Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оптические методы исследования биомакромолекул (литературный обзор)
1.1. Строение белковых молекул и их свойства 13
1.2. Состав плазмы крови и функции основных компонентов плазмы крови высших млекопитающих 17
1.3. Динамическое рассеяние света. Исследование биологических объектов (определение размеров и формы рассеивающих свет
частиц) с помощью лазерной корреляционной спектроскопии 21
1.4. Применение статического рэлеевского рассеяния света в растворах для определения массы биомакромолекул 30
1.5. Исследование физико-химических свойств биологических объектов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света 36
1.6. Применение электронной УФ спектроскопии (спектры люминесценции) для исследования свойств биологических систем 45
Глава 2. Методическая часть эксперимента
2.1. Приготовление объектов исследования (растворы белков, растворы сыворотки крови, ишемическая процедура)
2.1.1. Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования белковой агрегации в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl) 55
2.1.2. Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования ДСН - вызванной денатурации и
тепловой денатурации белка 56
2.1.3. Приготовление сыворотки крови животных для исследования ишемического воздействия на её компоненты 56
2.2. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследования динамического и статического рассеяния света 58
2.3. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследования комбинационного рассеяния света 63
2.4. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследований сыворотки крови люминесцентно — спектральным анализом 65
Глава 3. Исследование агрегации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжёлого металла (хлорида цезия CsCl) методами лазерной спектроскопии
3.1. Лазерная корреляционная спектроскопия процессов агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl) 67
3.2. Исследование аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl) методом спектроскопии комбинационного рассеяния света 77
Глава 4. Корреляционная спектроскопия рассеянного света ДСН - вызванной и тепловой денатурации сывороточного альбумина человека
4.1. Исследование денатурации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии ионного детергента додецилсульфата
натрия (ДСН) методом динамического рассеяния света 96
4.2 . Изучение тепловой денатурации сывороточного альбумина при различных значениях рН буферных растворов методом динамического рассеяния света 107
Глава 5. Исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови оптико - спектральными методами
5.1. Определение размеров компонентов сыворотки крови (липопротеинов низкой плотности) методом корреляционной спектроскопии рассеянного света для оценки повреждающего действия ишемии 120
5.2. Определение молекулярной массы и плотности липопротеинов низкой плотности здоровой и ишемической сыворотки крови методом статического рэлеевского рассеяния света. 125
5.3. Исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови методом спектроскопии комбинационного рассеяния света 128
5.4. Изучение повреждающего воздействия ишемии на сыворотку крови животных с помощью люминесцентного анализа 141
Основные результаты и выводы 157
Список цитируемой литературы
- Состав плазмы крови и функции основных компонентов плазмы крови высших млекопитающих
- Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования белковой агрегации в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl)
- Исследование аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl) методом спектроскопии комбинационного рассеяния света
- . Изучение тепловой денатурации сывороточного альбумина при различных значениях рН буферных растворов методом динамического рассеяния света
Введение к работе
Быстрое развитие оптико - спектральных методов в последние годы послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине. В настоящее время оптико -спектральные методы являются незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. Данная диссертационная работа посвящена применению оптических методов для исследования биологических объектов - компонентов сыворотки крови.
Корреляционная спектроскопия квазиупруго рассеянного света (метод динамического светорассеяния) занимает прочное место в качестве стандартного способа измерения размера рассеивающих частиц. Этот метод характеризуется высокой точностью и не возмущающим исследуемую систему способом измерений. Метод статического рэлеевского рассеяния света является удобным способом определения молекулярного веса биологических объектов, охватывая исключительно широкий интервал молекулярных масс. Светорассеяние, как метод, не вторгается в состав биологических систем, поэтому спектроскопия рассеянного света получила широкое распространение в медицинских, биохимических и биофизических исследованиях [1,2].
Комбинационное рассеяние (КР) света, обширно используемое для исследования функций и структуры биологических молекул, имеет большой потенциал для применения его в биологической и медицинской областях науки. Развитие комбинационной спектроскопии ближней инфракрасной области с фурье-преобразованием расширило возможности применения данного метода в биомедицинских целях. Методы КР - спектроскопии позволяют получать уникальную информацию о структуре различных химических связей в биологических макромолекулах.
Изучение вида спектров люминесценции, их интенсивности нашло широкое применение в медицинских и биологических исследованиях. По интенсивности люминесценции можно судить об электронно-энергетическом состоянии биологических макромолекул, клеток и тканей организма.
Одним из объектов исследования в данной работе является сывороточный альбумин человека. Сывороточный альбумин человека представляет собой глобулярный белок, выполняющий в плазме крови транспортные функции. Многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином. Поэтому его агрегация в большие белковые комплексы в присутствии солей тяжелых металлов может вызывать серьёзные фармакокинетические последствия. Следовательно, результаты исследования методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света размеров, формы молекул альбумина при агрегации этого белка в зависимости от количества хлорида цезия (CsCl) представляют интерес не только с точки зрения развития оптико - спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем, но и с точки зрения биологических и медицинских проблем. Особое внимание в работе посвящено выяснению аминокислотного механизма агрегации альбумина в присутствии соли тяжелого металла методом КР - спектроскопии.
Исследование денатурации сывороточного альбумина представляет интерес в прикладной биохимии белков. Многие биологические и фармацевтические системы содержат белки и детергенты. Проведённые исследования размеров и формы сывороточного альбумина в зависимости от концентрации денатурирующего агента (додецилсульфата натрия) при различных значениях рН буферных растворов важны с точки зрения прикладных биологических и медицинских проблем. Денатурация белков приводит к потере их нативности, и современная фундаментальная биология уделяет огромное внимание нарушению нативной конформации белков, связывая с нею важнейшие свойства клеток. В работе также изучен вопрос
7 термической денатурации белков, который имеет ценность в связи с большим интересом в последнее время к вопросам термотерапии ряда онкологических заболеваний.
Большое внимание в работе посвящено вопросу применения оптико -спектральных методов для исследования повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови, в частности, на липопротеины низкой плотности. Полученные в работе результаты говорят о перспективности использования оптико-спектральных методов (спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентной спектроскопии) для оценки ишемических повреждений. В развитии многих патологических состояний, в частности, вследствие ишемического воздействия, в организме животных принимают непосредственное участие свободнорадикальные реакции активных форм кислорода Изучение свободнорадикальных окислительных повреждений компонентов крови при ишемии оптико — спектральными методами помогает вникнуть в механизм этих реакций и, следовательно, понять, как их можно контролировать. По этой причине исследование влияния ишемии на сыворотку крови оптическими методами значимо не только в области теоретической биологии и физики, но и в медицине.
Цель и задачи диссертационной работы
Цель диссертационной работы состояла в исследовании компонентов сыворотки крови (сывороточного альбумина крови человека и цельной сыворотки крови животных) оптико — спектральными методами: методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света (динамическое и статическое светорассеяние), методами спектроскопии комбинационного рассеяния света, методами люминесцентного анализа. В частности, в задачи диссертационной работы входило: 1. изучение агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия - определение структурных особенностей образующихся
8 белковых агрегатов в зависимости от рН раствора и концентрации соли (с помощью лазерной корреляционной спектроскопии), анализ аминокислотного механизма комплексообразования молекул альбумина (методом КР - спектроскопии).
исследование процессов денатурации (тепловой и в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия) сывороточного альбумина в зависимости от рН растворов (с помощью метода спектроскопии квазиупруго рассеянного света).
изучение влияния ишемии головного мозга на физические (размер и форму) параметры (методом спектроскопии квазиупруго рассеянного света) и химическую структуру компонентов сыворотки крови (с помощью КР -спектроскопии и люминесцентного анализа).
Научная новизна работы
Методом КР - спектроскопии впервые исследован аминокислотный механизм агрегации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия.
Исследованы размер и форма агрегатов сывороточного альбумина человека, образующихся в присутствии соли тяжелого металла (хлорида цезия), в зависимости от рН раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии.
Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии додецилсульфата натрия в зависимости от значения рН раствора и концентрации додецилсульфата натрия (ДСН) методом динамического светорассеяния.
Исследована тепловая денатурация сывороточного альбумина человека в зависимости от значения рН раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии.
5. Методами спектроскопии рассеянного света впервые установлено
изменение размеров и плотности липопротеинов низкой плотности
сыворотки крови животных вследствие ишемии головного мозга.
6. Подтверждена с помощью метода КР - спектроскопии и люминесцентного
анализа предложенная теория свободнорадикального повреждения
липопротеинов низкой плотности сыворотки крови вследствие
окислительного стресса после ишемии головного мозга.
Научная и практическая значимость результатов Результаты исследований методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа повреждающего воздействия ишемии на сыворотку крови животных говорят о перспективности использования оптико - спектральных методов для оценки ишемических повреждений компонентов крови.
Результаты исследования агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжелого металла представляют интерес не только с точки зрения биологических и медицинских проблем (многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином, и поэтому его агрегация в большие белковые комплексы может вызывать серьёзные фармакокинетические последствия), но и с точки зрения развития оптико-спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем.
Полученные результаты изучения денатурации сывороточного альбумина в зависимости от концентрации ДСН при различных значениях рН буферных растворов, а также результаты исследований тепловой денатурации альбумина интересны не только для специалистов в области биохимии, но и показывают широкие возможности применения оптических методов в биологических системах.
10 Основные защищаемые положення
1. Присутствие хлорида цезия (CsCl) вызывает агрегацию молекул
сывороточного альбумина человека Размер образующихся белковых
агрегатов возрастает прямо пропорционально концентрации соли.
Зависимость гидродинамического радиуса белковых комплексов от рН
буферного раствора в пределах каждого значения концентрации CsCl имеет
параболический вид с максимумом в изоэлектрической точке белка
Наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической
точки. Добавление хлорида цезия приводит к слипанию молекул альбумина в
агрегаты практически сферической формы. Определен аминокислотный
механизм CsCl-индуцированной агрегации и выяснены агрегационные
химические связи, возникающие между цепями аминокислот сывороточного
альбумина
2. Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина
человека в присутствии ионного отрицательно заряженного детергента
додецилсульфата натрия (ДСН) в зависимости от значения рН раствора и
концентрации детергента Большая денатурация белка в присутствии ДСН
имеет место при значениях рН буферного раствора, меньших
изоэлектрической точки альбумина
3. Денатурация сывороточного альбумина человека под влиянием
температуры зависит от рН раствора Для выбранных в работе значений рН
тепловая денатурация происходит сильнее при тех значениях рН буферного
раствора белка, которые более близки к изоэлектрической точке данного
белка.
4. Размер липопротеинов низкой плотности (J111H1J) сыворотки животных
после ишемии головного мозга больше размера ЛПНП контрольной здоровой
сыворотки. Плотность ЛПНП после ишемии меньше плотности контрольных
здоровых ЛПНП. Увеличение размеров ЛПНП и уменьшение их плотности
после ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛПНП объясняется
11 разрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛПНП под действием свободнорадикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии. 5. Интенсивность люминесценции сыворотки крови животных после ишемии сильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови. Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки крови после ишемии головного мозга однозначно отражает повышенную концентрацию свободнорадикальных липидных соединений в фосфолипидном слое постишемических ЛПНП. Добавление флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико-химических свойств ЛПНП сыворотки крови животных до и после ишемической процедуры.
Структура н объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 184 страницах, содержит 42 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из 200 наименований.
Во введении рассматривается актуальность поставленных задач и обсуждаются цели настоящей работы.
Первая глава, состоящая из шести параграфов, посвящена обзору литературы, относящейся к исследованию биологических макромолекул с помощью оптических методов (динамического и статического светорассеяния, комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа).
Вторая глава посвящена методической части экспериментов: представлены методики приготовления биологических образцов, описаны экспериментальные методы исследования.
В главах с третьей по пятую представлены и обсуждены полученные экспериментальные результаты.
В заключение отдельным пунктом вынесены основные результаты и выводы работы.
12 Аоробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:
1. Международная конференция студентов и аспирантов по
фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, Россия, 2004 г.);
III Международная конференция молодых ученых и специалистов «Оптика-2003» (Санкт-Петербург, Россия, 2003 г.);
Международная конференция «Advanced Laser Technologies-ALT,04» (Рим, Фраскати, Италия, 2004 г.);
XI Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем - Яльчик - 2004» (Яльчик, Россия, 2004 г.);
III Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики-2004» (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Состав плазмы крови и функции основных компонентов плазмы крови высших млекопитающих
Кровь - это среда, осуществляющая транспорт различных веществ в пределах организма, она переносит дыхательные газы (кислород и углекислый газ), питательные вещества, гормоны, микроэлементы, витамины, ферменты, образующиеся в организме. Состав и физические свойства циркулирующей крови (относительное постоянство концентраций растворенных веществ, температуры и рН) постоянно контролируются и корректируются определенными органами с целью обеспечения постоянства внутренней среды (система гомеостаза). На долю крови у взрослого человека приходится примерно 6-8 % общей массы тела, это соответствует 4-6 л. крови. Основными функциями крови являются транспортная, защитная и регуляторная, остальные функции, приписываемые системе крови, являются лишь производными основных её функций. Транспортная функция осуществляется как плазмой, так и форменными элементами (клетками крови). Благодаря транспорту осуществляется дыхательная функция крови. С транспортом связаны питательная функция крови и выделительная функция крови. С наличием в крови лейкоцитов связана специфическая (иммунитет) и неспецифическая (главным образом фагоцитоз) защита организма. В составе крови содержатся все компоненты системы комплемента, играющей важную роль в защите организма. К защитным функциям относятся сохранение циркулирующей крови в жидком состоянии и остановка кровотечения в случае нарушения целостности сосудов. Регуляторная функция в первую очередь связана с поступлением в кровь гормонов, биологически активных веществ и продуктов обмена Благодаря регуляторной функции крови осуществляется сохранение постоянства внутренней среды организма, водного и солевого баланса тканей и температуры тела, контроль за интенсивностью обменных процессов, регуляция важных физиологических функций.
Кровь представляет собой непрозрачную красную жидкость, состоящую из бледно-желтой плазмы (плазма, лишённая фибриногена, называется сывороткой крови) и взвешенных в ней клеток - красных кровяных телец (эритроцитов), белых кровяных телец (лейкоцитов) и кровяных пластинок (тромбоцитов).
Плазма представляет собой жидкую часть крови, в состав которой входят различные низкомолекулярные соединения (соли, углеводы, липиды, ферменты, продукты обмена, гормоны, витамины, растворённые газы) и белки [6]. В 1 литре плазмы человека содержится 900-910 г. воды, 65-80 г. белка и 20 г. низкомолекулярных соединений. рН плазмы незначительно колеблется в пределах 7,37-ь7,43, составляя в среднем 7,4.
Белки плазмы разделяют на три основные группы: альбумины (белки с относительно малой молекулярной массой примерно 70 кДа), глобулины (крупномолекулярные белки с массой 100-2500 кДа) и фибриноген (молекулярная масса 340 кДа) [7]. Концентрация альбумина (35-40 г/л) в плазме выше, чем концентрация других белков плазмы. Именно этот белок вносит основной вклад во внутрисосудистое коллоидно-осмотическое давление, наряду с этой функцией альбумин служит ещё молекулой переносчиком. Глобулины (белки, нерастворимые в воде, но растворимые в водно-солевых растворах) плазмы крови - это гетерогенная смесь сложных белковых молекул, обычно называемых а-, Р- и у-глобулинами, данная классификация основана на электрофоретической подвижности этих белков. Более рациональная классификация глобулинов базируется на их структуре и функциях: гликопротеины (содержат ковалентно связанные фрагменты олигосахаридов), липопротеины (содержат липиды, обычно нековалентно связанные с белковой молекулой), иммуноглобулины или антитела (выполняют роль эффекторов гуморальной иммунной системы). Важным белковым компонентом плазмы является фибриноген - предшественник фибрина, образующего кровяные сгустки. Сыворотка крови представляет собой плазму, из которой удалён фибриноген.
Функции белков плазмы крови весьма разнообразны: белки обеспечивают онкотическое давление крови, от которого зависит обмен воды и растворенных в ней веществ между кровью и тканевой жидкостью; регулируют рН крови; влияют на вязкость крови; обеспечивают гуморальный иммунитет; принимают участие в свертывании крови; способствуют сохранению жидкого состояния крови, т.к. входят в состав противосвертывающих веществ; служат переносчиками гормонов, минеральных веществ и др.; обеспечивают процессы репарации, роста и развития различных клеток организма.
В ходе выполнения данной работы исследовалось влияние ишемии на один из глобулиновых компонентов сыворотки крови - на липопротеины (табл. 1). Среди липопротеинов, важных в физиологическом отношении, выделены четыре основных группы: 1) хиломикроны (образующиеся в кишечнике при всасывании триацилглицерола), 2) липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП или пре-р-липопротеины), которые образуются в печени и используются для экспорта триацилглицерола, 3) липопротеины низкой плотности (ЛПНГТ или (З-липопротеины), представляющие собой конечную стадию катаболизма ЛПОНП, 4) липопротеины высокой плотности (ЛПВП или а-липопротеины), участвующие в метаболизме ЛПОНП и хиломикронов [6,7]. Иногда выделяют как отдельную группу липопротеины средней плотности (ЛПСП).
Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования белковой агрегации в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl)
Дня исследования агрегации сывороточного альбумина крови человека в присутствии соли тяжелого металла (CsCl) методом лазерной корреляционной спектроскопии растворы альбумина были получены путём разведения белка до концентрации 1 мг/мл в двух различных буферных системах: 1) буферный раствор, содержащий 0,1 М СН3СООН - 0,1 М КОН, рН 3,0 -5,0; 2) буферный раствор, содержащий 0,1 М КН2Р04 - 0,1 М NaOH, рН 6,0 -8,0. Агрегация белковых молекул в присутствии соли тяжелого металла была исследована путём добавления в буферные растворы при различных значениях рН (3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0) разных количеств хлорида цезия (0,1 М; 0,2 М; 0,5 М; 0,6 М; 0,7 М CsCl).
Для определения аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии CsCl методом спектроскопии комбинационного рассеяния света растворы альбумина были получены путём разведения белка до концентрации 10 мг/мл в двух различных буферных системах: 1) буферный раствор, содержащий 0,1 М СНзСООН - 0,1 М КОН, рН (3,0; 4,0; 5,0) 2) буферный раствор, содержащий 0,1 М КН2Р04 - 0,1 М NaOH, рН (6,0; 7,0; 7,4; 8,0). Агрегация белковых молекул в присутствии CsCl исследовалась путём добавления в буферные растворы белка при различных значениях рН (3,0-г8,0) разных количеств CsCl (ОД М; 0,2 М; 0,5 М; 0,6 М; 0,7 М CsCl). Образцы растворов альбумина помещались при измерении в кварцевую кювету при комнатной температуре.
Для изучения денатурации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) методом динамического светорассеяния растворы альбумина были получены путём разведения белка до концентрации 1 мг/мл в двух различных буферных системах: 1) буферный раствор, содержащий 0,1 М СН3СООН -0,1 М КОН, рН 3,5-s-5,0; 2) буферный раствор, содержащий 0,1 М КН2Р04 -0,1 М NaOH, рН 5,0 6,0. Денатурация альбумина в присутствии ДСН была исследована путём добавления в буферные растворы белка при различных значениях рН (3,5; 4,0; 4,3; 4,5; 4,6; 5,0; 5,3; 6,0) разных количеств ДСН (0,5 мМ; 2,0 мМ; 4,0 мМ; 5,0 мМ; 7,0 мМ; 8,0 мМ; 10,0 мМ).
Для изучения тепловой денатурации сывороточного альбумина крови человека методом динамического светорассеяния растворы альбумина были получены путём разведения белка до концентрации 1 мг/мл в буферной системе, содержащей 0,1 М КН2Р04 - 0,1 М NaOH, рН 5,5V7,5. Тепловая денатурация альбумина исследовалась путём изменения температуры (21 С, 28 С, 35 С, 43 С, 44 С, 45 С, 46 С, 47 С, 48 С) буферных растворов белка при различных значениях рН (5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5).
Для исследования повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови, в частности на липопротеины низкой плотности (ЛПНП), была выполнена процедура ишемии головного мозга на группе крыс (10 животных). Работа проводилась на сыворотке крови крыс линии Вистар (молодые самки массой 160-190 г.), перенесших глобальную ишемию (1,5 часа) головного мозга. Предварительно животные подвергались наркозу посредством инъекции хлоралгидрата (350 мг/мл), не оказывающим влияния на компоненты плазмы крови (а именно на ЛПНП), что было показано в ходе выполнения исследований. Полная ишемия головного мозга достигалась путём прекращения тока крови через обе сонные артерии, оставшееся снабжение мозга кровью через спинномозговые артерии считалось незначительным. Забор крови у животных проводился из ярёмной вены. Производство сыворотки крови происходило по стандартной процедуре: полученная кровь находилась в течение первого часа при комнатной температуре, в течение второго часа при 4 С, т.о. достигалось полное свёртывание крови, далее с целью удаления фибринового тромба и клеток крови производилось центрифугирование крови, полученный супернатант и представлял собой требуемую сыворотку крови.
Для определения размеров ЛПНП методом корреляционной спектроскопии рассеянного света, а также для определения молекулярной массы ЛПНП методом статического рассеяния растворы сыворотки крови были разведены в буферной системе 0,1 М КН2Р04 - 0,1 М NaOH, рН 6,04-8,2 (значения рН были выбраны следующие: 6,0; 6,3; 6,5; 7,0; 7,4; 7,6; 7,9; 8,2), также содержащей 0,15 М NaCl, до концентрации общего белка сыворотки 1 мг/мл. Число крыс равнялось десяти.
В ходе исследования повреждающего действия ишемии на ЛПНП сыворотки крови крыс с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света образцы здоровой и ишемической сыворотки без разведения (при физиологическом значении рН 7,4) помещались при измерении в кварцевую кювету при комнатной температуре. Число крыс равнялось десяти.
Для исследований действия ишемии на ЛПНП сыворотки крови крыс с помощью люминесцентно - спектрального анализа образцы здоровой и ишемической сыворотки без разведения (при физиологическом значении рН 7,4) помещались при измерении в кювету при комнатной температуре. Число крыс равнялось четырнадцати.
Исследование аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (CsCl) методом спектроскопии комбинационного рассеяния света
В настоящее время с целью исследования структуры и свойств белков плазмы крови, а также с целью изучения влияния на них различных внешних факторов широко применяется метод комбинационного (рамановского) рассеяния света В параграфе 3.1. показаны результаты исследований агрегации молекул сывороточного альбумина, вызванной воздействием солей тяжелых металлов (CsCl), методом корреляционной спектроскопии упруго рассеянного света В этом параграфе представлено исследование этого явления методом комбинационного рассеяния света.
Комбинационное рассеяние (КР) света, обширно используемое для исследования функций и структуры биологических молекул, имеет большой потенциал для применения его в биологической и медицинской областях науки. Медицинские и биологические применения данного метода ограничены двумя сложностями, возникающими в ходе работы: флуоресценцией и тепловой денатурацией объектов. Развитие комбинационной спектроскопии ближней инфракрасной области с фурье-преобразованием расширило возможности применения данного метода в биомедицинских целях, т.к. работа в этой области спектра позволяет избегать флуоресценции и сильно уменьшает тепловую денатурацию биологических систем.
При работе с биологическими объектами спектроскопия комбинационного рассеяния дает информацию в первую очередь о переходах между колебательными энергетическими уровнями молекул. Колебательный спектр - спектр комбинационного рассеяния дает информацию о расположении химических связей в белковых молекулах, об агрегации молекул, вызванной солью тяжёлого металла.
На рис.7-12 представлены спектрограммы буферного раствора альбумина при рН 5,0 и их изменения при добавлении 700 мМ CsCl. Как указано ранее (в 2.3.), на каждом значении рН были выбраны пики рамановского смещения (появившиеся/пропавшие), имеющие место при всех пяти концентрациях CsCl. Именно эти пики рамановского смещения отмечены на рисунках этого параграфа В целях не загромождения рисунков представлены спектрограммы только при добавлении 700 мМ CsCl.
Как видно из рис.7, при добавлении CsCl появляются пики рамановского смещения, соответствующие дисульфидным -S-S- связям буферный раствор альбумина, рН 5,0, до добавления CsCl
КР - спектр буферного раствора альбумина (рН 5,0) до и после добавления 700 мМ CsCl в диапазоне 600-850 см"1. между остатками цистеина (720 см 1). Появляются пики (рис.8), определяемые -O-S- связями между остатками серина и цистеина (966 см"1). Возникают пики (рис.8), относящиеся к связям -O-S- между остатками глутаминовой кислоты и цистеина (1070 см"1); к связям, вызванным хлорированием (С1-СН2-) нейтральных аминокислот с алифатическими боковыми цепями, таких как аланин, валин, лейцин, изолейцин, треонин (1088 см 1). Как следует из рис.7,8, пропадают пики, соответствующие -S-H группе цистеина (636 см"1, 906 см"1). Исчезают пики рамановского смещения 1043 см"1, что говорит об отрыве крайнего водорода (-СН2-0-Н) в боковой цепи серина (рис.8).
Как показано на рис.9, при добавлении CsCl возникают пики (1322 см"1), объясняемые связью изолейцина с аминокислотами, боковые радикалы которых содержат амиды кислых групп (т.е. с аспарагином и глутамином): в боковых цепях аспарагина и глутамина происходит разрыв двойной связи между кислородом и углеродом (-CH2-CH2-O-CNH2-CH2-). Появляются пики (рис.9), относящиеся к -S-N- связи между цистеином и амидной группой аспарагина, глутамина (1420 см"1). Возникают пики (рис.9), связанные с хлорированием положительно заряженного остатка лизина С1"ЫНз+-СН2-(1503 см"1). А также возникают пики (рис.10), вызванные связыванием отрицательно заряженных аспарагиновой и глутаминовой кислот с ароматическими кольцами (за счет отрыва из последних атома водорода) следующих аминокислот - фенилаланина, тирозина, триптофана (1708см"1). При добавлении CsCl (рис. 9) исчезают пики, соответствующие NH3+ группе лизина (1448 см"1), амидной группе (1566 см"1) глутамина и аспарагина (в которой происходит отрыв водорода при добавлении соли). Также в случае наличия CsCl пропадают пики (рис.10) 1631 см"1 (что связано с отрывом водорода в ароматических кольцах фенилаланина, тирозина, триптофана), и пики 1825 см 1, что объясняется разрывом С=0 связи в аспарагине и глутамине. буферный раствор альбумина, рН 5,0, до добавления CsCl буферный раствор альбумина, рН 5,0, после добавления 700 мМ CsCl Интенсивность КР-рассеяния, рамановское смещение, см добавления 700 мМ CsCl в диапазоне 1600-1900 см На рис. 11 показано, что при добавлении CsCl возникают пики, вызванные возможностью на этом рН дополнительной связи в амидных группах аспарагина и глутамина, что обеспечивает связывание данных амидных групп с алифатическими аминокислотами валином, лейцином в виде -OC-NH2+-CH2- СНСНз- (2468 см"1, 2542 см"1) и изолейцином в виде -OC-NH2+-CH2-CH2- (2594 см"1). Появляются пики (рис.12), объясняемые связью изолейцина с серином через кислород -СН2-СН2-0-СН2- (2792 см"1). Как следует из рис.12, при добавлении соли исчезают пики 2863 см"1 и 2940 см"1, что связано с отрывом крайнего водорода в боковых цепях аланина, валина, лейцина, треонина, изолейцина (-СН2-Н).
На спектрограммах образцов раствора альбумина при рН 4,0 при соответствующих концентрациях хлорида цезия появляются пики, имеющие место при рН 5,0, связанные с хлорированием положительно заряженного лизина C1"NH34-CH2- (1503 см"1), хлорированием алифатических цепей (С1-СН2-) нейтральных аминокислот аланина, валина, лейцина, изолейцина, треонина (1088 см"1), возникновением -O-S- связей между остатками серина и цистеина (966 см"1), с появлением дисульфидных -S-S- сшивок между цистеинами (720 см"1), со связью амидных групп аспарагина и глутамина с алифатическими аминокислотами валином, лейцином в виде -OC-NH2+-CH2-CHCH3- (2468 см 1, 2542 см"1) и изолейцином в виде -OC-NH2+-CH2-CH2- (2594 см"1), со связыванием изолейцина с серином через кислород -СН2-СН2-0-СН2- (2792 см"1), с -S-N- связью между цистеином и амидной группой аспарагина, глутамина (1420 см"1). При рН 4,0 при добавлении CsCl пропадают пики, аналогичные соответствующим пикам при рН 5,0 буферного раствора. По сравнению с изоэлектрическим рН (5,0) на рН 4,0 в связывании молекул альбумина уже не участвуют отрицательно заряженные аминокислоты (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), а также в агрегации не участвуют аминокислоты, содержащие ароматические кольца (фенилаланин, тирозин, триптофан).
. Изучение тепловой денатурации сывороточного альбумина при различных значениях рН буферных растворов методом динамического рассеяния света
В данном параграфе представлены результаты исследований с помощью метода лазерной корреляционной спектроскопии квазиупруго рассеянного света размеров, формы компонентов (а именно, липопротеинов низкой плотности) сыворотки крови животных и влияния на них ишемического воздействия. В ходе выполнения работы были зарегистрированы отличия в сыворотке крови животных, подвергшихся ишемии головного мозга, по сравнению с сывороткой контрольной группы здоровых животных.
Сыворотка крови представляет собой гетерогенный раствор жидкой части крови без форменных элементов и фибриногена. Многокомпонентный состав сыворотки крови включает в себя альбумины, глобулины (гликопротеины, иммуноглобулины, липопротеины), а также низкомолекулярные соединения электролитов. Метод лазерной корреляционной спектроскопии позволяет определить субфракционный состав сыворотки и выявить дифференциально-значимые сдвиги при ряде заболеваний, в частности при ишемических повреждениях органов (например, при ишемии головного мозга). Многокомпонентный спектр сыворотки, реализуемый в виде гистограммы (по оси абсцисс откладывается диаметр рассеивающих частиц, по оси ординат - их процентный вклад в общее светорассеяние), разбивается на значимые зоны: частицы размером от 70 нм до 150 нм и выше играют роль при аллергических и аутоиммунных реакциях; ингредиенты 20-70 нм значимы при сердечно-сосудистых заболеваниях (в частности, при ишемических или атеросклеротических повреждениях); частицы размером 10-20 нм проявляют себя при интоксикационных процессах; компоненты диаметром до 10 нм значимы при онкологической поражениях.
При исследовании влияния ишемии головного мозга на сыворотку крови крыс были обнаружены изменения в зоне ингредиентов диаметром 20-70 нм, значимых при ишемических и атеросклеротических поражениях. Частицы этого размера представляют собой промежуточные интермедиаты -липопротеиновые комплексы, а точнее липопротеины низкой плотности (ЛПНП), тонко реагирующие на ишемические и атеросклеротические заболевания.
С помощью метода динамического рассеяния света зарегистрированы отличия гидродинамических радиусов ЛПНП контрольной (здоровой) сыворотки крови и ишемическои сыворотки для различных значений рН буферного раствора разведения сыворотки, представленные на рис.24. Размер ЛПНП сыворотки животных после ишемии головного мозга больше размера ЛПНП здоровой сыворотки примерно на 20-30%, например, при физиологическом значении рН (7,4) радиус ишемических ЛПНП превосходит радиус здоровых ЛПНП на 22%. Изменение радиуса ЛПНП внутри каждой из групп (здоровой и ишемическои) в зависимости от рН объясняется изменением поверхностного заряда апобелка ЛПНП (с увеличением рН апобелок становится всё более отрицательно заряженным) и, как следствие, всё большим отталкиванием апобелка от отрицательно заряженного фосфолипидного слоя ЛПНП при больших значениях рН. По этой причине и происходит увеличение радиуса ЛПНП в рамках каждой группы при увеличении рН раствора.
Согласно литературным данным [5], здоровые ЛПНП представляют собой сферические частицы. Для определения формы ЛПНП (рис.25) диффузного уширения Г спектра рассеянного света от квадрата синуса половины угла рассеяния sin (6У2) для различных рН буферного раствора разведения сыворотки крови животных, перенёсших ишемию. ишемической сыворотки при разных значениях рН были проведены измерения автокорреляционных функций рассеянного исследуемыми системами света при различных углах рассеяния в, по измеренным автокорреляционным функциям было определено диффузное уширение спектра рассеянного света для каждого значения рН. Были получены зависимости диффузного уширения Г от квадрата синуса половины угла рассеяния sin2( 2) для различных рН буферного раствора разведения ишемической сыворотки (рис.25). В случае сферической формы рассеивающих частиц зависимость Г от sin (6У2) будет линейной. Если же форма рассеивателей не является сферической, то зависимость Г от sin (6У2) будет отлична от линейной. Диффузное уширение спектра рассеянного света, полученное экспериментально, для ЛПНП ишемической сыворотки линейно зависит от квадрата синуса половины угла рассеяния, что говорит о сферической форме ЛПНП ишемической сыворотки крови. Следовательно, несмотря на увеличение радиуса ЛПНП вследствие ишемии их форма остается сферической. Как видно из рис.25, диффузное уширение Г спектра рассеянного света имеет большее значение при меньших значениях рН буферного раствора разведения ишемической сыворотки, а при увеличении рН раствора диффузное уширение уменьшается. Что говорит о том, что при увеличении рН буферного раствора гидродинамический радиус ЛПНП возрастает, это связано с изменением поверхностного заряда апобелка ЛПНП (апобелок при увеличении рН становится всё более отрицательным) и, как следствие, с всё большим отталкиванием апобелка от отрицательно заряженного фосфолипидного слоя ЛПНП.
