Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1. Закономерности фотоокисления бенз(а)пирена 8
2. Тушение возбужденных состояний полиаренов кислородом 11
3. Пути образования синглетного кислорода и его роль в фотоокислении полиаренов 13
4. Тушение возбужденных состояний полиаренов акцепторами электрона . 20
5. Строение и проницаемость кожи для органических соединений 25
6. Проникновение и метаболизм бенз(а)пирена в коже мышей 30
2. Методика эксперимента 34
1. Фотоокисление при поли- и монохроматическом облучении 34
2. Фотосенсибилизированное окисление полиаренов 39
3. Измерение флуоресценции в коже мышей 41
4. Канцерогенное воздействие 43
5. Статистическая обработка результатов 45
3. Закономерности окисления полиаренов в фотохими ческих системах 53
1. Окисление бенз(а)пирена и фенолов при полихроматическом облучении 53
2. Взаимодействие с синглетным кислородом и гидроксильным радикалом при фотосенсибилизированном окислении полиаренов 61
3, Реакционная способность полиаренов в процессе фотоокисления. Расчетно-теоретическое обоснование схемы процесса 71
4. Влияние фенолов и хинонов на процесс биодеградации бензшпирена 87
1. Разработка кинетической модели проникновения и превращения бенз(а)пирена в коже 88
2. Влияние фенолов и хинонов на проникновение и превращение бенз(а)пирена в коже мышей 97
3. Влияние пирокатехина и п~бензохинона на канцерогенное воздействие бенз(а)пирена 101
Выводы 106
- Тушение возбужденных состояний полиаренов кислородом
- Фотосенсибилизированное окисление полиаренов
- Взаимодействие с синглетным кислородом и гидроксильным радикалом при фотосенсибилизированном окислении полиаренов
- Влияние фенолов и хинонов на проникновение и превращение бенз(а)пирена в коже мышей
Введение к работе
Существенную долю экзогенных загрязнений среды продуктами и отходами многосторонней деятельности человека составляют вещества ароматической природы, зачастую обладающие выраженной и разнохарактерной биологической активностью. К ним относятся, в первую очередь, полициклические арены (ПА), в ряде случаев -сильные канцерогены, сопутствующие им токсичные фенолы.
Превращения этих веществ в биосфере, в различных её элементах, протекают главным образом, на основе активированного окисления - метаболического в биологических системах при взаимодействии с живыми организмами и инициированного воздействием в присутствии кислорода некоторых физико-химических агентов, в первую очередь ультрафиолетовой(у$) составляющей солнечного излучения - в неживой природе. Поэтому важной задачей в решении актуальной проблемы защиты человека и окружающей его среды от действия канцерогенных загрязнений является установление закономерностей, управляющих указанными процессами активированной деградации, не только раздельно для окисления некоторого изолированного канцерогенного ПА, но и во взаимодействии с тем или иным из сопутствующих ему ароматическим компонентом.
Ныне установлена способность физиологически высокоактивных фенолов воздействовать не только на канцерогенную активность ПА, но и участвовать в химических реакциях их окисления в качестве промоторов или ингибиторов. Указанные проявления в организации и эффективности окислительной деградации канцерогенного полиарена не следует все же приписывать лишь исключительно самому исходному сопутствующему фенолу: в смеси реагирующих или метаболи-зируемых веществ присутствуют и должны оказывать влияние на окисление полиарена также промежуточные продукты окисления фенола - - некоторые многоатомные фенолы, хиноны, продукты конденсации, непредельные спирты или кислоты. Многие из них сравнительно малоустойчивы и легко разрушаются в ходе дальнейшего окисления в химических и биологических системах. Соответственно, непосредственное их обнаружение в реакционных смесях, однозначная оценка их роли относительно изучаемого ПА и достоверная интерпретация конечных результатов оказываются затруднительными и, в некоторых обстоятельсвах, недостаточно убедительными.
Поэтому существенный раздел в изучении механизмов химического канцерогенеза и в исследовании реакций инициированного окисления ПА во внешней среде ( в частности- в водной среде), оказывается разработанным к настоящему времени ещё недостаточно. Сложность в решении проблемы усугубляется наличием ряда пробелов в существующих представлениях о природе фотоокислительной деградации пери-конденсированных углеводородов, к числу которых относится ряд известных канцерогенов, о детальном механизме взаимодействия ПА с синглетным кислородом и другими активными окислительными агентами, о зависимости эффективности фотоиницированно-го процесса от энергетических и молекулярно-структурных характеристик реагирующих веществ.
Сказанное определяет основную цель настоящей работы - исследование некоторых до сих пор мало изученных или недостаточно оцененных эффектов при взаимодействии, главным образом в водной среде, с некоторым модельным канцерогенным полиареном при его окислительной деградации с некоторыми из промежуточных продуктов окисления сопутствующего фенола в биологической и физико-химических системах.
Выбор конкретных объектов изучения продиктован актуальностью такой работы для характерных условий Прибалтийского региона в целом и Эстонской ССР, в частности, обладающих интенсивными хими- м Q «м ческой и топливно-химической отраслями промышленности, высокоразвитыми транспортом и теплоэнергетикой.При этом основные разделы исследования, для конкретизации подлежащих решению задач и известного целесобразного их упрощения, проводятся с широко известным бенз(а)пиреном СБП), который единогласно признан в настоящее время биологами и химиками индикаторным или эталонным представителем поликонденсированных ароматических канцерогенов.
Соответственно изложенной общей цели можно наметить в качестве основных нижеследующие задачи, решению которых посвящены конкретные разделы диссертации.
Изучение кинетических закономерностей фотоинициированного соокисления фенолов, промежуточных продуктов их окисления и БП; получение уточненных кинетических характеристик фотосенисибили-зированного окисления БП и других модельных полиаренов разной структуры; попытка уточнения представлений о механизме этих процессов, в частности, при взаимодействии БП и других ПА с син-глетно-возбужденным кислородом и свободным радикалом гидроксила; установление достаточно четкой зависимости эффективности фотоинициированного окисления ПА от их энергетических и молекулярно--структурных характеристик, посвященных посильному вкладу данных и восполнению пробелов в накопленном к настоящему времени материале по фотоокислительной деградации ПА и фенолов, имитирующей процессы их деградации во внешней среде.
Изучение закономерностей воздействия фенолов, продуктов их окисления, на окисление БП в биологической системе in rLVO ( именно такие системы дают непосредственный ответ на подлежащие выяснению вопросы в отличие от более простых, но не охватывающих всю глубину процессов в организме систем in vitro )» в качестве которой избрана нами кожа подопытных живорных (безволосые мыши).
При решении указанных задач в работе получен ряд новых результатов. Установлен и получил объяснение специфический эффект взаимного влияния фенолов, хинона и БП при фотоиницииро-ванном окислении.
Определены константы скоростей взаимодействия некоторых модельных ПА с гидроксильным радикалом и с синглетно-возбувденным кислородом.
Впервые установлена корреляционная связь эффективности фотоокисления ПА и величины электронодонорной способности молекул ПА в триплетно-возбужденном состоянии и предложена схема начальных стадий фотоокисления полиаренов.
Впервые предложена и проверена на экспериментальных данных кинетическая модель проникновения и метаболизма БП в коже живых мышей, с помощью которой изучено влияние фенолов, хинонов и муко-новой кислоты на процессы диффузии и метаболического окисления БП в коже живых мышей. ~ 8 -
Тушение возбужденных состояний полиаренов кислородом
При поглощении кванта света молекула, в том числе и полиарена, переходит в соответствующее возбужденное синглетное состояние, которое может дезактивироваться либо вседствие из-лучательной или безызлучательной внутренней конверсии в основное синглетное состояние или же с переходом, путём интеркомбинационной конверсии в относительно долгоживущеее триплетное возбужденное состояние. Поведение полиаренов в возбужденно-синглетиом и триплетном состояниях определяют и их фотохимические реакции и зачастую определяется бимолекулярными процессами переноса энергии или заряда к так называемым тушителям» Особая роль в процессах фотоокисления полициклических аренов принадлежит кислороду, который в обычных условиях присутствует в растворе и молекулы которого в основном триплетном состоянии эффективно тушат возбуждённые состояния полиаренов - как синглетное, так и триплетное. Тушение синглетно-возбужденного состояния кислородом обусловлено процессом стимулированной интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние без образования возбуждённых состояний кислорода / ІЗ/, в соответствии с уравнением : Ід + 302 \ + 302 , (I.I) т я где А и А - молекулы полиаренов в возбужденно-синглетном о и триплетном состояниях, соответственно; 02 - молекула кислорода в основном триплетном состоянии. Всё же для полиаренов с энергией расщепления первого синглетно-возбужденного и триплетного состояний более 0,98 эВ в процессе по уравнению СІ.І) обнаружено образование кислорода в возбужденных состояниях / 14/. Тушение триплетних состояний молекул аренов кислородом определяется, главным образом, процессом переноса энергии с некоторым вкладом механизма переноса заряда / 15/. При этом отметим, что константа скорости тушения триплетного состояния арена кислородом приблизительно на порядок величин меньше константы скорости тушения флуоресцентного (т.е. синглетно-возбужденно-го) состояния, например в II раз для бенз(а)пирена / 16/. Это связано со статистическим спиновым фактором, поскольку вероятность образования результирующего синглетного состояния при взаимодействии двух триплетов равна 1/9, результирующего трип-летного - 1/3, а результирующего квинтетного - 5/9 / 15/: 3А + 302 z :I(3A...302)—Л0 + \ ( Д или 2р (1.2) 3А + 302 = 3(3А...302)— \ + \ (1.3) h + 302 5(3А...302). (1.4) Тушение триплетних молекул идет только через синглетный или триплетний комплекс ( уравнения (1.2) и (1.3)). Следовательно, только 4/9 всех столкновений кислорода с возбужденной молекулой в триплетном состоянии может вести к тушению. При тушении же синглетно-возбуждённых состояний кислородом статистический фактор равен 1,0 и константа скорости тушения близка к ограничиваемой диффузией / 15/.
При тушении кислородом по механизму переноса энергии ( уравнение 1.2) образуется синглетно-возбужденный кислород в состояниях А или , а при тушении по механизму переноса заряда ( уравнение (1.3)) возбужденных состояний кислорода не образуется. Считается / 15/, что интеркомбинационная конверсия из синглетного в триплетное состояние комплекса столкновения происходит медленнее, чем диссоциация комплекса на продукты. Экспериментально найдено / 15/, что в неполярных средах кислород тушит триплеты аренов, для которых энергия триплетного состояния меньше чем 1,9 эВ, с константой скорости равной 1/9 к и ; тогда как для молекул с энергией триплетного состояния, превышающей 1,9 эВ, константа тушения меньше 1/9 кДИф, где к. - константа скорости диффузионно-контролируемого процесса. Наряду с этим обнаружено повышение вероятности тушения триплетов аренов с увеличением полярности среды, что объясняется увеличением вклада в процесс тушения взаимодействия с переносом заряда. 3. Пути образования синглетного кислорода и его роль в фотоокислении полиаренов. Образующийся в процессах тушения кислородом полиаренов в синглетно-возбуждённом и триплетном состояниях синглетно-воз-бужденный кислород играет, естественно, определяющую роль в фотоокислении (ФО) аренов. При этом необходимо отметить, что, согласно рсчетам / 17/, вклад синглетно-возбужденного кислорода, полученного в ходе тушения еинглетно-возбужденных состояний аренов остается небольшим и не превышает величины равной допустимой ошибке экспериментального определения выходу синглетного кислорода С Og), формирующегося при тушении триплетных состояний ПА кислородом. Таким образом, основным путём образования при ФО аренов является тушение кислородом их триплетно-воз-бужденных состояний. В табл. I. приведены значения квантовых выходов образования On при тушении кислородом триплетов полиаренов, из нее следует, что в неполярных средах квантовый выход приближается к единице, т. е. при тушении каждого триплета образуется молекула кислорода в возбужденно-синглетном состоянии, а в полярнцк - он меньше единицы. Это падение квантового выхода образования Ор тем больше, чем больше энергия триплетного состояния арена, что объясняется увеличением вклада механизма с переносом заряда в процесс тушения / 15,18/. Как уже отмечалось выше, в процессе тушения по механизму переноса энергии триплетних состояний аренов ( уравнение 1.2) образуется два еинглетно-возбужденных состояния кислорода Д«. и .2L , с энергетическими уровнями 22,5 и 37,5 ккал/моль, соответственно. Результаты квантовомеханических расчетов и экспериментальных измерений / 20/ указывают, что в случае ПА с высокой энергией триплетного состояния ( Ет 40 ккал/моль) в процессе переноса энергии образуется главным образом синглетный кислород 2 Количество же синглетного кислорода Ор ( - ), сформированного в этих условиях, оказывается в 10 раз меньшим. Полициклические арены, для которых энергия триплетного состояния находится в пределах 22 - 37 ккал/моль, генерируют только синглетный кислород Лу . В тех же случаях, когда она превышает 37 ккал/моль, генерируются обе формы синглетного кислорода. Свойства, указанных обоих форм синглетного кислорода, нес-колько различны. В состоянии x0g( 2Л ) неспаренные электроны молекулы находятся на разных орбйталях и пространственно разделены: полагают, что в этом состоянии молекула кислорода обладает свойствами бирадикала, как и молекула его в основном трип-летном состоянии. В молекуле синглетного кислорода Л а. занята одна и та же орбиталь и её строение можно представить двумя предельными структурами 0 = 0І -»0"" - 0+ , из чего следует, что в зависимости от типа реагента состояние Ло ведёт себя подобно олефину либо как диполярная электрофильная частица /20/,
Фотосенсибилизированное окисление полиаренов
Сенсибилизированное эозинонм натрия окисление полицикличес- ких аренов проводили в бензоле при облучении светом с длиной волны 526 нм, выделенного светофильтрами C3C-2I и IC-I7 из спектра излучения лампы ДРШ-1000, а сенсибилизированное метиленовым голубым - в четырёххлористом углероде, при облучении светом, выделенным I %-ым водным раствором бихромата калия из спектра излучения лампы ДКсі-IOQO. В обоих случаях использовалась гетерогенная система, в которой сенсибилизатор наносился на силикагель с размерами гранул 40/100 U ( 25 мг сенсибилизатора на I г носителя) Обработанные таким образом частицы ( 10 г/л раствора) суспендировались при магнитном перемешивании среды при температуре 20 + 1С и барботаже кислородом. Концентрация полиаренов определялась спектрофотометрически с учетом фона. Для определения реакционной способности аренов с гидроксиль-ным радикалом использовался метод конкурентного акцептора. Согласно которому измеряется отношение начальных скоростей реакции вещества и акцептора в совместной системе в зависимости от их относительной начальной концентрации, а из наклона полученной кривой, т.е. по соотношению констант скоростей реакции вещества и акцептора, вычисляется значение константы скорости для изучаемого вещества, благодаря известной величине аналогичной константы для реакции с акцептором. В роли специфичного акцептора гид-роксильных радикалов использован п-нитрозодиметиданилин (НДМА). Генерирование гидроксильных радикалов проводилось с помощью фотохимического разложения 0,02 М водного раствора перекиси водорода при облучении светом с длиной волны 254 нм ( выделен интерференционным светофильтром из излучения лампы ДРШ-1000). Водные растворы полициклических аренов приставлялись с учетом возможной их растворимости в воде /67/ ( антрацен - I мкМ, пи-рен - 0,5 мкМ и бенз(а)пирен - 0,4 нМ ), внесением 0,1 мл ацетонового раствора арена в дистиллированную воду и с последующей вакуумной отгонкой ацетона. Опыты проведены при 25 С и рН=9 ( 0,05 М раствор буры ). Оределение содержания бенз(а)пирена в водном растворе проводили после его экстракции из воды бензолом по измерению флуоресценции методом Шпольского в матрице н-октана при 77 К с 1,12 -бензпериленом в качестве внутреннего стандарта. Концентрация НДМА, пирена и антрацена определялась спектрофотометрически с учетом фона по поглощению при 435 нм, 335 нм и 377 нм, соответственно, На приборе SPECORD UV-VIS. Характеристика используемых в диссертации всех реактивов и объектов проведенного нами эксперимента дана в табл. 3. 3.
Измерение флуоресценции в коже мышей. Для измерения флуоресценции бенз(а)пирена в коже мышей применялась аппаратура, разработанная Л.А.Андриановым /99 /, состоящая из люминисцентного микроскопа МЛ-2, монохроматора УМ-2, фотоумножителя ФЭУ-17 и регистрирующего устройства (галь-вонометр М-95), представленного схемой на рис. 3. В качестве источника излучения в люминисцентном микроскопе использовали лампу ДКсШ-150 и применяли светофильтры Ж-З(З), СС-15(2) и $0-1(2), при которых максимум пропускания излучения находился при 365 нм. За флуоресценцией БП следили при 403 нм. Напряжение ФЭУ было минимальным С 600 В). В этой установке была усовершенствована оптическая система, увеличивающая площадь поверхности, с которой флуоресценция попадает в монохроматор. Опыты проводились на безволосых мышах обоегоупола в возра- сте 4-8 месяцев. Иногда, по мере необходимости, использова лись одни и те же мыши повторно ( но не больше трёх раз) с интервалами не менее восьми суток Животные содержались на обычном рационе при виварии Института экспериментальной и клинической медицины МЗ ЭССР. Мышь закреплялась за четыре конечности на плоской подставке. Раствор БП в ацетоне с добавкой одного из соединений наносился в объеме ОД мл на кожу мышей в межлопаточной области при помощи автоматической пипетки. Разовая доза БП на мышь составляла, в случае нанесения бинарных смесей, 20 нмолей, а доза второго компонента варьировала в пределах 10 - 400 нмолей. Измерение флуоресценции при каждом варианте доз проводили параллельно на 5 - 10 животных в девяти точках у каждой мыши и повторяли 2-4 раза. В опытах по изучению проникновения БП в кожу мёртвых мышей животные непосредственно перед нанесением раствора забивались методом вывиха шейных позвонков. Интенсивность падающего света на изучаемый объект регулировалось по интенсивности флуоресценции стандартного раствора БП в этаноле с концентрацией 0,2 мМ. 4. Канцерогенное воздействие. Этот раздел работы проведен с БП и с двумя наиболее характерными продуктами окисления оксибензола - пирокатехином и п--бензохиноном для выяснения их возможного влияния на канцерогенное воздействие БП при кожной аппликации при совместном и при последовательном нанесении. Опыты проведены на 160 мышах-самках линии С 57 чёрные в возрасте двух месяцев, в двух сериях : I) - совместная и 2) -- последовательная аппликация БП и пирокатехина или п-бензохи-нона. В первой серии обработку животных проводили дважды в неделю в течение четырёх месяцев (всего 34 раза) нанесением 25 мкл раствора БП в ацетоне микрошприцом раздельно или совместно с пирокатехином или п-бензохиноном на депилированную кожу в межлопаточной области подопытных животных. Во второй серии, при последовательном нанесении, животные обрабатывались дважды в неделю один раз раствором БП, а затем три месяца пирокатехином или бензохиноном. Таким образом, в обоих сериях обработка животных проводилась одинаковое время ( 4 месяца ), и суммарная доза нанесенного БП составила 0,8 мкмолей (202 мкг), а пирокатехина и п-бензохинона - 80 мкмолей на мышь. Животные находились под наблюдением в течение 18 месяцев от начала опытов. Павших в ходе опыта и забитых в терминальном состоянии или в конце срока наблюдения животных исследовали пато-логоанатомически. При вскрытии кусочки кожи, опухоли, их метастазы и другие патологически изменённые ткани и внутренние органы фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы тканей окрашивались рутинными методами окраски (гематоксилином и эозином по Ван Гизон) и изучали с помощью микроскопа в проходящем свете. Работа по этому разделу диссертации выполнена в Институте экспериментальной и клинической медицины МЗ ЭССР совместно с младшим научным сотрудником этого института Ю.Р.Тамме. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с помощью ЭВМ EC-I022 и настольного вычислительного устройства I5BCM-5. Определение параметров линейных уравнений проводили методом наименьших квадратов на основе стандартных программ. При этом вектор определяемых параметров независимых переменных вычислялся как - Ъ = ( Х ХГ Х-ї , где X - матрица значений независимых переменных, Хт - транспортированная матрица X, X - вектор значений зависимой переменной, Ъ - вектор параметров независимых переменных; а среднеквадратическая ошибка параметра ъ, - где скк- диогональный элемент матрицы (ХТХ) , s - среднеквадратичная ошибка аппроксимации -
Взаимодействие с синглетным кислородом и гидроксильным радикалом при фотосенсибилизированном окислении полиаренов
Как указывалось в литературном обзоре, не исключается возможность того, что за фотоинициированное окисление бенз(а)пире на ответственным является его взаимодействие с синглетно-воз-бужденным кислородом С 0«). Соответственно, в этой части работы предпринимается попытка количественно оценить скорость реакции БП с и вклад этой реакции в процесс фотоокисления бенз(а)пи-рена. Для получения 0г применен широко распространённый метод, основанный на использовании фотосенсибилизаторов - эозина натрия и метиленового голубого. Синглетный кислрод образуется при взаимодействии молекулярного кислорода в основном состоянии и молекулы сенсибилизатора (3СЕН), находящейся в триплетно-возб(уященном состоянии. Образующийся Og взаимодействует с присутствующим f 2 т і— продукты СЕН х0е полиареном или дезактивируется в растворе, согласно схеме 3, - --,. за (3.1) Из условий стационарной концентрации 0g с помощью схемы 3.1 получается следующая зависимость скорости окисления ПА ( v ) от его начальной концентрации ([ПА] ): l/v - I/vT С I + кл/( V [ж] )) , 2 In где кр и к- - константы скорости реакции полиарена с х0 и дезактивации Og в растворителе, соответственно; Vj „ скорость образования синглетного кислорода. Из этой зависимости следует, что Kr = K„/(taao; VI ), ( 3.2) 02 где taa (Л - наклон прямой в координатах Т/Ч - I/ ПА , VIQ - величина отрезка отсекаемой на оси ординат. Экспериментальные данные по этому разделу получены с помощью методики 2 главы II и представлены в табл. 8 и рисунках 9-15, которые опубликованы в наших работах / 79,80/. В качестве модельного соединения нами был выбран 7,12-ди-метидбензСа)антрацен (ДМБА), для которого константа скорости реакции с 0р составляет 1,4 10 !Г с в бензоле / 24/, а константа скорости дезактивации в этом растворителе -- к в 4000 с / 21/. Из зависимости "обратная начальная скорость окисления - обратная начальная концентрация полиарена" в случае использования эозина натрия в качестве сенсибилизатора константа скорости взаимодействия ДМБА с 0% ( Рис# К» Щ е- 7 Т Т делена в 0,8 10 УГх с хі это величина удовлетворительно совпадает с приведенными выше данными из литературы. Для БП и дибензСа,h )пирена (ДБП) при использовании в качестве сенсибилизатора того же эозина натрия при обработке данных в аналогичных координатах получены линейные зависимости ( рис. II и 12); однако величина обратной скорости образования синглетного кислорода для этих полиаренов ( 9,4 Ю7 и 3,5-10%-I#c , соответственно) оказывается гораздо большей, чем для случая с ДМБА ( 1,7-105 іГЇс"1), хотя сенсибилизированное эозином натрия окисление проводилось для всех трёх соединений в одинаковых условиях и при равной интенсивности облучения красителя.
Можно полагать, что это явление связано с протеканием параллельно со взаимодействием с синглетным кислородом окисления БП И ДБП в этой системе и другими путями. Так например, возможен триплет-триплетный перенос энергии от эозина к полиаренам и, соответственно, протекание непосредственных процессов их фотоокисления , так как энергия триплетного состояния БП ( 1,82 эВ / 81/) и ДБП ( 1,49 эВ /82 /) заметно ниже энергии триплетного состояния эозина (1,97 эВ/83/). Если все же использовать в качестве основы для оценки реакционной способности БП и ДБП с 0% величину обратной скорости образования синглетного кислорода из данных, полученных для зависимости сенсибилизированного эозином окисления ДМБА, то константа скорости реакции БП и ДБП с 0 составит величину порядка 10 . Для предотвращения процесса триплет-триплетного переноса энергии от красителя на молекулу арена нами был поставлен эксперимент по фотосенсибилизированному метиленовым голубым ( с энергией триплетного состояния 1,39 эВ /83/) окислению БП в четы-рёххлористом углероде, в котором константа скорости дезактивации 0g является наименьшей ( к = 38,5 с ""1 / 21/). Исходя из этого ( рис. 9) получена величина константы скорости взаимодействия БП с С 2 равная 4,3 ICr ІҐ с . Однако она может оказаться завышенной вследствие возможности протекания радикальных реакций. Дело в том, что четырёххлористый углерод как сильный акцептор электрона может реагировать с молекулами красителя в возбужденных состояниях по механизму, в котором перенос электрона приводит к образованию радикальных продуктов; последние могут взаимодействовать с БП и внести, соответственно, дополнительный вклад в процесс окисления / 83/. Для уточнения роли синглетного кислорода в процессе фото-инициированного окисления БП был проведен дополнительный эксперимент в присутствии тушителей 2» Действительно, присутствие таких эффективных тушителей 0 , как азид натрия и триэтиламин, ингибирует процесс фотоокисления БП в водно-спиртовой среде ( табл. 8). Однако это явление не может все же служить неопровержимым доводом в пользу доминирующего значения взаимодействия0р с бенз(а)пиреном при его ФО, так как указанные тушители способны эффективно тушить возбужденные состояния полициклических аренов / 85/.
С другой стороны,скорость окисления БП остается неизменной при замене НрО на D o в среде этанол-вода ( табл. 8), хотя длительность жизни Og в D20 в 17 раз больше, чем в НрО / 23/. Наряду с этим отметим, что скорость фотоокисления БП в этаноле резко увеличивается при добавлении воды ( табл. 8), несмотря на то, что время жизни 0 в этаноле больше, чем в НрО ( табл. 2). Таким образом, нам не удалось достоверно определить реакционную способность БП с Оо. Однако на основе приведенных выше результатов можно заключить, что взаимодействие с синглетно-возбуж-денным кислородом не играет существенной роли при фотоокислении бенз(а)пирена. В литературе / 88/ обращено внимание на то, что при фотоокислении БП образуются перекиси, разложение которых происходит с образованием гидроксильного радикала ( ОН ). Последний является, как известно, сильным гидроксилирующим агентом и подвергает полицикличесие арены дополнительному окислительному превращению. Поэтому представляется важным выяснить и оценить реакционную способность полиаренов во взаимодействии с ОН-радикалом. Для определения констант скорости такого взаимодействия с ОН-радикалом использован метод конкурентного акцептора, в качестве которого был выбран п-нитрозодиметиланилин (НДМА), предложенный в работе / 86/ в качестве специфичного акцептора для этого радикала. На графиках рис. 13-15 тангенсы угла наклона экспериментальных прямых представляют собой соотношения констант скоростей взаимодействия гидроксильного радикала с соответствующим полиареном и НДМА. На основе полученных отношений расчита-ны константы скоростей реакции аренов с ОН-радикалом исходя из того, что аналогичная константа для НДМА составляет 7,5 10% с / 89/ и является диффузионно контролируемой. Таким образом, константа скорости взаимодействия с ОН-радикалом имеет значения для антрацена - ( 1,09 І 0,09), пирена - ( 2,67 + 0,09) и бенэ-(а)пирена - ( 6,9 ± 1,0)401 М"1#с Как видно из приведенных результатов расчета, полученные константы скоростей, особенно в случае БП, заметно превышают величину константы скорости химической реакции, контролируемой диффузией. Такое явления, вероятно, можно объяснить взаимодействием полиарена кроме гидроксильного и с гидроперекисным радикалом ( НОр ), возникновение которого возможно в используемой системе в значительных количествах благодаря весьма низкой концентрации акцепторов ОН-радикала ( максимальная концентрация НДМА 10-15 мкМ) и сравнительно высокого значения константы скорости его образования по реакции 3.3 -- 4,5 Ю7 Г с" 1 /89 /. нго2 + ОН н2о + но2 (3.3) К сожалению, реакционная способность Н0р радикала с органическими соединениями, тем более - с полиаренами, изучена крайне недостаточно. Считается / 90/, что его окислительная способность выражена слабо и примерно на 5 - 6 порядков величин ниже, чем у ОН-радикала.
Влияние фенолов и хинонов на проникновение и превращение бенз(а)пирена в коже мышей
В табл. 13 приведены значения определяемых параметров, вычисленных по уравнению (4.8), для экспериментов по совместному проникновению БП с некоторыми фенолами или типичными продуктами окисления окисибензола - пирокатехином, п-бензохиноном и цис, цис-муконовой кислотой. Наличие испытанных веществ лишь статистически недостоверно влияет на величину константы скорости потока БП; на константу скорости метаболического превращения этого полиарена оказывает влияние добавки: ионола, которые снижает её при дозе 400 нмолей в 1,42 раза Снулевая гипотеза отвергается при (К 0,01) и при дозе 20 нмолей в 1,24 раза ( 0,1); п бензохинона, которая снижает скорость метаболизма БП в 1,29 раза при дозе 40 нмолей ( 0,I ) и в 1,34 раза при дозе 200 нмолей ( «О 0,1); при столь значительной дозе, как 400 нмолей обнаруживается ингибирующее действие 3,5-диметилфенола в 1,16 раза (« 0,2). Обнаруженный нами факт некоторого ингибирования п-бензохиноном метаболизма БП согласуется с данными из литературы по влиянию хинонов нафталина и бенз(а)пирена на окисление БП в микро-сомальной фракции печени крыс / 106, 107/. Другой же используемый в наших опытах хинон - 1,6-БП-хинон всё же немного ускоряет, хотя и статистически недостоверно, метаболическое окисление БП. Это несоответствие с литературными данными можно объяснить тем, что при больших дозах 1,6-БП-хинона он в значительной мере поглощает флуоресцентное излучение БП при 403 нм и часть возбуждающего излучения. Естественно, что в этом случае интерпретация результатов опыта по предложенной модели (4.8) оказывается затруднительной, так как в предложенной модели не учитываются действие приведенных выше дополнительных факторов. Интересно отметить, что в работе /108/, проведенной in vitro метаболизма БП в гомогенате индуцированного метилхолантреном эпидермиса мышей, наличие ионола при эквимолярной концентрации его с БП ускоряло метаболическое превращение этого ПА. В нашем же исследовании обнаружен, напротив, эффект ингибирования, возрастающий с увеличением содержания ионола. Описанные расхождения свидетельствуют о несоответствии указанной системнії! vitro с изученной нами системой in vivoкожи мышей. Изменения параметров "а" и " ъ" нами в данном случае не рассматриваются, поскольку они являются характерными величинами для каждой группы животных и их значения зависят от поверхностной концентрации БП, которая в свою очередь определяется величиной площади распределения раствора БП и структурными особенностями кожи. Приведенные выше данные, характеризующие влияние использованных сопутствующих веществ на величину константы скорости метаболического превращения БП в коже живых мышей в известной мере аналогичны результатам экспериментального изучения канцерогенной активности тех же соединений.
Так пирокатехин и п-бензохинон, согласно нашей работе /НО/, статистически недостоверно оказывают влияние на способность БП вызывать опухоли при кожной аппликации и их наличие лишь незначительно изменяло кинетику проникновения БП в кожу безволосых мышей. Таким образом, предложена и проверена на экспериментальном материале кинетическая модель проникновения конечного количества канцерогенного БП в кожу безволосых мышей. Обнаружено, что только ионол существенно замедляет скорость метаболизма БП в коже мышей, а другие изученные соединения не изменяют существенно кинетики проникновения и превращения БП в кожу. Разработанная методика по изучению проникновения и превращения БП в коже живых мышей использована для выявления эффек тивости антиканцерогенных препаратов /III/. 3. Влияние пирокатехина и п-бензохинона на канцерогенное воздействие бенз(а)пирена / ПО/. Известно /112/, что промоторное или антиканцерогенное действие ингибиторов радикальных процессов на развитие химического канцерогенеза в значительной мере зависит от величины взятой дозы и времени введения ингибитора. Так /ИЗ/, при введении малых доз фенола и 5-метилрезорцина совместном с обработкой мышей канцерогенным бенз(а)пиреном происходит ингибирование процесса канцерогенеза; при последовательном порядке же нанесения - проявляются их канцерогенно-промоторная активность. Поскольку типичными продуктами как химического, так и метаболического окисления фенола(оксибензола) являются пирокатехин (П) и п-бензохинон (БХ) / 109, 114/, весьма важно выяснить также и их влияние на канцерогенез БП, тем более, что они тоже могут явиться спутниками канцерогенных полиаренов в технических загрязнениях. Отметим, что хиноны, в отличие от фенолов из которых они образуются, являются более реакционоспособными соединениями и по своим физиологическим свойствам резко отличаются от фенолов / Н5/. Настоящий раздел работы выполнен по методике, описанной в 4 главы II; результаты эксперимента представлены в табл.14 и на рис. 23. Из данных, полученных в этих опытах прежде всего несходимо указать на отсутствие возникновения опухолей кожи у мышей, которым наносили растворы П или БХ либо непосредственно растворитель - ацетон (холостой опыт). Из рис. 23 видно, что при совместной аппликации БП с БХ существенных различий в динамике развития опухолей в сравнени с под- группой для раздельного нанесения БП не наблюдается. При совместной аппликации БП и. П количество опухолей нарастало несколько быстрее, чем для БП - первая из них зарегистрирована на 37 неделе, и достигало максимума на 50 неделе; соответственно, в подгруппе БП аналогичные результаты зафиксированы на 30-ой и 50-ой неделях. Средний латентный период возникновения опухолей при совместной аппликации составил 33, 36 и 33 недели для подгрупп БП, БП+П и БП+БХ, соответственно.
При последовательном нанесении исследуемых веществ опухоли появлялись лишь на 59-ой неделе и наибольшего значения их число достигало к 61-ой неделе; средний латентный период для подгрупп БП+П и БП+БХ составил 62 и 67 недель, соответственно. В табл. 14 представлены данные, характеризующие количество и природу опухолей в разных группах. Процент их возникновения у животных в подгруппах первой серии опытов имеет близкие значения. Поэтому представляется возможным заключить, что пирокатехин и п-бензохинон статистически недостоверно влияют на канцерогенную активность бенз(а)пирена при совместной их аппликации на кожу мышей. При последовательной аппликации по схеме коканцерогенеза процент возникновения опухолей составил 17$ для подгруппы БП+П и 10% для подгруппы БП+БХ. По данным из литературы /116/ процент возникновения опухолей при раздельном нанесении БП в течение одного месяца оказывается в два раза меньшим, чем при четырёхмесячной его аппликации - при одной и той же суммарной дозе 0,8 мкмолей. Поэтому можно представить себе, что процент возникновения опухолей при месячной аппликации БП в данном случае составит примерно 25%. Таким образом, и в случае постановке эксперимента по схеме коканцерогенеза не наблюдаются статистически значимые различия, хотя БХ в несколько большей степени ингибирует по сравнению с П. Из полученных в настоящем разделе работы данных следует, что продукты окисления фенола - пирокатехин и п-бензохинон не могут быть ответственными за обнаруженное в работе /ИЗ/ ингибирующие и промотирующие эффекты фенолов. Отметитм так же, что в случае последовательной обработки наблюдается, по-видимому, ингибирую-щее воздействие пирокатехина и, особенно, п-бензохинона. 1. Предложена и проверена на экспериментальных данных по измерению флуоресценции индикаторного канцерогенного полиарена кинетическая модель проникновения и превращения конечного количества бенз(а)пирена в коже живых мышей, основанная на интерпретации процессов нестационарной диффузии и метаболического окисления бенз(а)пирена по закону реакции первого порядка. 2. С помощью предложенной кинетической модели изучено влияние варьируемых доз фенолов, хинонов и муконовойкислоты при совместном их нанесении с бенз(а)пиреном на величины констант скоростей, характеризующих процесс диффузии и метаболического окисления БП в коже живых мышей.
