит к резкому (в 5-6 раз) увеличению в сыворотке крови концентрации ИЛ-12. Одновременно с этим возрастает продукция ИЛ-12 (427±108 пкг/мл) в культуре МНК больных герпесом. Статистически значимых различий в концентрации ИЛ-12 у больных генитальным герпесом в стадии обострения и ремиссии не выявлено. Известно, что выработка ИЛ-12 увеличивалась при рецидивирующих формах генитального герпеса. При взаимодействии CpG-последовательностей ВГТТ-2 с TLR-9 клеток-мишеней или gD наблюдалось развитие вирус специфического иммунитета (71, 105, 134).
Антигены ВГП-2 в культуре МНК как здоровых доноров, так и больных генитальным герпесом подавляли выработку ИЛ-12. Уровень ИЛ-12 при действии Суперлимфа снижался в группе больных герпетической инфекцией как при рецидиве болезни, так и в стадии ремиссии (Рис. 36).
Таким образом, анализируя данные по влиянию Суперлимфа на выработку цитокйнов в культуре МНК здоровых доноров и больных генитальным герпесом можно сделать вывод, что препарат обладает иммуномодулирующим эффектом - увеличивает сниженную у больных продукцию ФНОа и снижает высокую продукцию ИЛ-12.
Стимуляция МНК Суперлимфом в комбинации с антигеном ВГП-2 снижала выработку ФНОа и практически не изменяла уровень секреции мононуклеарами ИЛ-12.
С учетом полученных результатов были разработаны схемы лечения герпетической инфекции, включающие наряду с применением химиотерапевтических средств (ацикловир, валтрекс и др.), блокирующих репликацию вируса (165), использование Суперлимфа в стадиях обострения и ремиссии заболевания с целью активации врожденных механизмов противовирусной защиты (18). Ранее было показано, что Суперлимф, наряду с регуляцией синтеза цитокинов в культуре МНК, стимулирует выработку активных форм кислорода, а также оксида азота - мощного вируснейтрализуюшего агента (19, 21). Учитывая высокую степень протективной активности препарата по отношению к клеткам-мишеням и индуцируемые им прямые и клеточно-опосредованные противовирусные эффекты, представляется весьма актуальным применение Суперлимфа для профилактики и комплексного лечения герпетической инфекции.
