Введение к работе
1. Актуальность темы.
Известно, что воздействие физических и химических факторов окружающей среды на организмы животных и человека в малых и умеренных дозах могут быть причиной изменений в геноме соматических клеток тканей, которые приводят к мутационным и канцерогенным нарушениям. В связи с тем, что в настоящее время широкое использование источников ионизирующих излучений и ядерных технологий в различных областях производственной деятельности человека приводит к облучению в низких дозах существенной доли популяции людей, изучение молекулярных механизмов формирования последствий действия ионизирующей радиации (ИР) на организм млекопитающих и создание методов биомониторинга эффектов радиации является одной из актуальных задач радиационной биофизики.
Подавляющее большинство исследований радиационно-индуцированных изменений в генетическом материале клетки основаны на анализе изменений параметров ядерной ДНК. Но, благодаря развитию методической базы исследований в области молекулярной биологии и радиационной биофизики, сформировалось общее теоретическое представление, что для процессов пострадиационного восстановления клеточного ядра и других компонентов клетки чрезвычайно значимы процессы, контролируемые митохондриями. Функционирование этих органелл обеспечивает основную часть энергопотребления клеток в виде АТФ. Нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК кодирует полипептиды системы «дыхательной цепи» митохондрий.
Некоторые особенности делают митохондриальный геном более чувствительной мишенью не только для активных форм кислорода (АФК), генерируемых в самих митохондриях, но и для внешних повреждающих агентов. Все это способствует формированию в мтДНК нарушений с более высокой частотой, чем в яДНК. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог, это влечет за собой нарушение множества энергозависимых
путей клеточного метаболизма. Возникает состояние «митохондриальной дисфункции», с которой связаны активация клеточной гибели и ослабление функций тканей, развитие дегенеративных процессов, «митохондриальных» патологий, включая нейродегенеративные, нейромышечные и ишемические заболевания. Как показывают результаты исследований, в культивируемых клетках после воздействия окислительных агентов, наряду с повреждением мтДНК наблюдается активация биогенеза митохондрий и увеличение числа копий мтДНК. Возможно, с репликацией копий мтДНК, содержащих повреждения, связано возникновение в митохондриальном геноме делеций разного размера и закрепление в нем точечных мутаций. Формирование больших делеций приводит к утрате некоторых генов и, как следствие, к определенному дефициту белков цепи переноса электронов. Вместе с тем сведения о формировании таких нарушений мтДНК как делеции в клетках тканей человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию на уровне целого организма, в литературных источниках ограничены, хотя проблема является чрезвычайно актуальной.
Цель н основные задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось исследование изменения общего количества копий и содержания копий мтДНК с делениями в клетках тканей и плазме крови мышей после воздействия ионизирующей радиации. Были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать изменение общего количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках митотически активной ткани (селезенки) и постмитотической ткани (головного мозга) мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.
-
Определить уровень копийности мтДНК с большими делениями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.
-
Изучить динамику изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.
Научная новизна и практическое значение работы.
Впервые в исследованиях на уровне целого организма получены прямые данные по радиационной активации репликации мтДНК. Выяснено, что такие параметры как доля животных с делециями и доля копий мтДНК с делециями в тканях облученных животных зависят от дозы облучения. К концу месячного пострадиационного срока происходит снижение уровня делегированных копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных животных. Показано, что ИР вызывает увеличение количества копий мтДНК с делециями в плазме крови облученных животных, и это увеличение совпадает по времени с уменьшением количества делегированной мтДНК в тканях. В митохондриалыюм геноме мышей выявлена делеция размером 5914 п.о.
Результаты исследования изменения копийности мтДНК и формирования делеций в клетках тканей облученных в экспериментах животных дополняют знания о механизмах развития лучевой реакции организма в разные пострадиционные сроки. Использованные методические подходы могут быть применены для разработки тест-систем для оценки поврежденности тканей организма у профессионалов предприятий ядерно-энергетического комплекса, подвергшихся облучению в радиационных авариях, у населения загрязненных радионуклидами районов, а также в клинической практике при использовании радиотерапии.
Основные положения, выносимые ка защиту. В пострадиационный период в клетках тканей головного мозга и селезенки мышей, подвергнутых воздействию ИИ наблюдается активация репликации мтДНК, которую можно рассматривать как развитие компенсаторной реакции на дефицит энергии, возникшей в результате разрушения целых молекул мтДНК. Облучение мышей в дозах 2 и 5 Гр сопровождается зависимым от дозы повышением содержания копий мтДНК с делециями. Увеличение их количества в плазме крови облученных животных позволяют предполагать, что такие копии мтДНК элиминируются из тканей облученных животных в пострадиационный период.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены ка Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005 г.), на 11-й школе конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007), н 3-й Всероссийской научно-технической Интернет-конференции «Современны проблемы экологии и безопасности» (Тула,2007) и на VI Съезде по радиационны. исследованиям (Москва, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в журналах из списка ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на &_ страницах машинописного текста, содержит .J* таблицы и/йэисунков. Библиография включаеъЗДисточников литературы. 2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Материалы и методы
