Содержание к диссертации
Введение
1. Физиолого-биохимическое значение ферментных систем клеток тканей и органов 13
1.1. Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных 14
1.2. Механизмы транспорта питательных-веществ в кишечнике 17
1.3. Транспортные АТФазы и их активность 20
1.3.1. ХарактеристикаNa+, К +-АТФазы 20
1.2.1. Биологическая роль Са2+-АТФазы 29
1.2.2. Значение и биологическая роль НСОз.-АТФазы 32
1.3.1. Особенности функционирования АТФаз птиц 36
1.3.2. Влияние различных факторов на транспортные процессы и активность АТФаз 37
2. Собственные исследования 44
2.1. Материалы и методы 44
2.2. Результаты собственных исследований 54
2.2.1. Транспорт веществ и АТФазная активность эритроцитов, тканей и органов птиц 54
2.2.2. Активность АТФаз эритроцитов свиней 181
2.2.3. Активность АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота 188
Заключение 202
Выводы 216
Практические предложения 218
Список литературы 220
Приложение 257
- Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных
- Механизмы транспорта питательных-веществ в кишечнике
- Материалы и методы
- Результаты собственных исследований
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время все более очевидной становиться важная и многообразная роль ферментных систем среди различных факторов, участвующих в регуляции и интеграции процессов развития, физиологического состояния и жизненных отправлений организма. На механизмах, основу которых составляют ферментные системы, базируется раскрытие в онтогенезе путей реализации наследственной информации, регуляции роста и развития, гомеостаза (К.Б. Свечин, И.А. Аршавский, А.В. Квасницкий и соавт., 1967; В.Н. Никитин, 1975; В.Ф. Лысов, 1977, 1996, 2004; С.И. Вишняков, 1989; В.И. Максимов, 1999-2002, 2004, 2005; В.И. Максимов и др., 1999-2010; Г.Ф. Рыжкова, 2005; В.А. Гудин, 2006; S.R. Torronteras et al., 1993). В частности, характерные периоды более быстрого и замедленного роста и развития органов и организма в целом в определенной степени связаны с активностью ферментных систем.
Известно, что активность ферментных систем зависит от степени воздействия различных факторов внешней и внутренней среды клетки, таких как изменение рН, концентрации субстрата, химическая модификация молекул, наличие специфических активаторов и ингибиторов, изменения проницаемости мембран, скорости деградации молекул фермента, индукции и репрессии биосинтеза белка молекул ферментов и др. (Н.Н. Чернов, 1996; А.А. Болдырев, 1997). Степень влияния этих факторов во многом определяется экзогенными и эндогенными условиями существования, оказывающими воздействие на организм, к ним относят: возраст, физиологическое состояние (половое и физиологическое созревание, продуктивность и скорость роста), тип кормления и кормовые добавки, гормональный и иммунный статус, стресс и др. Таким образом, активность ферментов, играет ведущую роль в реализации механизмов физиолого-биохимической адаптации, обеспечивающих существование организма в постоянно изменяющейся внешней среде (В.Ф. Лысов, 1977; В.Б. Решетов, 1998; Р.М. Хаитов, 2000; Р.Х. Кармолиев, 2002, 2005; В.Г. Галактионов, 2005; Е.Л. Харитонов, 2003, 2007; Е.А. Силиванова, 2006; Д.Н. Кыров, 2006 и др.; В.И. Максимов, 2002, 2006, 2008; В.В. Михайлов, 2008).
Для обеспечения физиологических процессов и свойств живой клетки, структурно-физиологической единицы тканей, органов и организма животного в целом, необходим избирательный транспорт веществ и энергии в клетку из внешней среды, ведущую роль в котором играет активный транспорт, осуществляемый ферментными системами мембран (ионными насосами), интегральными компонентами которых являются АТФазы. АТФ-зависимые ионные насосы, представляющие комплекс ферментов, обеспечивают как первичный транспорт катионов (H+, Na+, K+, Ca2+) и анионов (Cl-, HCO3-) против их электрохимических градиентов, так и вторично-активный перенос через мембрану в клетку сахаров, аминокислот, органических кислот, за счет энергии трансмембранного градиента концентрации ионов Na+. С работой АТФаз так же связана генерация биотоков, трансмембранного потенциала и передача нервного импульса, процессы сопряжения окислительного фосфорилирования. Накоплено большое количество сведений по изучению транспорта ионов и функционированию Mg2+-, Ca2+-, Na+,K+-, H+-АТФаз (Я. Кагава, 1985; А.А. Болдырев и др., 1985, 1998; С.И. Вишняков, 1989; J.C. Skou et al., 1992; В.П. Скулачев, 1989, 2001; В.А. Опритов, 1996; Ю.А. Владимиров, 1998; А.М. Рубцов, 2005; Г.Ф. Рыжкова, 2005; G. Schiener-Bobis, 2002; P.L. Jorgensen et al., 2003; и др.).
Показатель активности АТФазных ионных насосов является очень чутким критерием оценки метаболического состояния организма. Для обеспечения процессов активного транспорта питательных веществ необходимы существенные затраты энергии, которые составляют до 40 % от суммарной энергии, поступившего корма. Существенное влияние на активность транспортных АТФаз оказывает обеспеченность животных белком различного качественного состава (В.В. Мосягин, 1996; Н.Н. Максимюк, 1998; Ю.В. Фурман, 2001).
Дальнейший прогресс животноводства во многом зависит от решения проблемы дефицита кормового протеина и аминокислот за счет расширения их производства и повышения эффективности их использования, в частности рационального использования отходов кожевенной промышленности (Р.У. Бикташев, 1985; Ю.В. Фурман, 2001; В.И. Фисинин, 2006, 2007; И.Л. Гальперн, 2009; Я. Ройтер, 2010; и др.).
Вместе с тем, еще недостаточно сведений об особенностях влияния возраста и физиологического состояния в конкретные фазы постнатального онтогенеза, кормовых добавок на активность ферментных систем клеток органов и тканей различных видов животных. В связи с этим вполне очевидна актуальность исследования активности транспортных АТФазных систем клеток тканей и органов в постнатальном онтогенезе у птиц, свиней и крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), возрастом, кормлением, физиологическим созреванием.
Цель работы - выявление особенностей становления физиолого-биохимических процессов и функций в организме разных видов животных (птиц, свиней и крупного рогатого скота) в постнатальном онтогенезе, связанных с активностью транспортных АТФазных ферментных систем их клеток тканей и органов в зависимости от их физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), физиологическим созреванием, возрастом и кормлением.
Для достижения цели, были поставлены следующие задачи:
1. Установление видовых особенностей функционирования АТФазных ферментных систем клеток тканей, органов и субклеточных структур у птиц, свиней и крупного рогатого скота в зависимости от возраста (фаз постнатального онтогенеза) и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), кормлением, физиологическим созреванием, продуктивностью и скоростью роста.
2. Выявление активности ферментных систем (АТФаз) в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров, специфичности влияние ионов электролитов (Mg2+, Na+, K+) и ингибитора (строфантин-К).
3. Исследование особенности функционирования ферментных систем (АТФаз) в ядерной и цитоплазматической мембранах эритроцитов цыплят бройлеров в зависимости от их физиологического состояния обусловленного генетическим потенциалом (кроссом), возрастом и кормовыми добавками (ПКД и сукцинат натрия).
4. Выявление активности транспортных АТФаз в клетках тканей и органов цыплят-бройлеров в зависимости от их физиологического состояния обусловленного их генетическим потенциалом (кроссом), возрастом и кормовыми добавками (ПКД).
5. Изучение энергозависимого транспорта белков и аминокислот пептидной кормовой добавки в кишечнике цыплят-бройлеров.
6. Изучение активности транспортных АТФаз в эритроцитах свиней в зависимости от их физиологического состояния обусловленного физиологическим созреванием, возрастом.
7. Исследование специфичности влияния ионов электролитов (Na+, K+) и ингибиторов (строфантин-G) на активность транспортных АТФаз в эритроцитах свиней.
8. Изучение активности транспортных АТФаз в эритроцитах крупного рогатого скота в зависимости от их физиологического состояния обусловленного физиологическим созреванием, возрастом.
9. Исследование специфичности влияние ионов электролитов (Na+, K+) и ингибиторов (строфантин-G) на активность транспортных АТФаз в эритроцитах крупного рогатого скота.
Научная новизна работы. Впервые установлена физиолого-биохимическая видовая особенность активности транспортных АТФазных ферментных систем клеток тканей, органов и субклеточных структур, которая имеет свое своеобразие у птиц, свиней и крупного рогатого скота в зависимости от возраста (фаз постнатального онтогенеза) и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), кормлением, физиологическим созреванием, продуктивностью и скоростью роста.
В ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов (т.е. субклеточных структурах) цыплят-бройлеров выявлены АТФазы, активируемые ионами Mg2+-, Na+, K+-, Ca2+- и HCO3--АТФазы цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров имеющие существенные различия, проявляющиеся во влиянии на них ионов Na+ и K+. Так, ионы Na+,K+ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, ионы Ca2+ - на 87% и HCO3- анион - на 96% с высокой степенью достоверности. Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na+,K+ и Ca2+ (P>0,05) и была детерминирована ионами HCO3- на 96% (P<0,01).
У цыплят-бройлеров выявлена АТФазная активность и особенности функционирования в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов Mg2+-, Na+, K+-; Ca2+- и HCO3-- АТФаз в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (кроссом), кормлением. Так, с возрастом активность Mg2+-, Na+, K+-, Ca2+- и HCO3–-АТФаз эритроцитов, клеток тканей и органов цыплят-бройлеров достоверно повышается. При этом детерминация активности ферментов возрастом более выражена у кросса «Бройлер-6», а кормовыми добавками у кросса «ISA».
У свиней и крупного рогатого выявлена функциональная активность АТФаз эритроцитов в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой у крупного рогатого скота), физиологическим созреванием. Активность АТФаз эритроцитов свиней и крупного рогатого скота с возрастом достоверно понижается. Выявлены породные отличия активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской и черно-пестрой пород. На активность общей АТФазы порода оказывала влияние на 8,6%; активность Mg2+-АТФазы (уабаин нечувствительная компонента) не была детерминирована породой; активность Na+,K+-АТФазы (уабаин чувствительной компоненты) была определена породой на 15,7%. Выявлено, что Na+-чувствительную АТФазную компоненту эритроцитов крупного рогатого породные особенности животных детерминируют на 13,2%; на K+-чувствительную компоненту порода оказывает влияние на 4,2%. Установлены, породные отличия активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота определяемые в средах различного ионного состава: у Mg2+-АТФазы - на 9,6%; Na+,K+-АТФазы - на 2,6%, и HCO3--АТФазы - на 3,2%; активность Ca2+-АТФазы не имела достоверных породных отличий.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выполненные исследования носят фундаментальный характер и содержат новые решения актуальной научной проблемы выяснения становления физиолого-биохимических механизмов функционирования АТФазных ферментных систем субклеточных органоидов, клеток, тканей и органов.
Установленные особенности физиолого-биохимических механизмов активного транспорта с участием АТФазных ионных насосов с возрастом, кормлением, физиологическим состоянием (физиологическое созревание, продуктивность и скорость роста), породой (кроссом) необходимы для решения практических задач по созданию оптимальных условий эксплуатации животных, обеспечивающих полное проявление их генетических потенциальных возможностей.
Полученные данные открывают перспективу для дальнейших исследований по раскрытию молекулярных механизмов функционирования АТФазных транспортных систем в субклеточных структурах клеток органов и тканей животных при изменении внешних и внутренних условий существования. Результаты работы предполагают целенаправленный поиск специфических препаратов, способных эффективно регулировать транспортные процессы. Проведенные биохимические исследования вносят несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы регуляции активного транспорта веществ с участием АТФазных ионных насосов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Физиолого-биохимические механизмы активного транспорта ионов с участием Mg2+-; Na+,K+-; Ca2+- и HCO3-- АТФаз в организме птиц, свиней и крупного рогатого скота имеют возрастные особенности.
-
Существуют особенности функционирование АТФаз ядерных и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров.
-
Кормовые добавки (пептидная и сукцинат натрия) оказывают стимулирующее влияние на активность АТФаз, физиолого-биохимические показатели крови, тканей и органов и продуктивность цыплят-бройлеров.
-
Активность АТФазных ферментных систем эритроцитов крупного рогатого скота имеет породные особенности.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены и одобрены на: конференциях профессорско-преподавательского состава Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова (Курск, 1995-2005); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества» (Курск, 2007); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Научные исследования, автоматика и динамика машин, инновационные и средозащитные технологии в техносфере» (Курск, 2007); VIII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2008); Всеукраинской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Украина, Днепропетровск, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008); 74-й научной конференции Курского государственного медицинского университета, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2009); Всеукраинской научно-практической конференции «Досягнения перспективи експерементальноi i клiнiчноi бiохiмii» (Украина, Тернополь, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Теоретические основы физической культуры» (Казань, ТГГПУ, 2009); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 90-летию ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2009); Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию кафедры органической и биологической химии СПбГАВМ (С.-Петербург, 2009); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней, животных и птиц», посвященной 80-летию Уральского научно-исследовательского ветеринарного института (Екатеринбург, 2010); Международной научно-практической конференции «Адаптация и становление физиологических функций у животных», посвященной 90-летию кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2010); XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); на международной научно-практической конференции «Современные проблемы и инновационные тенденции развития аграрной науки» (Якутск, 2010); международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и социального образования» (Курск, 2011); межкафедральном совещании по предварительной экспертизе диссертации в ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2011).
По материалам диссертации опубликованы 37 работ, в том числе: 3 -патента на полезную модель, 13 - в рецензируемых печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ. В публикациях содержится полный объём информации, касающийся темы диссертации.
Основные материалы, изложенные в диссертации, получены автором самостоятельно.
Выражаю научным консультантам и своим коллегам глубокую благодарность и признательность за оказанную помощь.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 267 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами и 186 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования (1 глава), изложения собственных результатов (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 344 источника, в том числе 185 отечественных и 159 иностранных и приложений.
Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных
Жизнедеятельность клетки невозможна без поддержания в ней определенного соотношения воды, солей и органических веществ. Это обеспечивается за счет межклеточного обмена, то есть обмена веществ между клеткой и ее окружением.
Регулирование потока веществ в клетку и удаление из нее метаболитов обеспечивают биомембраны, через которые одновременно в противоположных направлениях проходят все жизненно важные химические вещества.
«Мембранная обособленность» живых систем от окружающего пространства является одним из самых важных факторов, отличающих живое от неживого (Болдырев А.А., 1977).
Мембраны играют ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток - прокариотических и эукариотических, растительных и животных. Мембраны формируют внутриклеточные компар-тменты, с их помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды. Они участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые осуществляются между наружной и внутренней сторонами этих компартментов. Это проявляется в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану или в форме передачи информации при помощи конфармационных изменений, индуцируемых в мембранных компонентах.
Кроме этого, с мембранами связаны многие клеточные ферменты, осуществляющие большинство жизненно важных функций, например, репликацию прокариотической ДНК, биосинтез белков и их секрецию, биоэнергетические процессы и функционирование гормонального ответа (Kusano Т. et al., 1984; Laffan J. et al., 1987;).
Идею о том, что биомембраны представляют собой липидный бислой выдвинули в 1925 году Гортер и Грендел. Дальнейшее развитие этой концепции привело к появлению в 1935 году «сендвичной» модели Давсона Даниели (J. Danielli, H. Davson, 1934), в которой предполагалось, что белки покрывают поверхность липидного бислоя.
В основе современных представлений о строение биомембран лежит жидкостно-мозаичная модель Сингера и Николсона, предложенная в семидесятых годах двадцатого века, согласно которой мембраны представляют собой текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки.
В основе строения биомембраны эритроцитов лежит цитоскелет, выполняющий не только механическую функцию, но и участвует в ряде регуля-торных процессов, в том числе в передаче сигналов (Yu J. et al., 1973; Fairbanks G. et ah, 1971; Goodman S. R. et al., 1995; Bennett et al., 2001).
В последние годы жидкостно-мозаичная модель подверглась модификации. Было установлено, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липидном бислое, а некоторые участки мембран отличаются по своей структуре от классического липидного бислоя. Особенности строения и функции биологических мембран различных органов и тканей достаточно подробно изучены и описаны в литературе (Болдырев А.А., 1982; 1985; КагаваЯ., 1985; Геннис Р. и др., 1997).
Главная функция биологических мембран - избирательный транспорт различных веществ и ионов между клетками и её органеллами с окружающей средой. Это служит основой всех биоэнергетических механизмов и является строго скоординированным процессом в пространстве и времени (Ovchin-nikov Y.A. et al, 1987).
Избирательный транспорт веществ и ионов через биологические мембраны создает градиент концентраций веществ по обе стороны мембраны. Кагава Я. (1985) выделяет следующие типы транспорта в биомембранах: 1) пассивный транспорт веществ и ионов в направлении уменьшения электрохимического потенциала. Различают несколько типов пассивного транспорта - свободная и облегченная диффузия; 2) активный транспорт - перенос веществ против градиента их электрохимического потенциала, сопряженный с потреблением энергии и при участии транспортных АТФаз; 3) цитоз - механизм переноса, который сопровождается обратимыми изменениями архитектоники мембран.
Главным путем поступления в клетку неорганических ионов аминокислот, пептидов, органических кислот и других метаболитов является активный транспорт, осуществляемый ионными насосами, интегральными компонентами которых являются транспортные АТФазы (Бурков И.А., 1970).
Наличие на мембране заряда, а также высокий градиент концентраций ионов натрия по обе стороны мембраны, по мнению Мартиросова СМ. (1981), является основополагающим фактором в процессе поступления Сахаров и аминокислот в клетки, что подтверждается экспериментальными исследованиями. Samarzija I., Hinton В.Т., Fromter Е. (1982) отмечают, что при транспорте в клетку проксимальных канальцев почек одной молекулы аспа-рагиновой или глутаминовой кислот переносится 2 иона натрия в цитозоль.
Перенос Сахаров через мембрану щеточной каемки кишечного эпителия осуществляет ферментная система, расщепляющая сахарозу в процессе транспорта на составляющие моносахариды и др. (Кагава Я., 1985; Davis-Kaplan S.R. et al., 2004).
Suleiman M.S., Chapman R.A.(1991) установили, что блокада Na-насоса сердца морской свинки строфантином приводит к выходу аминокислот из клеток желудочка.
Это объясняется тем, что в большинстве случаев транспорт этих соединений в клетки является вторично - активным, то есть натрий зависимым. При этом одновременно с сахаром или аминокислотой через мембрану перемещаются ионы натрия, происходит симпорт, а чтобы не произошло накопление натрия в клетках, он активно «откачивается» во внеклеточную среду при помощи натриевого насоса (Вишняков СИ., 1988).
Однако эритроциты, поглощающие малые количества аминокислот, обладают в связи с этим и низкой активностью натрий - калиевой помпы. Вишняков СИ. (1988) сделал предположение о том, что в эритроциты ами нокислоты транспортируются преимущественно натрий - независимыми способами. Это подтверждается открытием новой транспортной системы для аминокислот, например в эритроцитах лошади Пржевальского. Fincham Daron A., Ellory John Clive, Young James D. (1992) установили сходство новой системы транспорта как с классической Na+- зависимой, так и с Na+- независимой системами.
Транспорт аминокислот зависит от их химической структуры, величины молекулы и ее электрического заряда. Так, наибольшей скоростью транспортирования обладают отрицательно заряженные аминокислоты с короткой углеводородной цепью, в то время как для транспорта положительно заряженных аминокислот в среде не требуется присутствия ионов натрия (Christensen N.N., 1972).
Механизмы транспорта питательных-веществ в кишечнике
Механизм всасывания веществ через клеточные мембраны стенки кишечника еще недостаточно изучен. Но не вызывает сомнений тот факт, что он носит как пассивный (диффузия), так и активный характер (Daniel V.G., 1972). При этом показано, что скорость исчезновения аминокислот и пептидов из кишечника анестезированных цыплят обратно пропорциональна молекулярной массе поступающих соединений. Пассивный транспорт - проте кает медленно и по своей интенсивности не соответствует высоким скоростям всасывания в кишечнике.
Ведущую роль в процессе переноса аминокислот и пептидов играет активный транспорт, его характерной особенностью является перенос через мембрану против градиента концентрации, сопровождающийся затратой энергии.
Экспериментальные исследования, проведенные Adibi S.A. (1979), Воиновой Р. (1997) дали возможность утверждать, что пептиды транспортируются эпителием тонкого кишечника с помощью механизма отличающегося от механизма транспорта свободных аминокислот. В опытах in vitro и in vivo установлено, что способность аминокислот к всасыванию в виде дипептидов и трипептидов выше, чем свободных аминокислот.
Такие же результаты получены Кушак P.M. (1981), аминокислоты входящие в состав пептидов всасываются в кровь животных и птицей быстрее, чем эквивалентные смеси соответствующих аминокислот.
По данным Зильбермана М.И. (1983), Stefan М. (1999), в транспортных процессах участвуют протеиназы энтероцитов, которые гидролизуют пептиды до свободных аминокислот, затем они связываются и переносятся специфическими белками-переносчиками.
В опытах по изучению скорости переноса ПКД (Фурман Ю.В., 2001) установлено, что скорость пассивного переноса молекул протеиновой кормовой добавки через стенку кишечника птицы было выше, чем рыбной и мясокостной муки в 1,8 и составила 313 мг/час. Это объясняется тем, что молекулярная масса пептидов белковой добавки составляет от 600 до 1200 даль-тон. Молекулярная масса белков мясокостной и рыбной муки значительно выше и составляет от 4000 до 10000 дальтон. Это обуславливало лучшую усвояемость протеиновой кормовой добавки по сравнению с известными кормами.
Белки, прежде чем попасть в тонкий отдел кишечника подвергается гидролизу пищеварительными ферментами в желудке и двенадцатиперстной кишке. Как полагает Супрунов О.В. и др. (1997) 30-50% протеина корма под действием желудочного сока расщепляется в желудках птицы до низкомолекулярных соединений главным образом полипептидов.
В желудке птицы корм находится, по данным Архипова А.В. и Топоровой Л.В. (1984), 1-3 часа, это время во многом зависит от таких факторов, таких как объем, качество, плотность кормовой массы, осмотическое давление и других.
Наивысшая секреторная функция желудка кур наблюдается при наличии 15-22% переваримого протеина в рационе. При уменьшении количества протеина в рационе до 10% и особенно при значительном повышении его до 26-30% эта функция желудка снижается (Георгиевский В.И., 1979).
Эвакуация переваренных кормов из желудка имеет большое значение, поскольку этот механизм регулирует в большой степени продвижение питательных веществ в тонкий кишечник, где происходит их всасывание (Meg-gisonP.A., 1980).
В тонком отделе кишечника, особенно в тощей и подвздошной завершается расщепление белков до пептидов и аминокислот, лишенных видовой специфичности и способных к всасыванию. Количество аминокислот в корме-вызывает сложные изменения в белковом обмене организма птицы. Эти изменения не ограничиваются чисто количественными сдвигами в использовании азота и всего протеина, а носят более сложный характер, обусловленный, с одной стороны специфическими метаболическим действием каждой аминокислоты в отдельности и определенным взаимодействием их в различных комбинациях в полной смеси. На белковый обмен, в свою очередь, влияет весь комплекс питательных и биологически активных веществ (Aparecido S.M. et al., (1997), Akemi Y. (1997), Стивен Л. (1998).
Внутриклеточный раствор в клетках высших организмов по своему химическому составу отличается от наружной среды: внутри клетки содержится около 150 ммоль-л"1 калия и 26 ммоль-л" натрия. Напротив, внеклеточный раствор содержит около 5 ммоль-л"1 калия и 140 ммоль-л"1 натрия. Потенциальная энергия, запасенная в градиентах ионов натрия и калия по обеим сторонам мембраны, используется для проведения возбуждения по нервному волокну, а также при всасывании Сахаров и аминокислот в тонком отделе кишечника, который сопряжен с транспортом натрия. Пассивный транспорт натрия и калия через цитоплазматическую мембрану (по электрохимическому градиенту) приводит к выравниванию концентраций этих ионов внутри и снаружи клетки (КагаваЯ., 1985).
Калий является одним из основных внутриклеточных катионов, необходимых для деления, дифференцировки и роста клеток (Lubin М., 1964; Adler S. et al., 1977; Smith P.L., Me Cabe R.D., 1984). В раннем онтогенезе содержание К+ в различных тканях (скелетных мышцах, подкожной клетчатке, печени, селезенке) достоверно выше, чем в аналогичных тканях взрослых животных (Айзман Р.И., Великанова Л.К., 1978; Соколова М.М., 1981; Вели-канова Л.К. и др., 1997).
Материалы и методы
Исследования проведены в 1992...2011 г.г. на животных птицефабрик «Курская», «Красная поляна», «Юбилейная», а также в животноводческих хозяйствах Курской области. Лабораторные анализы выполнялись на кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», в биохимической лаборатории кафедры безопасности жизнедеятельности в техносфере ФГОУ ВПО «Курского института социального образования (филиал) РГСУ», на кафедры органической и биологической химии ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия».
Объем исследований представлен в табл. 1. На рис. 1 представлена общая схема исследований. Для решения поставленных задач: 1. Кровь для исследований брали у цыплят-бройлеров кросса «ISA» в 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте, у цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» в 1, 15 и 60 суточном возрасте из вен шеи после умерщвления декапитацией, и из подкрыльцовой вены. Кровь стабилизировали средой Алсвера. У свиней кровь отбирали из вены хвоста путем надрезания его вентральной части, у крупного рогатого скота — из яремной вены. Кровь стабилизировали гепарином из расчета 4-6 единиц на 1мл крови. Стабилизированную кровь в термосе со льдом (+4С) доставляли через 20-30 мин в лабораторию, для последующего анализа. Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования в рефрижераторной центрифуге (+4...10С) в течение 30 мин при 3000 оборотах. Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическим раствором. 2. Печень, почки, фрагменты скелетной мускулатуры и сердце брали у цыплят кросса «ISA» в 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте, у цыплят кросса «Бройлер-6» в 1, 15 и 60 суточном возрасте, в количестве 2-5 г и сразу же помещали в термос со льдом для транспортировки в лабораторию. 3. Исследования влияния кормовых добавок проводили на четырех группах цыплят кроссов «Бройлер-6» и «ISA». Из суточных цыплят каждого кросса живой были сформированы по четыре группы 100 голов в каждой: три группы опытные и одна - контрольная. Птицу содержали в групповых клет ках, плотность посадки, фронт кормления и поения, а также санитарно гигиенические условия содержания птицы соответствовали современным ре комендациям. Кормление экспериментальных цыплят проводили комбикормами с пониженным уровнем протеина, в 100 г которых содержалось 18-20 % сырого протеина и 295-310 ккал обменной энергии. Для доведения уровня протеина в комбикорме до рекомендуемых норм использовали протеиновую кормовую добавку из отходов кожевенного производства (опытные группы 1 и 2), мясокостную муку и сухое обезжиренное молоко (опытные группы 3 и 4). Схема проведения опытов и дозы даваемых препаратов представлены в таблице 2. Питательность рационов цыплят групп опыта представлена в таблице 3. 5. В сыворотке крови исследовали содержание общего белка на рефрактометре RFL-1, концентрацию общего кальция, неорганического фосфора устанавливали с использованием наборов «Био-Ла-Тест» фирмы «Лахема» с последующим спектрофотометрированием, фракции белка методом нефелометрии и электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (Кондрахин И.П., 1985, 2004; Симонян Г.А. идр., 1995). Биохимические исследования: 1. Субклеточные фракции (ядра, митохондрии, лизосомы) выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующим двухкратным промыванием каждой фракции в 50 - мМ трис-HCl буфере (рН 7,4) по методике Chauveau J. et al.(1956). 2. Выделение ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров.
Для изучения АТФаз, локализованных в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов птиц нами был разработан метод выделения этих мембран.
Известные методы выделения биомембран имеют определенные недостатки. Так методы, разработанные Seligy V., Miyagi М. (1969) и Шкорбатова Ю.Г. и Шахбазова В.Г. (1982, 1992) предполагают для разрушения цитоплазматических мембран эритроцитов использование детергентов (сапонин, тритон Х-100), что приводило по нашим данным к разрушению не только цитоплазматических, но и ядерных мембран. Метод выделения ядер из тканей Шово и др. (Chauveau J., Moule Y., Rauiller С, 1956), основан на гомогенизации ткани ножевым гомогенизатором с последующим градиентным центрифугированием в растворе сахарозы, оказался неприемлем вследствие полного разрушения, как цитоплазматической мембраны, так и ядер эритроцитов, и невозможности их дифференцировать центрифугированием. Использование
метода получения теней эритроцитов млекопитающих Keeton K.S., Kaneko I.I. (1972) путем гемолиза эритроцитов дистиллированной водой приводило в наших опытах к агглютинации мембранных структур.
Учитывая вышеизложенное, нами для выделения мембран эритроцитов и ядер был выбран метод замораживания-оттаивания в растворе сахарозы, содержащем 50 ммоль-л"1 TpHC-H2S04 буфер (рН 7,4) с последующим центрифугированием 30 мин при 1000 об-мин"1.
Результаты собственных исследований
Анализ рисунка показывает, что в физиологическом растворе скорость переноса была постоянна и практически линейно возрастала во времени. Это по нашему мнению связано с пассивным переносов веществ через мембранные структуры.
В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации скорости переноса пептидов от независимых факторов. Скорость переноса веществ на 71% (Р 0,05) детерминирована временем опыта и на 27% (Р 0,05) добавлением в раствор энергетических метаболитов.
С целью установления степени влияния ионов Na , К и Mg на активность АТФазы был проведен однофакторный дисперсионный анализ. В качестве назависимой переменной была определена активность АТФазы при наличии в среде инкубации соответствующего иона. За нулевую точку отсчета принимали активность фермента в среде без добавления ионов. В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности фермента от независимого фактора.
Активность АТФазы была на 76,5% детерминирована ионами магния, на 96,5% ионами натрия и на 47,6% ионами калия.
Для оценки силы влияния комбинаций ионов на АТФазную активность был проведен однофакторный дисперсионный анализ. В качестве независимой переменной был определен ионный состав среды инкубации. За нулевую точку отсчета принимали активность фермента в среде без добавления ионов. В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности фермента от независимого фактора. Активность АТФазы на 92% детерминирована (Р 0,05) добавлением в среду инкубации ионов Mg2+, на 98% добавлением ионов К+, Mg2+ и на 99% - ионов Na+, Mg2+ и Na+, К+, Mg2+.
Полученные результаты указывают на то, что ионы натрия играют основную регуляторную роль в активности фермента.
В связи с тем, что истинным субстратом АТФаз является комплекс
9-4 Mg -АТФ ионы магния так же оказывали существенное воздействие на активность АТФазы. В то же время ионы калия проявляют наименьшее влияние на активность фермента.
Анализ этих данных позволяет предположить, что величина транспорта веществ, а, следовательно, и активность АТФазы существенно зависит от количества натрия и магния в плазме крови. Таким образом, избыток или недостаток этих ионов в кормах цыплят-бройлеров может отражаться на уровне межклеточного обмене веществ, вызывая его существенные нарушения.
В связи с тем, что в ряде литературных источников (Р.А.Степанян, А.А.Симоняна, 1983; Ю.В.Фурман, 1991, 2001) показано, что применение уа баина (строфантина G) не вызывает существенного подавления активности АТФазы эритроцитов птиц, мы провели изучение влияния строфантина-К на данную АТФазу.
Строфантин G и К - алкалоиды, выделенные из семян тропических лиан Strophanthus gratus и Strophanthus kombe соответственно. Строфантин К отличается по химической структуре от строфантина G по углеводной части соответственно b-D-глюкоза (или b-D-цимароза) и a-L-рамноза.
Изучение влияния ионов Na+, К+, Са2+ и НСОэ" на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров суточного возраста (табл. 5.) показали, что АТФазная активность цитоплазматических мембран эритроцитов достоверно выше, чем ядер, за исключением НСОз -АТФазы ядер, которая была достоверно выше активности этого фермента цитоплазматических мембран.
Дисперсионный анализ показал, что ионы Na+ и К+ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, ионы Са2+ - на 87% и НС03" анион - на 96% (Р 0,01). Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na+,K+ и Са2+ (Р 0,05) и была детерминирована ионами НСОз" на 96% (Р 0,01).
С целью выяснения степени влияния ионного состава среды инкубации и возраста на активность АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ (табл. 6). В качестве независимых переменных были определены: А - возраст цыплят - 10, 20, 30 и 40 суток, Б - ионный состав среды. За нуле-вую точку отсчета принимали активность Mg -АТФазы в контрольной группе.
В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности ферментов от независимых факторов. Наибольшее влияние на активность Na+, К+- и Са2+-АТФаз цитоплазматических мембран и ядер оказывал возраст цыплят. Изменение ионного состава среды оказывало различное влияние на АТФазы, локализованные в цитоплазматической и ядерной мембране. АТФазная активность цитоплазматической мембраны эритроцитов была на 34,5% детерминировали ионами Na+, К+, на 12,9% - ионами Са2+ и на 52,3% - ионами НСОз". В то же время ионы Na+, К+ и Са2+ практически не влияли на АТФазную активность ядер, а анион НСОз" детерминировал ее на 84,9%. Это, по-видимому, связано с отсутствием в ядерных мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров Na+,K+- чувствительной АТФазы. Высокий уровень НСОз -АТФазы ядерных оболочек и цитоплазматиче-ских мембран можно объяснить усиленными энергетическими процессами, происходящими в эритроцитах цыплят суточного возраста.
В связи с вышеизложенным, нами в дальнейших исследованиях для определения активности АТФаз был выбран метод Иващенко А.Т. и др. (1981). Активность Mg -АТФазы определяли в 50 ммолъ-л трис-Н2804 буфере (рН 7,4) содержащем 60 ммолъ -л 1 NaCl, 2 ммолъ -л 1 АТФ и 2 ммолъ -л"1 MgCl2. Активность Na+, К -АТФазы измеряли в той же среде, заменяя 15 ммолъ-л" NaCl на 15 ммолъ-л КС1. Са -АТФазную активность определяли, внося в среду 5x10"4 моль-л1 СаСЬ. Уровень НСОз -АТФазной активности оценивали по приросту неорганического фосфата при замене 30 ммолъ-л 1 NaCl на 30 ммолъ-л 1 NaHCC 3. Влияние ПКД и сукцината на активность АТФаз цитоплазматиче-ских мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA».
