Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Метод гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света, открытый в начале 70-ых годов, позволяет исследовать структурно-функциональную организацию как простых органических молекул, так и сложных молекулярных комплексов на границе раздела фаз. Среди ГКР-активных субстратов в настоящее время широко используются анодированные серебряные электроды в электрохимической ячейке. Их главным преимуществом, важным для изучения природы ГКР, является возможность плавного изменения шероховатости поверхности путем подбора условий проведения окислительно-восстановительного цикла (ОВЦ) и контроль потенциала поверхности. Однако к настоящему времени не рассмотрен ряд вопросов, связанных с особенностями усиления ГКР молекул, адсорбированных на анодированных электродах: мало уделяется внимания причинам зависимости спектров ГКР от потенциала электрода, не установлены спектральные критерии проявления определенной геометрии адсорбции молекул, содержащих различного типа адсорбционные центры, а также бихромофорных молекул, к числу которых относятся тиаминовые производные. Мало известно о спектральных проявлениях специфических межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое.
Флавин-содержащие молекулярные системы являются удобными объектами для выяснения причины зависимости спектров ГКР от потенциала электрода в силу своих окислительно-восстановительных свойств.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось выяснение механизмов усиления отдельных полос в спектрах ГКР и установление спектральных критериев структурно-конформационных переходов тиамин- и флавин-содержащих молекулярных систем, адсорбированных на положительно заряженной поверхности серебра. Достижение поставленной цели потребовало решения следующих задач:
-провести оптимизацию получения спектров исследуемых соединений и исследовать основные механизмы усиления ГКР;
-интерпретировать спектры ГКР тиамина и его производных, полученных при различных потенциалах электрода и рН электролита;
-изучить влияние ионов . двухвалентных металлов, а также аминокислот и пирувата на спектры ГКР тиамина и тиаминдифосфата (ТДФ) при различных рН;
-определить зависимость формы и положения полос в спектре ГКР флавинадениндднуклеотида (ФАД) от структурно- функционального состояния молекулы, а также присутствия этанола;
получить и интерпретировать спектры ГКР адсорбированных пируватдекарбоксилазы (ПДК) и алкоголь оксидазы (АО) как в нативном, так и диссоциированном состоянии, выявить спектральные критерии оценки функционального состояния адсорбированного фермента.
Научная новизна полученных результатов.
При решении поставленной задачи выявлены основные механизмы усиления ГКР тиамина, адсорбированного на анодированном электроде и с учетом этого произведена интерпретация спектров ГКР тиамина и его производных. Показано, как в спектрах' ГКР проявляются особенности ионного и конформационного состояния адсорбированных молекул. На основании данной интерпретации сделан- вывод о том, что в процессе адсорбции тиамина и окситиамина из раствора электролита сохраняется конформация этих молекул. Кроме того, при исследовании специфического взаимодействия ТДФ с ионами двухвалентных металлов показано, что вблизи поверхности имеет место изменение конформации комплекса при увеличении положительного потенциала электрода. Впервые представлены и проанализированы спектры ГКР ПДК. Кроме того, установлена корреляция между сигналом ГКР фермент- связанного ФАД и особенностями четвертичной структуры АО. Показано, что адсорбированная белковая система при определенных условиях сохраняет ферментативную,активность.
Практическая значимость полученных результатов.
Предложенная методика получения спектров ГКР сложных
молекулярных комплексов, а также их интерпретация могут быть
использованы . для изучения различных молекулярных систем в
адсорбированном состоянии. ч
Выводы о конформационном состоянии адсорбированных молекул, о существовании специфического взаимодействия между тиамином и пируватом в приповерхностном слое, а также о влиянии ионов
двухвалентных металлов и гистидина на структурно-конформационное
состояние адсорбированного тиамина могут быть использованы для
постановки модельных экспериментов в области биохимии и их
интерпретации. А именно, при исследованиях и моделировании
микроокружения активных центров пируватдегидрогеназного
ферментативного комплекса. Кроме того, установление специфичности вышеупомянутых взаимодействий может быть принято за основу при разработке конкретных путей иммобилизации ферментных комплексов на базе ПДК.
Вывод о сохранении активности алкогольоксидазой, адсорбированной на анодированной поверхности серебра, может быть использован, во-первых, для разработки и создания биосенсоров спиртов с ГКР-регистрацией, и, во-вторых, в соответствующих областях биотехнологии для создания систем на основе иммобилизованного фермента.
> Основные положения, выносимые на защиту.
1. Вывод о независимости .соотношения вкладов
дальнодеиствующего и короткодействующего механизмов от степени
анодирования при суммарном количестве заряда, прошедшем через
поверхность электрода, от 12 до 18 мКл и, основанная на этом выводе,
интерпретация спектров ГКР тиамина и ФАД при различных значениях
рН электролита.
2. Подход к интерпретации зависимости спектров ГКР
тиаминовых и~ флавиновых соединений от потенциала электрода с
позиции изменения структурно-конформационного состояния молекул в
адсорбционном слое, индуцированном положительно заряженной
поверхностью.
3. Методика получения стабильных спектров ГКР тиамин- и
флавин- содержащих белковых комплексов.
Личный вклад соискателя.
В диссертации изложены результаты полученные лично автором, а также анализ этих результатов, выполненный совместно с научными руководителями Маскевичем С.А. и Комяком А.И. Соавторы Кивач Л.Н. и Гачко Г.А. также участвовали в постановке экспериментов и в обсуждении экспериментальных результатов. Исследование рельефа поверхности электрода методом туннельной и атомно-силовой
микроскопии - выполнены в лаборатории Отдела проблем ресурсосбережения при участии Свекло И.Ф. Соавторы Черникевич И.П. и Арцукевич И.М. участвовали в подготовке соединений и проведении биохимических исследований, не включенных в данную диссертацию. Соколов К.В. и Ходорченко П.В оказывали, помощь в освоении метода ГКР и проведении контрольных измерений.
Апробация полученных результатов.
Результаты. исследований, включенные в диссертацию докладывались на международных конференциях и конгрессах -ХН, XIII и XIV Международных конференциях по Раман- спектроскопии, проводившихся соответственно в Колумбии (США) в 1990 г., в Вюрцбурге (Германия) в 1992 г. и в Гонг- Конге в 1994 г.; XX, XXI и XXII Европейских конгрессах по молекулярной спектроскопии, проводившихся соответственно в Загребе (Югославия) в 1991г., в Вене (Австрия) в 1992 г.и в Эссене (Германия) в 1994 г.; VII конференции, по спектроскопии биополимеров, состоявшейся в Харькове в 1991 г.; 4-ой и 5-ой Международных конференциях по применению лазеров в науках о жизни, проводившихся соответственно в Июваскюля (Финлядия) в 1992 г. и в Минске (Беларусь) в 1994 г.; Питтсбургских международных конференциях - по аналитической химии и прикладной спектроскопии (США) в 1993 и 1994 годах; 4-ой Европейской конференции по спектроскопии биомолекул^состоявшейся в Йорке (Великобритания) в 1991 г.; на I Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии, состоявшейся в Гродно в 1993 г. и на 1-ом съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков в Минске в 1994 г.
Опубликованность результатов.
Результаты диссертации опубликованы в 7 статьях в научных журналах, 4 статьях в сборниках и 11 тезисах конференций.
Структура и объем диссертации.
