Введение к работе
Оптические методы диагностики нашли практическое применение в биологии и медицине, в т.ч. для разработки методов диагностики биотканей. Наиболее распространенные из них: аутофлуоресцентная диагностика, оптическая когерентная томография, спектроскопия диффузного отражения, флуориметрия [1]. Эти методы диагностики основаны на способности некоторых химических соединений (как органических, так и неорганических) селективно накапливаться в патологических тканях. Повышение концентрации флуоресцирующих веществ (эндогенных флуорофоров) в отдельных участках ткани нетрудно зафиксировать экспериментально. Благодаря неинвазивности и высокой чувствительности по отношению к патологии, флуоресцентная диагностика (ФД) получает все более широкое распространение.
Однако перечисленные методы не лишены недостатков. Как правило, они позволяют обнаружить патологию на поздних стадиях, когда опухоли сформировались и возможны необратимые осложнения. Из-за сильного поглощения и рассеяния света внутри соединительной и эпителиальной ткани диагностика их глубоких слоев затруднительна. Интерпретация результатов оптических измерений осложняется присутствием межклеточного вещества, крови, лимфы и других, сильно рассеивающих компонентов, входящих в состав биотканей. Поэтому на этапе разработки методов ФД часто объектами исследований служат клетки, выделенные из различных органов человека или животных. Для обеспечения жизнеспособности клеток и сохранения их естественных биологических функций их культивируют в различных питательных средах.
Для оптической диагностики, как культур клеток, так и тканей, используют и экзогенные флуорофоры - синтетические красители или различные фотосенсибилизаторы [2]. Метод ФД может быть основан на регистрации спектров поглощения и быстрой флуоресценции флуорофоров, или кинетики их замедленной флуоресценции (ЗФ). При регистрации спектров флуоресценции молекул результаты исследований зависят от интенсивности источника света, анизотропии рассеяния и многих других факторов [3]. В случае регистрации кинетики длительной люминесценции этих недостатков можно избежать.
В настоящей работе представлены результаты исследования кинетики длительной люминесценции молекул ксантеновых красителей - экзогенных флуоресцентных зондов в клетках, выделенных из нормальных и патогенных тканей.
Целью работы является установление закономерностей длительной люминесценции экзогенных молекулярных зондов в клетках, выделенных из нормальных и патологических биотканей, и выработка рекомендаций для разработки метода их оптической диагностики.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Разработать технологию подготовки образцов с клетками биологических тканей для оптических измерений.
Установить особенности ЗФ и фосфоресценции молекулярных зон-
дов в опухолевых и нормальных клетках;
Изучить закономерности длительной люминесценции молекул органических красителей в бактериальных клетках;
Выявить основополагающие процессы с участием триплетных состояний молекул-зондов, влияющих на формирование сигнала длительной люминесценции в образцах с опухолевыми и нормальными клетками.
Установить основные факторы, влияющие на длительную люминесценцию органических люминофоров, локализованных в клетках биотканей.
Методы исследования. Основные экспериментальные результаты получены в ходе изучения кинетики затухания ЗФ и фосфоресценции многоатомных молекул-зондов при возбуждении их низкоинтенсивным лазерным излучением в основной полосе поглощения. На разных стадиях исследований использовались методы электронной и ИК-спектроскопии, фотометрии, зондовой сканирующей атомно-силовой и традиционной оптической микроскопии.
Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:
1. Исследована кинетика ЗФ и фосфоресценции эндогенных флуоро-
форов в соматических и бактериальных клетках, культивируемых на поверхно
сти твердой питательной среды - биоматериале «Гиаматрикс». Показано, что
при нормальных условиях в клетках доминирующим процессом, определяющим
характер длительной люминесценции ксантеновых красителей, является туше
ние их триплетных состояний молекулярным кислородом с образованием синг-
летного Ag(02) кислорода и последующей синглет-триплетной Tl—>Ag(02)
аннигиляцией.
Обнаружены различия в кинетике фотопроцессов с участием триплетных состояний молекул-зондов в клетках нормальных и патогенных тканей. Достоверно регистрируемые различия в кинетике затухания ЗФ и фосфоресценции ксантеновых красителей предложено использовать для разработки альтернативного метода диагностики биотканей, основанного на регистрации излуча-тельного времени жизни экзогенных флуорофоров.
Методами кинетической и стационарной спектрометрии определена специфика взаимодействия различных типов красителей с бактериальными клетками. Показано, что при обработке результатов кинетических измерений следует учитывать вклад в общий сигнал от флуорофоров, локализованных в бактериальных клетках.
Обнаружена зависимость кинетики длительной люминесценции молекулярных зондов от стадии развития патологического процесса. Установлено, что время жизни ЗФ экзогенных зондов в клетках на ранней стадии развития опухоли короче, чем на поздней стадии. Это объясняется гипоксией онкогенных клеток.
Практическая значимость диссертации состоит в следующем: 1. Установленные закономерности кинетики ЗФ и фосфоресценции ксантеновых красителей в клетках могут быть использованы для разработки нового оптического метода диагностики биотканей, основанного на измерении времени жизни триплетных состояний экзогенных флуорофоров.
Разработана технология подготовки клеток биотканей для оптических измерений (Патент №2418067 от 10.05.2011. Приоритет от 03.12.2009. Опубл. БИ № 13, Патент № 2409664 от 20.01.2011. Приоритет 29.04.2009. Опубл. БИ№1).
Результаты кинетических исследований по взаимодействию органических молекул с клетками биотканей могут найти практическое применение не только при решении диагностических задач, но и для контроля жизнеспособности клеток и лазерной терапии.
Достоверность полученных результатов обеспечена применением современных приборов и оборудования, методов исследования и обработки экспериментальных данных и их хорошей воспроизводимостью. Согласием теоретических моделей и экспериментальных результатов. Положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, теоретически и экспериментально обоснованы и не противоречат общенаучным представлениям о природе длительной люминесценции органических молекул в конденсированных средах.
Личный вклад автора. В основу диссертации положены результаты научных исследований, проведенных автором в 2007-2011 годах. Автором лично разработан способ приготовления образцов для исследования, проведены измерения спектров люминесценции, кинетики ЗФ и фосфоресценции образцов, предложена модель и выполнена математическая обработка результатов. Постановка задачи осуществлялась совместно с научным руководителем, профессором С.Н. Летута.
Положения, выносимые на защиту:
1. Основным каналом релаксации возбужденных триплетных состоя
ний молекул ксантеновых красителей (экзогенных молекулярных зондов) в
клетках, выделенных из биотканей, при нормальных условиях является безыз-
лучательный перенос энергии на молекулярный кислород. Кинетика длительной
люминесценции молекулярных зондов в клетках при нормальных условиях оп
ределяется эффективностью конкурирующих процессов синглет-триплетной
^g(Oi)~T аннигиляции, термостимулированной замедленной флуоресценции
(ТЗФ) и фосфоресценции.
Кинетика длительной люминесценции молекул ксантеновых красителей в биоматериале «Гиаматрикс» не зависит от давления воздуха над поверхностью материала. Характер замедленной флуоресценции молекулярных зондов в таком материале определяется эффективностью статической триплет-триплетной аннигиляции и термостимулированного послесвечения.
Кинетика ЗФ и фосфоресценции молекул-зондов в клетках, выделенных из злокачественных опухолей и нормальных тканей, различна и зависит от стадии развития опухоли. Излучательное время жизни триплетных зондов в онкогенных клетках больше, чем в нормальных клетках. В клетках, выделенных из капсул злокачественных опухолей, эффективность генерации синглетного кислорода ниже, чем в нормальных клетках.
Кинетика длительной люминесценции молекул красителей связанных с бактериями E-coli при нормальных условиях определяется соотношением
интенсивностей термостимулированного свечения, синглет-триплетной анниги-ляционной флуоресценции и фосфоресценции.
Апробация работы. Изложенные в диссертации результаты обсуждались на семинарах и докладывались на следующих российских и международных конференциях: 14th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2010 (2010, Saratov); 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (2009, Москва); 53-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (2010, Москва); Всероссийская научно-практической конференция "Многопрофильный университет как региональный центр образования и науки" (2009, Оренбург); IV Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience SMBM» (2009, Orenburg); V Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical magnetoscience (SMBM)» (2010, Orenburg); International conference «Laser applications in life science LALS-2010» (2010, Finland, Oulu); Международный молодежный научный форум «ЛОМО-НОСОВ-2010» (2010, Москва, МГУ); Всероссийская молодежная научная конференция ВНКСФ-16 (2010, Волгоград); VI Международная научно-техническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» БФФХ-2010 (2010, Севастополь); IX международная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (2009, Москва, ИБХФ РАН); X международная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (2010, Москва, ИБХФ РАН); Международная школа-конференция «Биофизика сложных систем. Анализ и моделирование» (2011, Пущино), III International symposium «Topical problems of biophotonics». (2011, St.- Peter-burg - Nizhny Novgorod); 15th International School for Young Scientist and Student on Optics, Laser Physics & Biophysics SFM-2011 (2011, Saratov).
Публикации
По теме диссертационной работы имеется 22 публикации, из них 2 патента, 4 публикации в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 16 работ в сборниках материалов международных и общероссийских конференций.
Работа поддержана аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 годы) «Флуоресцентная диагностика биологических тканей», № 1.1.06, (2009, 2010); «Спектрально-люминесцентная диагностика биологических объектов и материалов», № 1.1.11, 2011; Фондом содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере, «У.М.Н.И.К.» №14 от 01.02.2010.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 154 страницы, включая 46 рисунков, 9 таблиц и список литературы, состоящий из 196 источников.
