Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Исследование интегральных параметров оптического излучения взаимодействовавшего с голографическими дифракционными микроструктурами 28
1.1 Метод Кирхгоффа с учетом фазы волнового фронта светового излучения 28
1.1.1 Регистрация параметров лазерного луча 28
1.1.2 Моделирование распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа 37
1.1.2.1 Выбор шага дискретизации при численном описании лазерных полей методом Кирхгофа 37
1.1.2.2 Результаты моделирование распространения лазерного пучка методом Кирхгоффа 42
1.2 Метод оптической томографии 47
1.2.1 Регистрация мощности излучения 47
1.2.2 Получение томографических проекций 50
1.2.3 Реконструкция распределения интенсивности 52
Глава 2 Методы и установки для исследования интегральных параметров голографических дифракционных структур 58
2.1 Интегральные параметры голографических дифракционных структур и их связь с параметрами микроструктуры 58
2.2 Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования параметров оптических голографических дифракционных структур 66
2.2.1 Установка для регистрации параметров оптических голографических дифракционных структур 66
2.2.2 Программное обеспечение для расчета параметров схемы записи оптических голографических дифракционных структур 70
2.2.3 Результаты исследований голограмм 74
2.2.4 Программное обеспечение подготовки данных для формирования оптических голографических дифракционных микроструктур 77
2.3 Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования интегральных параметров голографических дифракционных структур 80
2.3.1 Установка для регистрации интегральных параметров голографических дифракционных структур 80
2.3.2 Программное обеспечение для автоматизации регистрации и оценки интегральных параметров ГДС 80
Глава 3 Методы и установки для исследования локальных параметров голографических дифракционных структур 85
3.1 Классификация голографических дифракционных микроструктур по методу формирования мастер-голограмм 86
3.2 Установка и программное обеспечение для определения типа голографических дифракционных структур 92
3.2.1 Установка для определения типа голографических дифракционных элементов 92
3.2.1.1 Описание микроскопа 92
3.2.1.2 Метод повышения контраста изображения путем регистрации дифрагировавшего излучения 96
3.2.2 Программное обеспечение для определения типа голографических дифракционных структур 98
3.3 Установка и программное обеспечение для исследования локальных параметров голографических дифракционных структур 101
3.3.1 Установка для исследования локальных параметров голографических дифракционных структур 101
3.3.2 Программное обеспечение для расчета локальных параметров голографических дифракционных структур 104
3.4. Исследование локальных параметров голографических дифракционных структур 105
3.4.1 Топографические дифракционные структуры, изготовленные методом точечно-матричной голографии 105
3.4.2 Исследование локальных параметров голографических дифракционных структур, синтезированных с помощью Э ЛЛ-установок 108
Глава 4 Исследование локальных и интегральных параметров трехмерных дифракционных структур биологического происхождения 114
4.1 Устройство и принцип действия автоматизированного флуоресцентно интерференционного микроскопа 115
4.2 Методы для анализа транспорта флуорофора в живой клетке 120
4.2.1 Корреляционный анализ 120
4.2.2 Метод поиска максимумов 123
4.2.3 Программный комплекс «Корреляция» 124
4.2.4.Экспериментальное исследование локализации флуорофора в живой клетке 127
4.3 Метод и программное обеспечение для определения концентрации флуорофоров в клетке 136
4.3.1 Метод для определения концентрации флуорофоров в клетке 136
4.3.2 Программное обеспечение для определения концентрации флуорофоров в клетке 139
4.3.3 Экспериментальное определение количества вещества флуорофора 140
4.4 Метод спектротомографии 144
Заключение 147
Список использованных источников 149
- Моделирование распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа
- Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования параметров оптических голографических дифракционных структур
- Установка и программное обеспечение для определения типа голографических дифракционных структур
- Методы для анализа транспорта флуорофора в живой клетке
Введение к работе
В данной диссертации разрабатываются оптические методы исследования локальных и интегральных параметров голографических дифракционных микроструктур.
Голографические дифракционные микроструктуры - это элементы, основанные на способности света изменять свои свойства при взаимодействии с мелко структурированной поверхностью, которая формируется с использованием принципов голографии. Данный эффект базируется на дифракции света на элементах структуры ГДС соизмеримых с длиной волны света и последующей интерференции дифрагировавших световых полей.
До развития голографии перечень оптических элементов, действие которых основано на явлении дифракции, ограничивался дифракционными решетками и зонными пластинками. Положение изменилось с появлением голографии.
Первая голограмма была получена в 1947 году Д. Табором в ходе экспериментов по повышению разрешающей способности электронного микроскопа. Он же придумал само слово " голография", которым он подчеркнул полную запись оптических свойств объекта.. К сожалению, его голограммы отличались низким качеством. Получить качественную голограмму без когерентного источника света невозможно [1]. Д. Габор в 1971 г. за изобретение голографии был удостоен Нобелевской премии.
После создания в 1960 году красных рубинового (длина волны 694 нм, работает в импульсном режиме) и гелий-неонового (длина волны 633 нм, работает непрерывно) лазеров, голография начала интенсивно развиваться.
В 1962 году была создана классическая схема записи голограмм Э.Лейта и Ю. Упатниекса из Мичиганского Технологического Института (голограммы Лейта-Упатниекса) [2,3] , в которой записываются пропускающие голограммы (при восстановлении голограммы свет
8 пропускают через фотопластинку, хотя на практике некоторая часть света от неё отражается и также создаёт изображение, видимое с противоположной стороны). Предложенный метод осуществлял запись голограмм в тонкослойной фотографической среде. Такого рода голограммы восстанавливают трехмерное изображение только в лазерном свете. Поэтому данный метод в технологии получения защитных элементов используется-только на подготовительном этапе для записи мастер голограмм.
В 1967 году рубиновым лазером был записан первый голографический портрет.
В результате длительной работы в 1968 году Ю. Н. Денисюк получил высококачественные (до этого времени отсутствие необходимых фотоматериалов мешало получению высокого качества) голограммы, которые восстанавливали изображение, отражая белый свет. Для этого им была разработана своя собственная схема записи голограмм. Эта схема называется схемой Денисюка, а полученные1 с её помощью голограммы называются голограммами Денисюка. Метод Ю.Н. Денисюка основан на формировании дифракционной структуры в толстослойной фотографической эмульсии и позволяет наблюдать объемное изображение в белом свете. Этот метод используется в настоящее время для защиты документов при записи и тиражировании голограмм на фотополимерных носителях (пленках) [4]. Ю.Н. Денисюку за предложенный метод записи голограмм и последующие работы в области голографии в 1971 г. присуждена Ленинская премия.
В 1977 году Ллойд Кросс создал так называемую мультиплексную голограмму. Она принципиально отличается от всех остальных голограмм тем, что состоит из множества (от десятков до сотен) отдельных плоских ракурсов, видимых под разными углами. Такая голограмма, естественно, не содержит полную информацию об объекте, кроме того, она, как правило, не имеет вертикального параллакса (т.е. нельзя посмотреть на объект сверху и снизу), но зато размеры записываемого объекта не ограничены длиной когерентности лазера (которая редко превышает несколько метров, а чаще
9 всего составляет всего несколько десятков сантиметров) и размерами фотопластинки. Мало того, можно создать мультиплексную голограмму объекта, которого вовсе не существует. Например, нарисовав выдуманный, объект с множества различных ракурсов. Мультиплексная голография превосходит по качеству все остальные способы создания объёмных изображений на основе отдельных ракурсов1 (например, линзовые растры), однако она всё равно далека от традиционных методов голографии по реалистичности.
Наиболее широкое распространение при изготовлении1 голографических защитных элементов получила, одна из разновидностей голографии Лейта, т.н. «радужная» голография, которая была изобретена Бентоном [5] в 1976г. Метод, предложенный позволяет создавать голограммы, восстанавливаемые белым светом и, что не менее важно, эти голограммы могут быть легко механически размножены в любых требуемых количествах.Именно такие голограммы оказались пригодными для массового тиражирования путем тиснения на гибкую основу, сохраняя- при этом способность, формировать объемное трехмерное изображение при освещении белым светом.
Голография в России в 1970-х г.г.представляла собой новую науку и базы для ее развития практически не существовало.
В 1966 году во ВНИИОФИ была образована лаборатория голографии и когерентной оптики. Начальником лаборатории была назначена кандидат технических наук (с 1970 года доктор технических наук) Вера Моисеевна Гинзбург. В лаборатории были разработаны первые в стране универсальные серийные голографические установки - УИГ-1, предназначенные для исследований в области голографии с импульсными лазерами — мощный одномодовый рубиновый лазер с двумя каскадами усиления и оптической скамьей для крепления держателей оптических элементов, и УИГ-2, предназначенная для исследований в области голографии с лазерами непрерывного режима работы. Эти установки выпускались серийно до 1990
10 года и благодаря им развивалась голография в СССР, причем не только в крупных НИИ или на предприятиях, но и в учебных заведениях.
Под руководством В.М.Гинзбург начались исследования и в области неоптической голографии: в диапазоне СВЧ, в ультразвуковом излучении, исследования в цифровой голографии и в обработке результатов голографических измерений [6,7]. Результаты первых исследований и разработок вошли в монографию «Голография. Методы и аппаратура», выпущенную издательством Советское Радио в 1972 году [8] и ставшую настольной книгой всех, кто развивал в эти годы отечественную голографию.
Голографический метод изготовления оптических элементов и в настоящее время является весьма актуальным. К его достоинствам можно отнести, в частности, возможность изготовления оптических элементов, предназначенных для работы в пределах всего видимого диапазона, тиражирование прецизионных, в том числе и крупногабаритных, реальных объектов (физически существующих), возможность получения сложных оптических элементов за счет последовательного копирования отдельных составляющих на один и тот же участок регистрирующей среды и т.д. [9-11]
Голография изобретена не только как явление, не только как метод создания объемных изображений, но и как метод расчета полей, положивший начало цифровой голографии, о чем будет сказано ниже.
Голограммы, голографические дифракционные структуры, дифракционные оптические элементы находят широкое применение в различных областях науки и техники. Голографические (или голограммные) оптические элементы представляют собой голограммы, на которых записаны волновые фронты специальной формы. Голографические оптические элементы можно сконструировать для преобразования любого входного волнового фронта в любой другой выходной фронт независимо от параметров материала подложки, например, от кривизны или показателя преломления. С их помощью возможна коррекция аберрации оптических систем, в таком случае ГОЭ выступают как
составные элементы сложных оптических приборов. ГОЭ используют и как самостоятельные оптические элементы в качестве линз, зеркал, дифракционных решеток, мультипликаторов и др. [12].
Способность голограмм Фурье хранить информацию успешно
реализуется в голографических запоминающих устройствах [13]. При
построении последних стандартным стало использование принципа
страничной записи информации в виде матрицы голограмм с их адресацией
лучом лазера. Преимущества оптической памяти состоят в большой
емкости (и, соответственно, высокой плотности хранения
информации) и высоком быстродействии, возможности параллельной-обработки информации, высокой надежности хранения, быстром доступе к массивам информации, отсутствии энергопотребления в статическом состоянии, а главное - большой помехоустойчивости голограмм. Все ГЗУ можно разделить на следующие основные типы: оперативные ГЗУ (на двумерных голограммах и трехмерных с трехкоординатной адресацией); массовые ГЗУ; - ГЗУ постоянного типа; - архивные ГЗУ. [14, 15].
Кроме этого голограммы, топографические дифракционные структуры используются для анализа формы радиосигналов[16-20], измерения формы поверхности различных изделий [21], коррекции аберраций оптических систем [20-23], создания различных оптических элементов [25-27] и систем связи [28], измерений параметров быстропротекающих процессов[29,30], в гидроакустике и гидрофизике [31].
Также голографические дифракционные структуры различных типов используются для маркировки документов и товаров с целью защиты от подделки.
Наиболее широкое распространение при изготовлении голографических защитных элементов получила одна из разновидностей голографии Лейта, «радужная» голография, которая была изобретена Бентоном [32] в 1976г. Именно такие голограммы оказались пригодными для массового тиражирования путем тиснения на гибкую основу, сохраняя при
12 этом способность, формировать объемное трехмерное изображение при освещении белым светом.
Другой вид голографии, который нашел широкое применение при изготовлении оптических защитных элементов - цифровая голография [33], основанный на моделировании голографического процесса на ЭВМ. Цифровой синтез голограмм имеет ряд важных применений при создании дифракционных оптических элементов нового типа: мультипликаторы, сканаторы, с произвольным законом сканирования, фокусаторы и т.д. Разработка алгоритмов синтеза на ЭВМ голографических элементов, обладающих свойствами радужных и объемных голограмм, а также оригинальных дифракционных структур с визуальными эффектами выдвинула данный метод, как один из основных при создании оптических защитных меток.
Имеется ряд веских оснований для такого синтеза- голограмм и, в частности, то обстоятельство, что геометрические размеры голографического объекта в этом случае не ограничиваются такими факторами, как когерентность освещения, вибрация или турбулентность воздуха, и появляется возможность исследовать путем моделирования некоторые голографические эффекты.
Еще более существенным моментом, стимулирующим синтез голограмм с помощью компьютеров, является возможность создать оптический волновой фронт для такого объекта, который физически не существует. Потребность в формировании волнового фронта, соответствующего объекту, определяемому расчетным путем, возникает в любом случае, когда требуется визуально отобразить в трех измерениях результаты того или иного трехмерного исследования, например, при моделировании разрабатываемых конструкций. Иногда волновой фронт от синтезированной голограммы может служить интерференционным эталоном для контроля сложной оптической поверхности в процессе ее обработки. Другая область применения таких голограмм связана с экспериментами по
13 пространственной фильтрации. В некоторых случаях изготовить фильтр с заданной функцией оптическими методами бывает затруднительно, в то же время компьютер решает подобные задачи сравнительно легко [34].
Для изготовления и тиражирования используются методы, аналогичные тем, что используются при производстве печатных плат в микроэлектронике.
Каждый микроскопический участок поверхности голограммы представляет собой дифракционную решетку в виде чередования светлых и темных полос. Эта совокупность может быть получена не только путем съемки реального объекта, но и путем синтеза из отдельных элементов. Под цифровыми методами синтеза (записи) голограмм обычно понимают такие методы записи, при которых голограмма записывается из отдельных элементов по предварительно заданной программе [35]. Цифровая голограмма может состоять как из отдельных элементарных голограмм, так и из отдельных элементов (штрихов) [36,37].
Синтез голограммного изображения осуществляется путем решения задачи, каково должно быть чередование полос для того, чтобы при его восстановлении получить требуемое изображение. Современное программное обеспечение позволяет рассчитать дифракционную структуру, при восстановлении которой может быть получено даже трехмерное изображение объекта.
В настоящее время наиболее распространены следующие технологии записи оригиналов голограмм: электронно-лучевая и точечно-матричная.
Электронно-лучевая технология основана на создании микрорельефа с заданными параметрами при помощи электронного луча, который можно сфокусировать в пятно размером несколько нанометров. Расчет параметров микрорельефа представляет собой решение обратной задачи синтеза изображения в оптическом диапазоне, что делает технологию чисто цифровой. Этот метод занимает особое место среди технологий записи по целому ряду причин:
- разрешающая способность электронно-лучевой технологии на два
порядка величины превышает возможности оптических систем записи;
- на стадии изготовления оригинала голограммы в неё можно
включить микротексты размером вплоть до нескольких микрон, элементы
высокого разрешения и другие признаки, недоступные оптическим методам
записи;
- оборудование для электронно-лучевой литографии является
высокотехнологичным и дорогостоящим, требующим значительных
интеллектуальных вложений.
Точечно-матричная технология базируется на аналоговой записи микроэлемента изображения (пикселя). При этом растровое изображение голограммы в целом, состоящее из миллионов пикселей, формируется компьютером. Такой метод записи является одновременно и аналоговым, и цифровым. Его также отличает относительная доступность и распространенность.
Широкое использование голографических дифракционных структур привело к необходимости разработки методов регистрации их параметров, в том числе характеризующих микроструктуру. Среди них важное место занимают оптические методы исследования, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с не оптическими, например, зондовыми методами. Этими преимуществами являются неразрушающее воздействие оптического излучения на исследуемый объект, возможность проникновения оптического излучения внутрь исследуемого объекта, а также возможность исследовать с помощью оптического излучения физико-химические свойства материала объекта. Поэтому в организациях, связанных с изготовлением голограмм или экспертизой их подлинности используется такое оптическое оборудование как спектрометры, гониометры, лазеры а также оптические микроскопы различных типов[38-41,6].
В то же время, применение оптических методов для исследований субмикронных объектов, к которым относятся голографические
15 дифракционные структуры, связано с рядом трудностей, обусловленных тем, что длина волны оптического излучения видимого диапазона близка к характерным размерам таких структур. В ряде случаев это не позволяет с требуемой точностью определять локальные параметры субмикронных объектов.
Кроме того, исследования массивов оптических микроструктур, к которым относятся дифракционные оптические элементы и голограммы, показало, что полное описание их оптических свойств не может быть получено на основе данных об их локальных параметрах. Поэтому для, совершенствования технологии расчета, синтеза и контроля качества таких объектов, необходима разработка методов, позволяющих определять микрохарактеристики их структуры по результатам измерений интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения.
Широкое распространение голографических дифракционных структур, используемых для защиты документов и ценных бумаг требует разработки соответствующей нормативной базы, поскольку не существует ГОСТов, определяющих требования к голографическим дифракционным структурам. В начале 80-х годов XX века была начата разработка проекта ГОСТа «Голографические измерения. Термины и определения», но она не была закончена. В настоящее время в России нормативы на защитные голограммы ограничиваются руководящими документами государственных лицензирующих органов. Данные документы классифицируют голограммы по ряду параметров, заявляемых изготовителем, но не предполагают контроль этих параметров. Тем более в этих документах не указаны методики анализа и их аппаратурное обеспечение.
Разработка методов и аппаратуры, которые позволили бы регистрировать и рассчитывать параметры, характеризующие визуальные свойства голографических дифракционных структур, как на стадии производства, так и при экспертизе подлинности, представляется весьма актуальной.
Оптические методы исследования микрообъектов применяются с момента изобретения микроскопа А. Левенгуком. Создание теории микроизображений Э. Аббе, казалось бы, установило границу применимости оптических методов для исследования микрообъектов. Чтобы преодолеть этот предел и повысить разрешение при исследовании микрообъектов стали использоваться методы, основанные на иных физических принципах [42-44]. Появились электронные микроскопы и сканирующие зондовые микроскопы, обладающие пространственным разрешением близким к размерам атома.
Оптические методы обладают уникальными видами контраста, такими как поляризационный и фазовый контраст, что позволяет исследовать физико-химические свойства микрообъектов, а также они незаменимы при исследовании микроструктур, применяемых в качестве составных элементов оптических систем.
Развитие методов современной оптики, вызванное практическими потребностями, позволило существенно превзойти теоретический предел разрешения, рассчитанный Э. Аббе для традиционных оптических систем. Современные оптические микроскопы, основанные на новых физических принципах, позволяют превзойти теоретический предел разрешения Аббе. К ним относятся интерференционные, конфокальные, многофотонные, ближнепольные оптические микроскопы [45,46]. В ближайшем будущем ожидается появление микроскопа со сверхразрешением, основанного на применении суперлинз, изготовленных из оптических метаматериалов с отрицательным показателем преломления.
Кроме использования новых физических принципов для повышения разрешения оптических систем, а также для «извлечения» дополнительной информации об объекте исследования используются различные методы обработки оптической информации. Ряд методов основан на исследовании распределения не только интенсивности оптического изображения, но и его фазы (интерференционные методы) [47,48]. Другие методы основаны на решении обратной задачи распространения оптического излучения на основе
17 результатов интегральных измерений. К ним относится оптическая томография, позволяющая вычислять локальные характеристики. по результатам интегральных измерений. Также широко применяется дифрактометрия, которая позволяет по анализу дифракционной картины вычислить локальные характеристики [48-59].
Развиваются методы, основанные на обработке результатов дистанционных измерений (обратные задачи распространения), методы, основанные на сопоставлении результатов измерений различных оптических контрастов.
Одним из передовых направлений современной науки и техники-
являются нанотехнологии, основанные на широком внедрение
і нанострукутрированных материалов. Развитие и внедрение нанотехнологии
неотъемлемо от развития методов измерении, основанных на электронной и
f зондовой микроскопии. Однако в ряде случаев возникает необходимость
использовать оптические методы измерений. Применение оптических
і методов необходимо в нанобиотехнологиях, а также при исследовании'
і1 свойств оптических элементов, созданных на основе нанострукутрированных
материалов.
Несмотря на изобретение и развитие большого количества новых
в методов исследования свойств микрообъектов, оптические методы
* исследования обладают большими преимуществами и продолжают
| развиваться. Развитие этих методов связано не только с внедрением новых
s физических принципов регистрации оптических сигналов, но и с развитием
) методов обработки результатов оптических измерений. К ним относятся
5 методы обработки интегральных измерений (томография), методы,
основанные на решении обратных задач (в том числе дифрактометрия),
I методы, основанные на сопоставлении различных видов оптических
контрастов [60-68].
\ Ряд практических задач может быть решен только с помощью
і разработки новых методов получения и обработки результатов оптических
'\
г (
18 измерений. К ним относится разработка методов исследования характеристик микроструктур и микрообъектов путем регистрации и обработки локальных и интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения.
Голографические дифракционные структуры бывают амплитудными и фазовыми, например, голограммы, выполненные на оптически прозрачных материалах, представляют собой рельефно-фазовые структуры. Поэтому методы исследования* для голографических дифракционных структур могут применяться-и для исследования живых клеток.
Существующие в настоящее время методы исследования живых клеток позволяют наблюдать контуры объектов исследования, изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ, судить о молекулярной- организации его структуры. Актуальным направлением» развития инструментария современной цитологии является расширение-числа количественно- измеряемых физических параметров живой клетки. Существующие приборы, позволяющие измерять несколько физических параметров внутри живой клетки, не позволяют полностью и достоверно изучать динамику внутриклеточных процессов. В микроскопии не решена задача сопоставления контрастов для биообъектов. А именно фазового и яркостного. Это позволило бы изучать динамику внутриклеточных процессов, в частности транспорт и воздействие лекарственных препаратов на органеллы живой клетки.
Живая клетка, с точки зрения оптики, представляет собой трехмерное распределение вещества с переменной плотностью, окруженное достаточно плотной оболочкой. Известно, что в видимой области спектра живые одиночные клетки практически не поглощают излучения: Основной физической величиной, определяющей прохождение оптического излучения через клетку, является показатель преломления, значения которого изменяются внутри клетки в существенных пределах. Так как в таких объектах изменяется только фаза света, то они получили название фазовых
19 объектов.
Для исследования живых клеток, также как и для голографических дифракционных структур применяются оптические методы исследования, которые обладают свойством «неразрушающего проникновения», что особенно важно для живых биологических структур [69, 70].
Для исследования оптико-физических параметров ГДС и объектов со схожими свойствами, необходимо определять локальные и интегральные параметры оптического излучения после взаимодействия с микроструктурой поверхности объекта и отраженного от нее.
В 70-ые 80-ые годы в СССР была создана система стандартов для измерения параметров лазерного излучения. Эти стандарты были подкреплены соответствующей измерительной аппаратурой, методиками и эталонами. Например, ГОСТ 24453 - 80 "Измерение параметров и характеристик лазерного излучения" (термины, определения и буквенные обозначения величин). Данный ГОСТ описывает большое число параметров лазерного излучения. Существует несколько ГОСТов, устанавливающих методику измерения значительно- меньшего числа параметров лазерного излучения, чем описано в ГОСТе 24453-80. Например, ГОСТ 25918 - 83 "Методы измерения нестабильности частоты излучения лазеров непрерывного режима работы", ГОСТ 26086-84 "Методы измерения диаметра пучка и энергетической расходимости лазерного излучения", ГОСТ 25917-83 "Методы измерения относительного распределения плотности энергии (мощности) излучения".
Заметим, что ГОСТы, описывающие средства измерений, а также Государственные эталоны, имеются для энергии и мощности непрерывного и импульсного лазерного излучения (ГОСТ 8.275-94). Это связано с тем, что указанные параметры лазерного излучения считались важнейшими для большинства лазеров, применяемых в промышленности, медицине и т.д.
В конце 80-х годов в мировой лазерной науке возникло понимание того, что энергетических параметров явно недостаточно для описания
20 лазерного пучка. На первый план вышла необходимость определять характеристики, отвечающие за качество лазерного пучка и особенности его распространения. Это связано с возрастающими требованиями к лазерам, применяемым в системах связи, информационных системах, медицине, приборостроении, а также с широким внедрением новых типов лазеров, таких как полупроводниковые, эксимерные и т.д.
Например, точность определения размеров и координат фокусного пятна лазера является важнейшим параметром, влияющим на плотность записи информации на оптических носителях, разрешение оптических лазерных приборов, точность изготовления изделий с помощью технологических лазеров и т.д.
В ходе работ по проекту CHOCLAB, которые начались в 1992 году, были разработаны, предварительные стандарты, определяющие требования как к широко*применяемым, так и к новым параметрам лазерного излучения и методам их измерения. К таким новым характеристикам лазерного пучка относятся в первую очередь те, которые определяются проектами стандартов ИСО 11146 - Диаметр пучка, угол расходимости и фактор распространения и ИСО 15367 - Распределение фазы.
При работе с лазерными пучками часто требуется иметь информацию о распределении интенсивности в их поперечном сечении. В частности, это необходимо для исследования структуры поперечных мод излучения лазера. В ряде случаев желательно измерять это распределение в поперечном сечении относительно мощного лазерного пучка, практически не ослабляя, или слабо искажая сам пучок. Попытки решить эту проблему тем или иным способом предпринимаются вплоть до настоящего времени [71-76].
Особый интерес представляют такие исследования при работе с мощными технологическими лазерами, когда бывает невозможно поместить на пути лазерного луча какой-либо регистратор или ответвитель, поскольку это приводит к его быстрому разрушению под воздействием высокоинтесивного лазерного излучения. Одним из методов решения данной
21 проблемы является введение в лазерный пучок на короткое время объектов, обладающих высокой лучевой стойкостью и играющих роль ответвителей лазерного излучения [77,78]. Так в работе [77] было предложено быстро перемещать перпендикулярно оси пучка тонкую тугоплавкую проволоку -спицу, закрепленную на вращающемся диске, и по зеркальному отражению от нее с помощью пироэлектрического детектора регистрировать мощность излучения в локальных точках лазерного пятна.
Недостатками существующих методов регистрации распределения мощности излучения являются большие габариты системы регистрации, что не всегда позволяет регистрировать мощность излучения в труднодоступных ограниченных местах. Предложенный в работе метод регистрации интенсивности в сечении лазерных пучков может быть использован для создания дистанционного малогабаритного датчика параметров пучков мощных технологических лазеров.
Таким образом, задача разработки оптических методов исследования распределения локальных и интегральных оптико-физических параметров голографических дифракционных структур и других объектов, похожих на них, решаемая в данной диссертационной работе, представляется весьма актуальной.
22 Цель работы
Целью диссертационной работы является разработка методов, установок и программного обеспечения, предназначенных для исследования оптических свойств ГДС на основе анализа их микроструктуры и интегральных параметров взаимодействовавшего с ними оптического излучения, а также распространение разработанных методов на исследование трехмерных субмикронных структур биологического происхождения.
Основные задачи исследования
Разработка математической модели взаимодействия оптического излучения с ГДС, проведение математического моделирования процесса его распространения и установление связи между его интегральными и локальными параметрами.
Определение характеристик, описывающих оптические свойства голографических дифракционных структур, и установление их связи с параметрами их микроструктуры и параметрами взаимодействовавшего * с ГДС оптического излучения.
3. Разработка методов и создание аппаратуры для получения
изображений микроструктуры ГДС и регистрации интегральных и локальных
оптических параметров ГДС.
4. Разработка методов расчета параметров ГДС по изображениям их
микроструктуры и создание программного обеспечения для автоматизации
процессов регистрации и обработки изображений микроструктуры.
5. Разработка методов расчета параметров ГДС по полученным
интегральным и локальным характеристикам взаимодействовавшего с ГДС
оптического излучения, включающая в себя математическое моделирование
и создание программного обеспечения для автоматизации процесса
регистрации данных, обработки изображений и проведения расчетов.
23 6. Разработка методов и создание аппаратуры для. получения изображений живых клеток с различными типами контраста и создание программного обеспечения для расчета распределения параметров внутри биологических объектов путем совместной обработки полученных изображений.
Научная новизна
Впервые была разработана совокупность оригинальных методов и-средств для регистрации и обработки изображений ГДС и биологических объектов - живых клеток, а также для расчета их параметров по полученным изображениям.
К основным результатам относятся:
Критерий выбора шага дискретизации для математической модели распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа с учетом распределения фазы волнового фронта лазерного излучения вдоль оси распространения.
Метод измерения распределения мощности в сечении лазерного пучка путем томографической реконструкции по одномерным проекциям, полученным в результате поперечного сканирования пучка интегрирующим приемником излучения - оптическим световодом.
Автоматизированная установка, которая позволяет проводить количественное измерение совокупности параметров ГДС характеризующих их визуальное качество.
Установка для регистрации и расчета одновременно 3-х и более оптических параметров ГДС в автоматическом режиме.
Метод повышения контраста изображений микроструктуры ГДС с прозрачным защитным слоем за счет одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения.
Экспериментальный образец флуоресцентно-
24 интерференционного микроскопа; позволяющий получать изображения биологического объекта - живой* клетки с малым временем регистрации-и с различными видами контраста, в том числе с фазовым и флуоресцентным, без перемещения исследуемого биологического объекта.
Практическая значимость
1. Предложенный томографический метод измерения интенсивности
в сечении лазерных пучков при помощи сканирования оптическим
световодом, может быть использован; для создания дистанционного
малогабаритного датчика параметров.: пучков мощных технологических
лазеров.
Полученные в ходе диссертационной работы результаты: использовались в научно-исследовательской работе по совершенствованию методов измерения параметров пучков (шифр «Фокус»), проводившейся во ФГУП ВНИИОФИ в 2004-2006 гг.
2. Разработанная автоматизированная установка, моделирующая
восприятие изображения ГДС экспертом — наблюдателем, позволяет
проводить автоматизированную идентификацию ГДС по визуальным
параметрам, создавать базы данных визуальных параметров различных ГДС,
осуществлять контроль качества и износостойкости ГДС, а так же является
аппаратурным обеспечением для разработки стандартов качества ГДС.
Принципы построения данной автоматизированной установки использовались в ходе исследований системных вопросов проектирования аппаратуры для; обеспечения контроля визуального качества голограмм в НИИ «Гознак» - Филиал ФГУП «Гознак».
3; Разработанная автоматизированная установка для измерения параметров оптических ГДС может использоваться при исследовании оптических свойств и конструировании широкого круга оптических элементов, основанных на ГДС. В фирме «Крипто-Принт» проводились
25 исследования защитных меток типа Фурье-голограмм, что позволило усовершенствовать метод синтеза микроструктуры меток данного типа и привело к повышению их оптических характеристик.
Предложенный в работе метод повышения контраста изображения микрообъектов путем применения одноракурсного наклонного освещения белым светом и регистрации дифрагировавшего излучения позволяет расширить возможности современных металлографических микроскопов.
Флуоресцентно-интерференционный микроскоп позволяет получать изображения живой клетки с различными видами контраста и малым временем регистрации, что даст возможность изучать динамику внутриклеточных процессов, в частности транспорт и воздействие лекарственных препаратов на органеллы клетки.
При помощи флуоресцентно-интерференционного микроскопа были исследованы легочные макрофаги, инфицированные палочкой Коха. Исследования проводились в НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И..М. Сеченова, в Институте Ревматологии РАМН.
Апробация работы
Основные результаты и положения данной диссертационной работы докладывались на следующих семинарах:
Международной конференции «Оптическая диагностика живых клеток» (Сан-Хосе, США,2001);
XV Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2005);
Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика» (Москва, 2006);
XVI Научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение» (Москва, 2007).
26 Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 3 работы опубликованы в научных журналах и тематических сборниках.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы.
Структура диссертационной работы отражает цели и решения поставленных задач.
Общий объем составляет 158 страниц, включая 13 таблиц и 72 рисунка и список использованных источников из 107 наименований.
Основные положения, выносимые на защиту
І.При численном моделировании дифракции оптического излучения на голографических дифракционных структурах шаг дискретизации пространственного распределения определяется из соотношения:
= D2 Итга L-Л'
где D - поперечный размер волнового фронта,
Я - длина волны излучения,
L - расстояние от выходной апертуры излучателя до исследуемого сечения.
2.Мощность излучения, выходящего с торца световода, введенного в исследуемый пучок, перпендикулярно его оси, описывается интегралом Радона от искомого распределения интенсивности в сечении пучка.
27 3.Совместная обработка угловых и спектральных характеристик изображений, создаваемых оптическими голограммами, позволяет полностью определить параметры схемы записи таких голограмм.
4.Коэффициент корреляции между фазовым и флуоресцентным изображениями живой клетки позволяет определить распределение концентрации флуорофора в живой клетке.
Моделирование распространения лазерного пучка по методу Кирхгофа
Для описания лазерных пучков широко используются приближенные методы решения уравнений для электромагнитных полей в свободном пространстве с соответствующими граничными условиями [79,80]: Одним? из таких методов является метод Кирхгофа; который описывает решение скалярного уравнения Гельмгольца для поля в точке M(x,y,z) зашлоскостью экрана с отверстием, на который-падает квазиплоская волна. Электрическое поле прошедшей волны при кг» 1 можно представить в виде к . (( пП Е{х0,у0) 2ж г к = —-, к- волновой вектор падающей на экран волны, Я 2 длина волны излучения; /? - угол между внешней нормалью к поверхности г г г г экрана и и вектором -к, .«-угол между п и, радиус-вектором г точки начало координат выбирается в: центре отверстия в экране, ось z направлена I вдоль направления распространения излучения, г = [(х - х0)2 + (у - yQ)2 + z2]2 , х0,у0 - координаты в плоскости экрана; Е - площадь отверстия в экране; Е(хо Уо) - комплексная амплитуда электрического поля падающей волны в плоскости экрана, в случае лазерных пучков Е(х0,у0) - комплексная амплитуда поля в поперечном сечении пучка, в котором задаются граничные условия. Для реальных пучков в подавляющем большинстве случаев интеграл (1.3) аналитически не берется и приходится применять численные методы.
При реализации численных методов граничные условия задаются в виде сетки дискретных значений. На практике, в нашем случае, эта сетка соответствует размерности ПЗС - матрицы, с помощью которой измеряется распределение плотности мощности в поперечном сечении пучка.
Однако, введение дискретных источников в интеграл (1.4) должно приводить к возникновению дифракционных эффектов, обусловленным наличием резких границ. Это при определенных условиях делает невозможным получение описание пучка на некоторых расстояниях от плоскости задания граничных условий (базовой плоскости). На рисунке 1.12 представлены результаты численных расчетов интенсивности лазерного излучения вдоль оси х в поперечном сечении гауссова пучка, расположенном на расстоянии L = 40 см от базовой плоскости. Зависимость интенсивности излучения от координаты х в базовой плоскости имеет форму гаусса с амплитудой 1. 71 141 211 281 351 «1 4 1 D = 10 мм - линейный размер квадратного окна, в котором задаются граничные условия, п — число дискретных отсчетов на линейном размере D, волновой фронт в базовой плоскости полагался плоским. Кривая 1-я =128, 2-й =256, Ъ-п =512. Рисунок 1.12
Из численного анализа следует, что на заданном расстоянии L описывать пучок можно только при условии п » птт, где птт- некоторое минимальное число разбиений. Аналогичные расчеты при том же самом D были проведены и для других значений параметра L, и для каждого из них было определено свое значение птіп. В качестве критерия правильности выбранного значения nmin использовалось условие сохранения энергии с точностью 0.1%. На рисунке 1.13 представлена полученная таким образом зависимость Птт = nmin(L). Объяснить и описать имеющую место на рисунке 1.13 зависимость можно исходя из следующих соображений. При дискретном задании граничных условий мы фактически разбиваем исходный пучок на d /Л малых пучков, каждый со своей амплитудой и плоским волновым фронтом, здесь d - диаметр пучка, Л - цена деления дискретного разбиения. Угловая расходимость каждого такого пучка Я/d, /l-длина волны лазерного излучения.
Для дополнительной проверки справедливости соотношения (1.5) методом перебора расчетных распределений интенсивности в поперечном сечении гауссова пучка при фиксированном значении L были получены «экспериментальные» точки зависимости nmin = nmin(D).
Дальнейшие численные исследования показали, что соотношение (1.5) имеет универсальный характер. Оно справедливо и для сходящегося гауссова пучка с параболическим волновым фронтом, и для пучка с цилиндрическим распределением интенсивности в базовой плоскости, имеющим как плоский, так и параболический волновые фронты.
Из численного анализа следует, что на заданном расстоянии L получить описание распространения лазерного пучка можно только при условии п nmin, где nmin- некоторое минимальное число разбиений. Шаг дискретизации изображений распределений интенсивности и фазы волнового фронта, рассчитанный по формуле (1.7), был использован при численном моделировании процесса распространения лазерного излучения. Для ускорения расчетов была разработана программа «Кирхгоф», в основе алгоритма которой была заложена формула (1.4). Программа позволяет рассчитать сечение пучка, перпендикулярное оси распространения, на произвольном расстоянии от выходной апертуры лазера. В процессе моделирования были получены 2 набора распределений (I и II) интенсивности и фазы на расстояниях L = 173 -е- 593 см от выходной апертуры лазера, для двух начальных сечений взятых на расстояниях 33 см и 53 см соответственно.
Автоматизированная установка и программное обеспечение для исследования параметров оптических голографических дифракционных структур
Для измерения параметров, характеризующих оптические ГДС, необходимо частичное воспроизведение оптической схемы, по которой данные голограммы записывались. В рамках работы была разработана автоматизированная установка для измерения параметров оптических голограмм; Автоматизированная установка для измерения параметров оптических голограмм, представленная на рисунке 2.1, осуществляет частичное воспроизведение оптической схемы записи голографических дифракционных структур. Параметры, характеризующие оптические ГДС и их соответствие физическим макрохарактеристикам, приведены в таблице 2.4. Принцип действия установки заключается в следующем. При освещении ГДС лазерным светом под углом 45 к плоскости ГДС, соответствующим наилучшему наблюдению, производится сканирование по углу наблюдения с помощью телекамеры. При этом если угол между ракурсом наблюдения и падающим пучком совпадает с углом схождения пучков, который был при записи цветоделенной составляющей, то на поверхности ГДС наблюдается яркое изображение щели. Производя сканирование по углу наблюдения и соответствующую регистрацию угловых значений, можно измерить такие параметры как число щелей п, угол схождения пуков при записи щели ап, ширину щели dn. При наблюдении ГДС в белом свете можно наблюдать изображение каждой цветоделенной составляющей в своем цвете. Измерение параметра цвета Л„ может быть осуществлено с помощью цветной телекамеры или черно-белой телекамеры, снабженной системой цветных светофильтров. При освещении, голограммы пучком, являющимся комплексно сопряженным по отношению к опорному пучку, восстанавливается мнимое изображение объекта, локализованное, как правило, в плоскости самой голограммы, и действительное изображение щели. При этом изображение щели можно наблюдать на матовом экране.
Установка позволяет наблюдать некоторые виды скрытых меток типа голограмм Фурье и Лейта, а также ряд оптических эффектов, которые иногда вносятся в объемные голограммы. В состав установки входят: установка специализированная гониометрическая, система регистрации изображений ГДС, вычислительный комплекс для обработки изображений ГДС и измерительных данных. Соответствие параметров оптических голографических дифракционных структур их физическим макрохарактеристикам представлены в таблице 2.4. Технические характеристики установки представлены в таблице 2.5. Таблица 2.4 - Соответствие параметров оптических голографических дифракционных структур их физическим макрохарактеристикам Измеряемый параметр Параметр микрорельефа Физический параметр изображения отраженного от.где Ширина щели Разброс величины периода Ad АА - сегмента Угол щели Период штрихов d цвет Количество щелей Распределение периодов по фракталам Количество дискретных цветоде-ленньгх составляющих Расстояние дощели Размер фрактала Не связано Угол обзора по вертикали Максимальный разброс в периоде штрихов Максимальный разброс в цвете Угол обзора по горизонтали Параметры вертикальных штрихов и форма и размер фракталов Рассеяние в горизонтальной плоскости Глубина сцены (параллакс) Сложно определить Пространственная составляющая излучения 3D форма Сложно определить Пространственная составляющая излучения Таблица 2.5 - Технические характеристики установки Диапазон угла обзора по вертикали, градусов +80...-50 Дискретность угла обзора по вертикали, градусов 1 Диапазон угла обзора по горизонтали, градусов +60...-60 Дискретность угла обзора по горизонтали, градусов 1 Погрешность регистрации угловых характеристик, не более градусов 1 Размер кадра, не более пикселей 768x576 Разрядность оцифровки, бит 8 Потребляемая мощность, не более Вт 300 Занимаемая площадь, кв. м 4 Общий вес, не более кг 50 2.2.2 Программное обеспечение для расчета параметров схемы записи оптических голографических дифракционных структур
Разработанное программное обеспечение «Расчет параметров ОГ» позволяет определять геометрические параметры схемы записи бентоновских голограмм (оптических голограмм). Программный комплекс определения геометрических параметров схемы записи ОГ ««Расчет параметров ОГ» предназначен для обработки и записи в персональный компьютер параметров, характеризующих голограммы оптического-типа. Основные параметры приведены в таблице 2.4.
Входными данными являются изображения с расширением .bmp, содержащие снимки голограмм под разными углами наблюдения п как по горизонтали, так и по вертикали. Выходными данным является файл отчета, содержащий значения всех рассчитанных параметров.
Соотношение R:G:B позволяет охарактеризовать цвет элемента голограммы с одинаковым периодом решетки по вертикали. Каждому элементу соответствует свой цвет. Для этого при помощи мыши выделяется круглая область с центром в произвольной точке: Проведя усреднение значения параметров R:G:B по данной области рассчитывается значение этих параметров соответствующее данному элементу. Параметры щелей
При освещении сегмента ГДС лазерным светом под углом 45 к плоскости ГДС и производя сканирование по углу наблюдения и соответствую 73 щую регистрацию угловых значений, можно измерить параметры схемы записи: - число щелей п, - угол схождения пуков при записи щели ап, - ширину щели dn. Число щелей п определяется сканированием по углу наблюдения, и соответствующее изображение записывается в компьютер.
Для расчета ширины dn и у гола схождения пуков при записи щели otn, осуществляется фильтрация изображения для отсекания шумов и рассчитывается центр массы изображения. Через него проводится горизонтальная и вертикальная линии. Пересечение границ щели с горизонтальной линиией определяет ширину щели. Зная координаты точки центра изображения (хци,уц.и.), координаты точки центра масс изобоажения (Хц.м Уц.м.Х расстояние L от телекамеры до матового стекла, на котором наблюдаются щели и угол аи , на котором было снято изображение, можно определить угол щели по формуле (2.10): \Хц.и. Хц.м.) ап=аи-2-arctgC \L ) (2-Ю)
Установка и программное обеспечение для определения типа голографических дифракционных структур
Для определения типа голограмм, записанных на отдельных сегментах ГДС, используется установка, включающая модифицированный для решения этой задачи микроскоп ЕС МЕТАМ РВ-21 (ЛОМО), в котором освещающее излучение направляется на голограмму перпендикулярно ее поверхности через тот микрообъектов, который используется для исследования голограммы.
Принципиальная схема микроскопа для исследования голограмм при переменном увеличении. В микроскопе обеспечивается замена микрообъективов в поворотной турели. Преимущественно используются объективы 3,7х , 10х , 20х , 40х. Изображение структуры голограммы воспринимается телекамерой и выводится на экран монитора. Если увеличение, создаваемое первым микроскопом, недостаточно для анализа структуры голограммы, то используют — интерференционный микроскоп, позволяющий исследовать микроструктуру голограммы с большим увеличением и получить кроме микроизображений также микроинтерферограммы элементов структуры голограммы. Осуществляется жесткая привязка координат исследуемого ГДС к системе координат стола, управляемого от компьютера микроскопа. Закрепив требуемым образом ГДС на столе, оператор вводит в компьютер, управляющий столом микроскопа карту сегментов ГДС. Компьютер управляет столом так, что после расшифровки оператором структуры очередного сегмента, автоматически происходит переход к следующему. Таким образом, в конце процедуры на карте каждому сегменту присвоен определенный тип - ЭЛЛ, ТМ или ОГ. После этого известно, какие сегменты, на какой аппаратуре следует исследовать дальше.
В большинстве случаев оператор может полностью охарактеризовать измеряемый сегмент по определенной микроструктуре, частоте и ориентации интерференционных полос. Рассмотрим модифицированный автоматизированный металлографический микроскоп ЕС МЕТАМ РВ-21 (ЛОМО), входящий в состав установки подробнее. Микроскоп металлографический агрегатный серии ЕС МЕТАМ РВ-21 предназначен для визуального наблюдения микроструктуры металлов, сплавов и других непрозрачных объектов в отраженном свете при прямом освещении в светлом и темном поле, а также для исследования объектов в поляризованном свете и методом дифференциально-интерференционного контраста. Микроскоп применяется в металлографических лабораториях научно-исследовательских институтов и предприятий металлургической, микроэлек 94 тронной, машиностроительной промышленности. Микроскоп представляет собой инвертированный микроскоп с верхним расположением столика, который базируется на одном унифицированном штативе с агрегатно-модульными узлами.
Микроскоп позволяет наблюдать микроструктуру объекта в светлом и темном поле при прямом освещении, в поляризованном свете и методом дифференциально-интерференционного контраста. При наблюдении в светлом поле лучи от источника света, на рисунке 3.2, проходят через линзу 2, теплофильтр 3, осветительную линзу 5, ирисовую диафрагму 6, отражаются от плоскопараллельного полупрозрачного отражателя 7 и направляются через объектив 9 на объект 11. Лучи, отраженные от поверхности объекта, снова проходят через объектив и отражатель, попадают на зеркало 18 и сводятся линзой 17 в фокальную плоскость окуляра 13, где создается действительное обратное и увеличенное изображение объекта.
При наблюдении в темном поле из хода лучей выключаются отражатель 7, линза 5 и вводится диафрагма 19, центральная зона которой экранирована. Свет, пройдя через диафрагму 19, отражается от кольцевого отражателя 8 и попадает на параболический конденсор 10, который собирает пучок лучей на объекте. Лучи, диффузно отраженные от неровностей объекта, попадают в объектив. В поле зрения микроскопа неровности объекта изображаются светлыми на общем темном фоне.
Для получения равномерного освещения исследуемого- объекта в светлом поле в ход лучей вводится осветительная линза 5 с матированной поверхностью, а для повышения .контрастности изображения-объекта вводится светофильтр 4.
Для получения равномерного освещения в темном поле в ход лучей вводится-заглушка ТП. При наблюдении в поляризованном свете в ход лучей вводятся отражатель 7, анализатор 16 и поляризатор 20. При наблюдении методом дифференциально - интерференционного контраста (ДИК) в ход лучей вводятся отражатель 7, анализатор 16, поляризатор 21 и призма 12. Линейно.поляризованный свет, выходящий из поляризатора, отражается от отражателя 7, попадает на двоякопреломляющую призму 12, ориентированную в пространстве таким образом, что угол между плоскостью поляризации поляризатора.20 и осью призмы 12 равен 45, и, проходя, через призму, расщепляется на два луча. Лучи, выходящие из призмы 12; поляризованные во взаимно перпендикулярных плоскостях и имеющие равные интенсивности, проходят через объектив 9 и попадают на объект 11, при отра 96 жении от которого возникает разность фаз этих лучей из-за неровностей поверхности.
Отразившись от объекта и вновь пройдя через объектив и призму, лучи соединяются в плоскости локализации призмы, которая совмещена с задней фокальной плоскостью объектива. При вводе анализатора 16, плоскость поляризации которого расположена, под углом 45 к оси призмы, достигается интерференция лучей. Получается двойное изображение объекта, однако раздвоение настолько незначительное (близкое к пределу разрешения объектива), что практически его не видно и объект воспринимается рельефным [90].
Методы для анализа транспорта флуорофора в живой клетке
Одним из методов, позволяющих установить связь между фазовым и флуоресцентным изображениями , является корреляционный: анализ; [95; 96]. Выданной главе рассматривается корреляцияшежду фазовым и флуоресцентным изображениями клетки:эпителиального типа; полученного при:помощи флуоресцентно-интерференционного: микроскопа описанного выше., Корре-ляционнаяфункцияисследуетсяв пространственношобласти.
Другой MeTOflj позволяющий анализировать флуоресцентные и фазовые изображения, - определение- зон локализации лекарственного препарата: BV клетке. Зная\места:локализации лекарственного препарата путем:сопоставления, фазового и флуоресцентного изображений, можно определить каким; ор-ганеллам клетки они соответствуют.
Внутренняя» структура двух случайных процессов «может быть различна- . и; для!описания различия вводится специальная: характеристика - корреляционная; функция; Корреляционная функция характеризует степень зависимости между сечениями случайных функций, относящихся: к различным моментам отсчета;
Степень,зависимости величин может быть в значительной, мере охарактеризована их корреляционным моментом, который и принято называть корреляционной функцией; Рассмотрим корреляцию между фазовым и флуоресцентным изображениями клетки эпителиального типа в пространственной области, т.е. определим соответствие между фазовым набегом излучения и интенсивностью флуоресценции при смещении одного изображения относительно другого.
Заметим, что значения энергий нормированных матриц равны 1. Следовательно, матрицы изображений фазового набега оптического излучения при прохождении через клетку и интенсивности флуоресценции лекарственного препарата в клетке находятся в одном динамическом диапазоне и тогда, можно определять связь между данными изображениями, т.е. корреляцию.
Для корреляционного анализа изображений используется специально разработанная в рамках диссертационной работы программа расчета «Корреляция». Из-за выборочной изменчивости оценок корреляционной функции, проверяют, свидетельствует ли ненулевое значение коэффициента корреляции о существовании статистически значимой корреляции между исследуемыми случайными величинами.
Для определения точек локализации максимумов флуоресценции в клетке необходимо1 сопоставить флуоресцентное изображение и фазовое. Для этого необходимо воспользоваться программным комплексом «Корреляция», которая позволяет оценить соответствие максимумов флуоресценции определенным точкам на фазовом изображении. «Корреляция» позволяет оценить максимальное расстояние между двумя.максимумами (фазового изображения и флуоресценции) в мкм.
Программный, комплекс работает с матрицами, которые представляют собой фазовое и флуоресцентное изображения. Максимальный размер матриц ограничен размерами вводимых изображений. Размерность вводимых изображений - 256x256 элементов. Программа предназначена для. решения, задачи- распределения флуорофлра в живой клетке по двум изображениям (фазовому и флуоресцентному) по следующим этапам: 1. Предварительный анализ изображений. Корреляционный анализ двух изображений дает возможность определить наличие или отсутствиека-кой-либо связи между ними. 2. Анализ распределения лекарственного препарата в клетке. На данном этапе, после обработки фазового и флуоресцентного изображений в специальной программе; можно получить двумерную карту распределения зон с наибольшей плотностью белка и зон, максимально насыщенных лекарственным препаратом. Кроме этого, можно определить расстояния- между максимумами фазового и флуоресцентного изображений.
При анализе зон локализации флуорофора в каждой точке совпадения максимумов, фазового набега и флуоресценции однозначно соответствует точка клетки на изображении с амплитудным контрастом, что позволяет анализировать локализацию и взаимодействия изучаемого соединения в конкретных клеточных составляющих.
Алгоритм работы данной подсистемы состоит в том, что исходные, изображения, представленные в виде двумерных массивов данных, сдвигаются друг относительно друга в обоих направлениях, и при этом вычисляется значение корреляционной функции в зависимости от величины сдвига.
Сначала найдем максимумы фазового изображения. Для этого осуществим обход матрицы изображения Ркц матрицей А, размерностью 3x3, как показано на рисунке 4.6. Причем, добавим дополнительные элементы Nul, которые меньше любого элемента матрицы, в матрицу изображения Ркц по краям, для возможности обхода краевых элементов исходной матрицы.
Если центральный элемент матрицы А больше окружающих, то он является локальным максимумом и записывается в одномерный массив максимумов фазового изображения. При этом массив хранит координаты данного максимума и его значение.
