Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные методы терапии онкологических заболеваний: химио- и радиотерапия в комплексном лечении онкологических больных 14
1.2. Побочные эффекты химио- и радиотерапии и способы их коррекции 20
1.2.1. Основные ограничения применения противоопухолевых препаратов и радиотерапии в лечении онкологических заболеваний 20
1.2.2. Влияние противоопухолевой терапии на систему иммунитета 21
1.2.3. Нейротоксичность как специфическое осложнение противоопухолевой терапии 22
1.2.4. Эффект противоопухолевой терапии на систему кроветворения 25
1.3. Роль активных форм кислорода, как основного медиатора токсических эффектов при химиотерапии и лучевом воздействии 26
1.4. Роль системы глутатиона при химиотерапии и лучевом воздействии 29
1.5. Применение антиоксидантов в онкологии 32
1.6. Модифицированные антиоксиданты - гликозиды витамина С (AAG) и витамина Е (TMG) 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Экспериментальные животные 39
2.2. Препараты, используемые в работе 41
2.3. Дизайн исследования 43
2.4. Методы исследования 45
2.5. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 50
3.1 .Оценка влияния гликозидов витамина С и витамина Е на эффективность и токсичность циклофосфана у мышей со злокачественными опухолями 50
3.1.1. Влияние гликозидов витамина С и витамина Е на терапевтическую эффективность циклофосфана у мышей с карциномой легких Льюис 50
3.1.2. Влияние модифицированных антиоксидантов в режиме монотерапии на рост и метастазирование карциномы легких Льюис 54
3.1.3. Влияние модифицированных антиоксидантов на уровень ядросодержащих клеток органов иммунитета при иммунодепрессии, вызванной введением высокой дозы циклофосфана 56
3.2. Исследование способности модифицированных витаминов снижать нейротоксичность гипоксического радиосенсибилизатора саназола 62
3.3. Влияние модифицированных антиоксидантов на показатели гемопоэза у мышей при действии гамма-облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр 72
3.4. Влияние гликозида витамина С на спонтанную пролиферацию лимфоцитов в условиях окислительного стресса in vivo и in vitro 91
3.4.1. Динамика уровня аскорбиновой кислоты у мышей в плазме крови после введения гликозида витамина С 91
3.4.2. Влияние гликозида витамина С на пролиферативную активность спленоцитов мышей, облученных в сублетальной дозе 94
3.4.3. Влияние гликозида витамина С на содержание гидроперекисей липидов в селезенке мышей при облучении в сублетальной дозе 5,6 Гр 97
3.4.4. Влияние гликозида витамина С на спонтанную пролиферацию спленоцитов мышей в условиях окислительного стресса 100
3.5. Исследование роли системы глутатиона в антитоксическом действии гликозида аскорбиновой кислоты 106
3.5.1. Изучение уровня глутатиона и его редокс состояния в спленоцитах сублетально облученных мышей, получавших гликозид аскорбиновой кислоты 106
3.5.2. Влияние гликозида аскорбиновой кислоты на уровень глутатиона и его редокс состояние в головном мозге мышей с индуцированной нейротоксичностью 114
Заключение 117
Выводы 134
Список использованной литературы 136
- Современные методы терапии онкологических заболеваний: химио- и радиотерапия в комплексном лечении онкологических больных
- Влияние гликозидов витамина С и витамина Е на терапевтическую эффективность циклофосфана у мышей с карциномой легких Льюис
- Влияние модифицированных антиоксидантов на показатели гемопоэза у мышей при действии гамма-облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр
- Изучение уровня глутатиона и его редокс состояния в спленоцитах сублетально облученных мышей, получавших гликозид аскорбиновой кислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы достигнуты определенные успехи в лечении больных со злокачественными новообразованиями, связанные с внедрением в клиническую практику новых противоопухолевых препаратов и схем их введения, созданием принципиально новых подходов на основе таргетных (специфически нацеленных на определенную мишень на клеточной мембране или в цитоплазме опухолевой клетки) препаратов (Imyanitov E.N., Hanson K.P., 2004; Sawyers C., 2004). Однако в подавляющем большинстве в качестве противоопухолевой терапии используется комплексное лечение, включающее химио-, радиотерапию и оперативное вмешательство. Химио- и лучевая терапия используются как в неоадъювантном режиме для перевода опухолевого процесса в операбельное состояние или возможности осуществления органосохранной операции, так и в адъювантном режиме с целью предотвращения рецидивирования и метастазирования (Семиглазов В.Ф. и др., 2003; Kautmann M. et al., 2006). Главным препятствием в достижении желаемого эффекта являются врожденная или приобретенная резистентность опухолей к лекарственным препаратам и лучевому воздействию, а также высокая токсичность этих воздействий, нередко ограничивающая проведение интенсивной противоопухолевой терапии (Богуш Т.А. и др., 2000; Жданова О.С. и др., 2005; Карпинская Н.П., Чубик М.В., 2006; King P., Perry M., 2001; Walker M., Ni O., 2007). Возникновение побочных эффектов при проведении химиотерапии и радиотерпии онкологических больных обусловлено самим принципом их повреждающего действия в основном на активно пролиферирующие клетки путем нарушения процессов деления или запуска апоптоза (Гольдберг В.Е. и др.,1999; Дарьялова С.Л., 2000; Гольдберг Е.Д. и др., 2001; Птушкин В.В., 2002; Поддубная И.В. и др., 2003; Удут Е.В. и др., 2008; Park S-J. et al., 2008; Chabner B.A., Roberts T.G., 2005). Поэтому эти виды противоопухолевого воздействия являются токсичными для систем, функционирование которых связано с высокой пролиферативной активностью клеток – костного мозга, иммунной системы, слизистых оболочек, детоксицирующих органов, таких как печень, почки, а также головного мозга и сердца (Богуш Т.А., Богуш Е.А. 1995; Кондратьев В.Б., Карасева Н.А., 2000; Поддубная И.В. и др., 2000; Heinrich E., Getoff N., 2000; Mackall C. et al, 1995; Sharma S. et al., 1999; Schwartz R., 2000). Побочное действие лекарственных препаратов и лучевой терапии, таким образом, связано с их низкой избирательностью, необходимостью поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, длительностью лечения.
В структуре осложнений большинства цитостатических агентов основное место занимает супрессивное влияние на костномозговое кроветворение (Гольдберг В.Е. и др., 1999; Гольдберг Е.Д, Дыгай А.М., 2001; Гершанович М.Л. идр., 2001), гепатотоксичность, приводящая к снижению противоопухолевого эффекта и увеличению токсичности препаратов, метаболизирующихся в печени (Богуш Т.А., Богуш Е.А. 1995, Mackall C. et al, 1995). Одним из специфических осложнений противоопухолевой терапии является нейротоксичность, которая характерна для производных платины (цисплатин), таксанов (паклитаксел), метотрексата (Кондратьев В.Б., Карасева Н.А., 2000; Поддубная И.В. и др., 2000, Walker M., Ni O., 2007), а также широко используемых в настоящее время целого ряда радиосенсибилизаторов (Барсуков Ю.А. и др., 2005; Heinrich E., Getoff N., 2000). При этом установлено, что снижение дозы препарата или дозы облучения вызывает также и снижение терапевтического эффекта, однако на токсичность практически не влияет (Богуш Т.А. и др., 2000). При использовании комбинации 2-х и более препаратов с целью повышения эффективности лечения токсичность полихимиотерапии возрастает (Переводчикова Н.И., Горбунова В.А., 2001; Дельгадо Ф.Г., 2002; Баранова О.Ю. и др., 2003; Богданов А.Н. и др., 2004). Достижение максимальной терапевтической эффективности цитостатических методов лечения злокачественных опухолей может быть связано с использованием новых средств, блокирующих или замедляющих развитие токсических повреждений, но не снижающих противоопухолевых свойств цитостатиков (Богуш Т.А. и др., 2000; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Немцова Е.Р. и др., 2003; Птушкин В.В., 2004). Все это делает актуальным разработку средств и способов снижения токсического действия специфического противоопухолевого лечения и защиты жизненно важных органов и тканей, способствующих высокой эффективности цитостатической терапии.
Основным механизмом повреждающего действия на нормальные клетки и ткани при химиотерапии и лучевом воздействии является избыточное накопление активных форм кислорода в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды соответственно (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). Следствием этого является повреждение функционирования системы антиоксидантной защиты (включая ее ферментативное и неферментативное звенья), нарушение иммунологических механизмов, участие которых также чрезвычайно важно в процессах детоксикации и регуляции гемопоэза (Якубовская Р.И., 2002; Aboud M. et al., 1993; Hung K. et al., 1998; Sharma S. et al., 1999).
В процессе решения данной задачи было разработано и обосновано применение большого числа различных модифицирующих воздействий, направленных на снижение токсичности и/или усиление терапевтического эффекта малотоксичных доз цитостатических и лучевых воздействий (Deng G., 2005; Kontogiorgis А.С., 2005). Среди средств, предупреждающих повреждение нормальных тканей, достаточно широко представлены природные соединения (церулоплазмин, лактоферрин), колониестимулирующие факторы (ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим, эритропоэтин) (Bauvet F. et al., 2008), тиоловые соединения (амифостин) (Богуш Т.А. и др., 2000; Немцова Е.Р. и др., 2003; Stolarska M. et al., 2006; Batista C.K.L. et al., 2007). Однако узкая направленность действия корректоров токсичности, наличие побочных эффектов или высокая стоимость ограничивают их применение (Птушкин В.В., 2004; Машковский М.Д., 2007; Othieno-Abinya N.A. et al., 2007). В качестве сопровождения химиотерапии достаточно широко используются природные антиоксиданты с неферментативным действием, в частности, -токоферол и аскорбиновая кислота (Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Немцова Е.Р. и др., 2003; Птушкин В.В., 2002; Бишоп Д.М., 1991; Fang Y-Z., et al, 2002). Показано, что защитные эффекты антиоксидантов в определенной мере селективны для нормальных клеток и могут уменьшать токсичность противоопухолевого лечения без снижения эффективности. Более того, есть данные, что антиоксиданты могут способствовать повышению эффективности химио- и лучевых воздействий (Nair C. C. K., 2001; Prasad K., 2004).
Однако, есть литературные данные о том, что антиоксиданты могут защищать и раковые клетки, снижая тем самым эффективность противоопухолевой терапии (D'Andrea G.M., 2005). Аскорбиновая кислота имеет ряд недостатков: во-первых, это достаточно нестабильное соединение, которое разрушается под действием тепла, света, ионов тяжелых металлов и при нейтральном значении pH (Птушкин В.В., 2002), и, во-вторых, способное становиться мощным прооксидантом в присутствии ионов железа или меди, что особенно нежелательно и даже опасно в клинической ситуации (Clement M.V. et al., 2001; Lesperance M.L. et al., 2002; . et al., 2003; D'Andrea G.M., 2005; Chen Q. et al. 2008). Кроме того, липофильные свойства витамина Е (-токоферола), которые обеспечивают его тропность к липидному слою клеточных мембран, существенно ограничивают радиус его действия в живой клетке, не позволяя проявлять активность в водной фазе (Brigelius-Flohe R. et al., 2002).
В последние годы создан ряд новых форм витаминов-антиоксидантов путем модификации их структуры, приводящей к изменению свойств по сравнению с указанными природными витаминами (Петрова Г.В., Донченко Г.В., 2005; Austria R. et al., 1997; Kunitsa N.I. et al., 1993; Yamamoto I. et al., 1990). Японскими учеными разработаны и изучаются оригинальные модифицированные антиоксиданты - гликозид витамина С (2-O– –D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота) (Fujinami Y. et al., 2001; Kumano Y. et al., 1998) и гликозид витамина Е (2-(-D-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) (Murase H. et al., 1997). Благодаря наличию глюкозы в своей структуре гликозид витамина Е (tocopherol monoglucosid – TMG) приобретает способность растворяться в воде (>1х103 мг/мл) и проявлять антирадикальную активность не только в липидной фазе биологических мембран, но и в цитоплазме клеток, в отличие от его прототипа -токоферола (Murase H. et al., 1998).
Экспериментальные исследования показали, что гликозид витамина С (ascorbic acid glucoside – AAG) in vitro проявляет меньшую цитотоксичность в высоких концентрациях, чем аскорбиновая кислота (Fujinami Y. et al., 2001; Muto N., Nakamura T., 1990). Кроме того, AAG более стабилен и обеспечивает накопление аскорбиновой кислоты в организме в более высоких концентрациях и, таким образом, может оказывать более выраженный защитный эффект. Одним из основных отличий в механизме антиоксидантного действия AAG по сравнению с аскорбиновой кислотой является то, что он обладает выраженным инактивирующим эффектом по отношению к высокореактивному ОН- радикалу. Это обусловлено тем, что образующиеся при взаимодействии AAG с ОН- радикалом аддукты обладают более низкой способностью к генерации АФК, в отличие от немодифицированного витамина (Mathew D. et al., 2007; Rajagopalan R. et al., 2002; El-Nahas S.M. et al., 1993).
Японскими и индийскими исследователями получены данные о том, что TMG оказывает радиопротекторное действие, эффективно защищает ДНК нормальных клеток от повреждающего действия -излучения, а также защищает нормальные ткани при действии -излучения у мышей опухоленосителей, не снижая его противоопухолевой эффективности (Satiamitra et al., 2001, 2003; Shimanskaya et al., 2001; Nair et al, 2004; Salvi V.P. et al., 2001).
Показано, что AAG защищает ткань печени от повреждающего действия гамма-излучения в эксперименте (Mathew et al, 2007), а в клинических условиях при применении до облучения у больных со злокачественными новообразованиями существенно снижает проявление таких побочных эффектов радиотерапии как тошнота и диарея (Koizumi et al., 2005).
Все вышесказанное делает целесообразным исследование эффективности названных соединений в защите жизнедеятельности и обеспечении полноценного функционирования критических органов и тканей, повреждаемых при цитостатической терапии, и механизмов действия с целью патогенетического обоснования их использования в качестве сопровождающей терапии на фоне комплексного противоопухолевого лечения. Чрезвычайно важной является проблема улучшения качества жизни онкологических больных, получающих цитостатическое лечение, за счет снижения побочных токсических реакций (Чойнзонов Е.Л. и др., 2008). При этом важное значение может иметь аспект повышения эффективности противоопухолевой терапии под влиянием антиоксидантных агентов, которые по механизму действия являются модификаторами биологических реакций и способны регулировать взаимоотношение опухоли и организма, особенно в условиях специфической антибластомной терапии (Якубовская Р.И., 2000; Rozenberg, 1999; Schrimacher P. et al., 2001; Zitvogel L., Kroemer G., 2008).
Цель исследования: изучить влияние гликозида витамина С и гликозида витамина Е на эффективность и токсические эффекты химиотерапии и лучевого воздействия и выявить механизмы их действия.
Задачи исследования:
-
Изучить способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать противоопухолевую и антиметастатическую эффективность циклофосфана у мышей с перевиваемой опухолью карциномой легких Льюис (LLC).
-
Исследовать влияние модифицированных витаминов на показатели системы иммунитета в условиях иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого цитостатика циклофосфана в высокой дозе.
-
Оценить способность гликозидов витамина С и витамина Е снижать нейротоксичность, индуцированную химиопрепаратами.
-
Изучить влияние гликозидов витамина С и витамина Е на показатели гемопоэза у мышей после рентгеновского облучения в сублетальной дозе.
-
Исследовать защитный эффект гликозида витамина С на пролиферативную активность клеток селезенки мышей при действии гамма-излучения.
-
Оценить участие системы глутатиона в защитном действии гликозида аскорбиновой кислоты в условиях окислительного стресса, индуцированного действием радиации и химиотерапии.
Научная новизна
В экспериментальных исследованиях установлено, что модифицированные витамины: гликозид витамина С и гликозид витамина Е, в сравнении с аскорбиновой кислотой и альфа-токоферолом, оказывают более выраженное действие на повышение эффективности и снижение токсичности противоопухолевой терапии.
Впервые показана способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей. Установлено, что введение AAG или TMG потенцирует антиметастатическое действие циклофосфана в низких терапевтических дозах.
Установлено, что гликозиды витамина С и витамина Е способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на тимус и селезенку у мышей, а также способствуют более быстрому восстановлению уровня лейкоцитов периферической крови и клеток костного мозга в условиях циклофосфан-индуцированной иммунодепрессии.
Получены новые данные о способности гликозидов витамина С и витамина Е снижать одно из специфических осложнений химиотерапии – нейротоксичность. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2286777 от 10 октября 2006 г “Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте”.
Впервые показано, что введение гликозидов витамина С и витамина Е мышам, облученным в сублетальной дозе, умеренно защищает клетки костного мозга и крови в острый период радиационного воздействия и стимулирует процессы восстановления кроветворения, что можно рассматривать как один из основных механизмов радиопротекторного и антитоксического действия изучаемых агентов.
Получены оригинальные данные о том, что гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации лимфоцитов в условиях окислительного стресса in vivo и in vitro.
Установлено, что защитное действие гликозида витамина С в условиях окислительного стресса, индуцированного радио- и химиотерапией, обусловлено нормализацией редокс состояния глутатиона.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Полученные результаты расширяют представление о механизмах антитоксического действия модифицированных витаминов - гликозидов витамина С и витамина Е при химиотерапии и лучевом воздействии.
Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, что позволит повысить качество жизни и эффективность лечения онкологических больных.
Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации гликозида витамина С в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями для снижения побочных эффектов химио- и радиотерапии.
Положения, выносимые на защиту:
Гликозиды витамина С и витамина Е способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном и снижать выраженность токсических проявлений химио- и радиотерапии.
В основе радиопротекторного и антитоксического действия модифицированных витаминов лежит их способность стимулировать восстановление кроветворения и функциональной активности клеток иммунной системы.
Антитоксическое действие гликозида витамина С при противоопухолевой терапии обусловлено его способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов и нормализовать редокс состояние глутатиона.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН в 2003, 2005, 2006, 2009 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V и VI конгрессе молодых ученых и специалистов “Науки о человеке” (Томск, 2004, 2005), 10, 12, 13-ой международной конференции по повышению эффективности противоопухолевого лечения “Annual meeting on the sensitization of cancer treatment”(Киото, Япония, 2004, 2006, 2007), 13 международном конгрессе по приполярной медицине “Проблемы фундаментальной и прикладной медицины” (Новосибирск, 2006), VII международной конференции “Биоантиоксидант” (Москва, 2006), 1 и 2-ой конференции японского общества по радиопротекции “Radioprotection (Human-Defense) Society” (Киото, Япония, 2007, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 2 – в центральных журналах, рекомендуемыми “Перечнем…” ВАК Минобрнауки. Получен патент на изобретение №2286777 от 10 ноября 2006 г “Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте”.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 268 источников, из них российских 81, иностранных 185. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 21 рисунком.
Современные методы терапии онкологических заболеваний: химио- и радиотерапия в комплексном лечении онкологических больных
Несмотря на безусловные достижения современной противоопухолевой терапии (радио-, химиотерапия, хирургическое вмешательство), проблема повышения эффективности лечения онкологических больных по-прежнему остается актуальной. Если оставить в стороне вопросы ранней диагностики злокачественных новообразований, которая в значительной степени определяет метод и результат лечения, главным препятствием в достижении желаемого эффекта являются врожденная или приобретенная (индуцированная) резистентность опухолей, а также высокая токсичность методов лечения, часто ограничивающая проведение интенсивной противоопухолевой терапии.
Выбор методов лечения больных злокачественными опухолями базируется на результатах уточняющей диагностики, установлении общих и местных биологических особенностей заболевания организма. К местным критериям выбора методов лечения относят: локализацию опухоли и степень нарушения функций органов, стадию или TNM, гистотип и степень дифференцировки клеток (G), анатомический тип роста опухоли. Несоблюдение этого принципа заведомо является причиной неэффективности противоопухолевой терапии.
При лучевой терапии в качестве противоопухолевого средства используют различные виды ионизирующих излучений, источниками которых служат радиоактивные изотопы и аппараты. При воздействии излучений на биологические объекты происходит ионизация и возникает цепь радиационно-химических реакций. При этом одну из основных ролей играет радиолиз воды. Цепная реакция сопровождается выходом свободных радикалов, одинаково токсичных для опухолевых и нормальных тканей [57].
Под воздействием ионизирующих излучений, как в опухоли, так и в нормальных тканях развиваются противоположные процессы — повреждение и восстановление. Успех лучевой терапии возможен лишь тогда, когда в опухоли преобладает процесс повреждения, а в окружающих ее тканях — восстановления. Реакцию любой ткани на воздействие ионизирующих излучений определяют многие факторы, среди которых основными являются: способность к репарации (восстановлению суб- и потенциально летальных повреждений), репопуляция, оксигенация и реоксигенация, и фаза жизненного цикла клеток в момент их облучения. Биологической основой использования лучевой терапии в онкологии служит так называемый терапевтический интервал, т. е. различия в степени повреждения и восстановления опухолевой и нормальной тканей при равных уровнях поглощенных ими доз [31].
Ионизирующее излучение служит эффективным средством лечения многих локализаций злокачественных опухолей. Оно применяется у 50-60% всех онкологических больных. Одним из главных условий, определяющих эффективность лучевой терапии, является максимальное повреждение опухолевой ткани при максимальном сохранении нормальных органов и тканей. От этого зависит как результат лечения, так и развитие в дальнейшем лучевых осложнений, возникающих при превышении толерантных доз для нормальных тканей. Толерантная доза зависит как от особенностей самой ткани, так и от режима облучения и объема облучаемой ткани [39, 85].
К преимуществам лучевой терапии относится возможность уничтожения опухолевой ткани при сохранении анатомической целостности органа. К недостаткам метода относятся увеличение частоты некоторых неблагоприятных осложнений и продолжительное время, необходимое для лечения. Лучевая терапия имеет свои четкие показания и противопоказания к применению. Эффект лучевой терапии зависит в основном от размеров опухоли и ее локализации. По мере увеличения опухоли в размерах вероятность эффекта лучевой терапии уменьшается. Иногда и при наличии четких показаний лучевая терапия может оказаться невозможной из-за факторов, связанных с общим состоянием организма. Они могут заключаться в общем ослаблении организма или в местных изменениях тканей, не позволяющих назначать облучение в высоких дозах [39, 57].
Также к основным ограничениям для проведения радиотерапии, относится наличие резистентных опухолей, низкая чувствительность метастазов, повреждающее влияние на нормальные ткани с высоким пролиферативным потенциалом, что особенно касается костномозгового кроветворения и связанной с этим иммунодепрессии [24, 91, 94].
Для повышения эффекта лучевой терапии применяют различные методы, направленные в основном на увеличение радиотерапевтического интервала. Наряду с использованием различных режимов фракционирования, довольно широко используют различные радиомодифицирующие агенты -радиопротекторы и радиосенсибилизаторы (кислород, производные нитроимидазола, нитротриазола, антиметаболиты, гипертермию) [28, 46, 235].
Лекарственная терапия является наиболее востребованным методом воздействия на опухолевые клетки, особенно диссеминированные, которые невозможно удалить ни хирургическим методом, ни радиотерапией [60, 95]. В схемы комбинированной терапии большинства нозологических форм рака лекарственная терапия входит в виде адьювантной и неадыовантной составляющей, способствующей уменьшению размеров первичной опухоли и снижению инвазии и метастазирования. В настоящее время при лечении большинства опухолей обсуждается не столько целесообразность и эффективность химиотерапии, сколько детали ее использования (показания к назначению конкретного противоопухолевого агента или их комбинаций, методика введения, дозы) [58, 60, 61]. В настоящее время в клинике широко применяются примерно 60 противоопухолевых препаратов. Их обычно классифицируют по механизму цитостатического действия: агенты, повреждающие матрицу ДНК, митотические яды, антиметаболиты, гормональные и антигормональные агенты, препараты смешанного действия. Многообразие противоопухолевых препаратов отражает не только возможности использования различных механизмов повреждающего действия на опухолевые клетки. В большей степени оно связано с отсутствием лекарственных средств, обладающих достаточной степенью специфичности для того, чтобы излечить рак [31].
Среди причин, ограничивающих применение цитостатической терапии злокачественных опухолей (наличие химиорезистентных опухолей, низкая чувствительность метастазов и т. п.), большое значение имеет повреждение противоопухолевыми агентами нормальных тканей с высоким пролиферативным потенциалом [65]. Увеличение доз противоопухолевых агентов и спектра используемых химиопрепаратов иногда позволяет преодолеть их фазовоспецивичность и множественную лекарственную устойчивость опухоли, что приводит к повышению результативности лечения. Однако наличие выраженных побочных эффектов часто приводит к прекращению лечения (или отсрочке применения очередного курса противоопухолевых препаратов) или снижению дозы цитостатического агента.
Повреждение опухоли цитостатиками реализуется либо путем прямого взаимодействия с ДНК, либо через ферменты, ответственные за синтез и функционирование ДНК. Однако подобный механизм не обеспечивает истинную избирательность противоопухолевого действия, поскольку уязвимыми для поражения онколитами являются не только злокачественные, но и пролиферирующие клетки нормальных тканей. В этом состоит суть ограничения возможностей химиотерапии цитостатиками и основа для развития осложнений [15, 187].
Следует отметить, что высокая токсичность цитостатиков, ограничивающая проведение интенсивного лекарственного лечения, а, следовательно, и достижение максимально возможного лечебного действия противоопухолевых средств, является одним из значимых препятствий на пути повышения эффективности химиотерапии злокачественных новообразований [10].
Основаниями для разработки новых подходов к терапии рака являются открытия последних десятилетий в молекулярной и клеточной биологии, касающиеся выявления онкогенов, опухолесупрессорных генов, пептидных факторов роста (цитокины), а также ключевых механизмов генной и клеточной регуляции [2, 19, 71, 139, 193].
Так, одно из направлений современной противоопухолевой терапии заключается в ингибировании в опухолевой клетке жизненно важных процессов, способствующих метастазированию. В качестве терапевтических средств используются ингибиторы ангиогенеза, антагонисты факторов роста и их рецепторов, антиадгезивные молекулы и т.п. [148, 198].
Элиминация опухолевых клеток в процессе их миграции в сосуды и циркуляции по ним во многом зависит от согласованности взаимодействия систем свертывания крови и фибринолиза, кининообразования, ренинангиотензивной и простагландиновой систем. Их нормальное взаимодействие между собой и с эндотелием сосудов препятствует прикреплению опухолевых клеток к эндотелию и создает тем самым невозможность выхода в кровоток и/или из него, предотвращая диссеминацию опухоли [126, 205]. Получены обнадеживающие результаты, свидетельствующие о замедлении роста опухоли и снижении темпов метастазирования при использовании антиангиогенных препаратов [151]. Экспериментально показано, что снижение возникновения метастазов могут вызывать непрямые коагулянты, антиагреаганты и т.п. [183, 185].
Влияние гликозидов витамина С и витамина Е на терапевтическую эффективность циклофосфана у мышей с карциномой легких Льюис
Способность модифицированных антиоксидантов модулировать эффективность цитостатической терапии экспериментальных злокачественных новообразований изучали на мышах с гематогенно-метастазирующей в легкие карциномой Льюис (Lewis lung carcinoma), полученной из банка опухолевых штаммов РОНЦ РАМН (г. Москва). Данная опухолевая модель является адекватной для изучения противоопухолевой и антиметастатической активности препаратов [49, 50].
Двукратное введение циклофосфана с интервалом 96 ч является одной из стандартных общепринятых схем в терапии экспериментальных злокачественных опухолей, в частности LLC [55]. При этом показано, что противоопухолевая и антиметастатическая активность циклофосфана в дозе 100 мг/кг при двукратном введении выше, чем при других схемах введения с достижением той же суммарной дозы (200 мг/кг) [55]. В наших экспериментах применение ЦФ в дозе 120 мг/кг приводило к торможению роста опухоли на 34,8 %, (таблица 2) и практически полному подавлению метастазирования (ТРМ составило 99,8 %; ИИМ - 99,9 %). Клеточность селезенки при этом значительно снижалась, что свидетельствует о проявлении токсического действия циклофосфана (таблица 2).
Снижение дозы цитостатического препарата зачастую влечет за собой уменьшение противоопухолевого и антиметастатического эффекта терапии [10, 63, 70] и не оказывает выраженного действия на проявления токсических эффектов. Действительно, введение циклофосфана в дозе 60 мг/кг не оказывало значимого влияния на рост первичного опухолевого узла (ТРО составило 8,7 %), однако снижало количество и площадь метастазов по сравнению с контрольной группой, индекс ингибиции метастазирования составил 74,3 %, (р 0,05), торможение роста метастазов 71,6 %, (р 0,05). Клеточность селезенки при этом статистически значимо не отличалась от контрольной группы животных.
Введение TMG совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг приводило к торможению роста опухоли на 15,2 % и к более выраженному торможению роста (ТРМ - 91,5%) и числа (ИИМ - 83%) метастазов, чем в группе, получавшей только цитостатик (ТРО составило 8,7 %, ТРМ - 71,6 %, ИИМ -74,3 %) (р 0,05).
Введение AAG совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг не оказывало влияния на рост первичной опухоли, но приводило к более -выраженному торможению роста метастазов (р 0,05), при этом частота и интенсивность метастазирования значимо не отличались от группы, получавшей только циклофосфан в дозе 60 мг/кг.
Введение модифицированных витаминов совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг приводило к снижению токсического действия циклофосфана, что проявлялось в нормализации показателей клеточности селезенки (таблица 2).
У мышей, получавших в сочетании с ЦФ аскорбиновую кислоту или а-токоферол не выявлено значимых различий в показателях, по сравнению с группой животных, получавших только циклофосфан в дозе 60 мг/кг (таблица 2).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что антиметастатическая эффективность терапии при введении циклофосфана в дозе 60 мг/кг совместно с антиоксидантами TMG и AAG близка по величине к действию одного циклофосфана в дозе 120 мг/кг. Это свидетельствует о способности TMG и AAG усиливать терапевтическое действие малой дозы цитостатика в отношении метастазов до эффекта максимальной терапевтической дозы.
Известно, что основной причиной смертности от злокачественных новообразований является диссеминация процесса, поэтому с самого начала развития направления по использованию модификаторов биологических реакций в онкологии главной целью было ингибирование метастазирования опухоли. В основе торможения метастатического процесса важную роль играет иммунная система. В последние годы убедительно показано, что иммунная система в синергичном режиме вовлекается в эрадикацию опухолевых клеток при цитостатической терапии [172, 270]. Это происходит в связи с модификацией опухолевых клеток цитостатическими препаратами, способствующей активации специфического иммунного ответа. Поскольку совместное применение циклофосфана с TMG или AAG более выражено ингибирует метастазирование, но не влияет на первичную опухоль, можно полагать, что в данном случае имеет место не прямое действие цитостатика на опухолевые клетки, а торможение метастазирования, опосредованное через иммунную систему. Известно, что уровень витаминов С и Е в крови является важным параметром, определяющим полноценное функционирование иммунной системы, которое нарушается при их недостатке [176, 209, 263]. Применение аскорбиновой кислоты и а-токоферола при токсических поражениях организма способствует увеличению числа лимфоцитов в периферической крови, усиливает гуморальный иммунный ответ, повышает пролиферативный ответ лимфоцитов в реакции бласттрансформации, а также стимулирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа, то есть оказывает иммуномодулирующее действие. Модифицированные витамины обладают подобным действием, о чем свидетельствуют наши данные об их способности защищать клетки селезенки от токсического действия циклофосфана (таблица 2), и о способности TMG повышать уровень спонтанной и ФГА - стимулированной пролиферации лимфоцитов [35]. Все это указывает на возможный вклад эффекторов иммунной системы, активированных под влиянием TMG и AAG, в ингибицию процесса метастазирования.
Таким образом, на модели перевиваемой опухоли LLC показана способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать эффективность терапии малой дозой циклофосфана в отношении метастазов.
Влияние модифицированных антиоксидантов на показатели гемопоэза у мышей при действии гамма-облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр
Ионизирующая радиация, используемая при лечении онкологических больных, оказывает повреждающее действие на нормальные ткани и вызывает комплексный ответ на клеточном и молекулярном уровнях [5, 210]. Известно, что одной из наиболее радиочувствительных является кроветворная система, поражение которой может оказаться критическим для выживания организма [74]. Оценка ее состояния может быть использована в качестве своеобразного индикатора тяжести поражения организма ионизирующим излучением и дать представление о механизмах действия радиозащитных агентов.
На сегодняшний день существует множество данных по использованию как синтетических, так и натуральных компонентов, способных оказывать защитное действие на нормальные клетки и ткани после воздействия радиации. Они включают сульфгидрильные компоненты, антиокисданты, растительные экстракты, иммуномодуляторы и другие агенты [210]. Среди широкого спектра модифицирующих воздействий достаточно широко используются антиоксиданты с неферментативным действием, которые в основном представлены витамином А, витамином Е (а-токоферолом) и витамином С (аскорбиновой кислотой), которые обладают способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в тканях [104, 112, 122]. Показано, что при воздействии радиации, витамин Е защищает костный мозг и повышает выживаемость животных. Однако липофильность токоферола (его локализация только в мембранах клеток) ограничивает радиус его действия в живой клетке.
Аскорбиновая кислота обладает выраженными антиоксидантными свойствами: она способна инактивировать свободнорадикальные формы кислорода, поддерживать в восстановленном состоянии SH-группы белков и низкомолекулярных тиолов. Имеются также данные об участии витамина С в процессах клеточного деления [179, 220].
Однако аскорбиновая кислота имеет ряд существенных недостатков: это достаточно нестабильное соединение, разрушается под действием тепла, света [154], а в присутствии ионов металлов переменной валентности она оказывает прооксидантное действие [132]. Указанные недостатки отсутствуют в модифицированных формах витамина С и витамина Е - AAG и TMG, которые обладают высокой антиоксидантной активностью.
Поэтому мы изучили влияние модифицированных антиоксидантов (AAG и TMG) на клетки крови при облучении мышей С57В1/6 рентгеновскими лучами. Для этого животных подвергали общему однократному рентгеновскому облучению в сублетальной дозе 5,6 Гр. AAG вводили за 60 минут до облучения в дозе 100 мг/кг, TMG непосредственно сразу после облучения в дозе 600 мг/кг. В течение 24 дней после облучения наблюдали за изменением клеточного состава периферической крови и костного мозга в соответствии с общепринятыми рекомендациями [20].
Влияние гликозида витамина Е (TMG) на показатели гемопоэза у мышей после облучения в сублетальной дозе
Гликозид витамина Е - TMG (2-(а-В-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) благодаря наличию глюкозы в его структуре и короткого углеродного хвоста, в отличие от а-токоферола, приобретает способность растворяться в воде и проявлять антирадикальную активность не только в биологических мембранах (липидной фазе), но и цитоплазме клеток [103]. Согласно результатам, полученным Shimanskaya R. et al. (2001) [242], при летальной дозе облучения 6,6 Гр введение TMG в концентрации 600 мг/кг увеличивало выживаемость животных до 60 %.
Повышение выживаемости экспериментальных животных после облучения является следствием того, что TMG способен защищать основные системы организма, такие как костный мозг, желудочно-кишечный тракт и кожные покровы. Satyamitra et al. [268] показали, что введение животным TMG в концентрациях 400 или 600 мг/кг предотвращает образование микроядер и хромосомных аберраций в костном мозге у облученных мышей [178, 268], что свидетельствует о защите костного мозга при облучении. Важными являются данные Nair С. К. К. [211] о том, что использование TMG у мышей с экспериментальными опухолями, подвергавшимися лучевому воздействию, не снижало противоопухолевого эффекта, но существенно защищало нормальные ткани (печень, почки).
Все выше сказанное служит предпосылкой для исследования влияния TMG на гемопоэз при облучении животных в сублетальной дозе.
Изменение общего количества лейкоцитов крови является наиболее часто используемым показателем, характеризующим нарушение кроветворной функции при острой лучевой патологии [27, 54].
Наибольшая степень лейкопении была отмечена на 3-е сутки после облучения. Было показано, что количество лейкоцитов на 3-й день после облучения значительно уменьшается (рисунок 5) как в группе животных подвергшихся только облучению до 3,1±2,6х106/мл (р 0,05), так и в опытной группе, которой сразу после облучения вводили TMG 4,4±2,3х106/мл (р 0,05) по сравнению с группой необлученных животных 15,0±2,0х10б/мл.
Изменение процентного отношения уровня нейтрофилов и моноцитов у мышей в обеих группах отражает изменения общего содержания лейкоцитов в периферической крови (данные не представлены).
Известно, что лимфоциты составляют наибольшую долю клеток крови у мышей и являются менее устойчивыми к действию радиации по сравнению с другими клетками крови [27, 54]. Предварительное введение гликозида витамина Е приводило к значительной защите уровня лимфоцитов в периферической крови (рисунок 4). Абсолютное и процентное содержание лимфоцитов у мышей с TMG на всем протяжении исследования, было значимо выше (р 0,05), чем в группе облученных животных, получавших физиологический раствор, а начиная с 8-х суток не отличалось от показателей у необлученных животных.
Начало восстановления содержания лейкоцитов в периферической крови у мышей во всех исследуемых группах отмечается на 8-е сутки, при этом, уровень лейкоцитов в группе животных, которые получали TMG, был статистически значимо выше (р 0,05), чем в группе только облученных животных на протяжении всего исследования и восстанавливался до исходных значений на 20-е сутки эксперимента (рисунок 5).
Опустошение костного мозга наблюдается с первых дней постлучевого периода, причем интенсивность его была различной у контрольной и опытной групп животных (рисунок 6). В первую неделю после облучения происходило существенное снижение клеточности костного мозга у животных всех исследуемых групп. Минимальное количество миелокариоцитов наблюдалось на 8-й день, причем в группе животных, которым после облучения вводили TMG, количество миелокариоцитов было в 2 раза выше (0,13±0,03 клеток/бедро xlO6), чем в группе облученных животных, получавших физиологический раствор (0,07±0,02 клеток/бедро xlO6) (р 0,05). Снижение клеточности костного мозга в основном связано со снижением количества лимфоидных клеток (рисунок 6, 7), нейтрофильных гранулоцитов и эритроидных клеток. Введение гликозида витамина Е приводило к выраженной защите лимфоидных клеток, их абсолютное количество на 3-е сутки эксперимента было значимо выше (0Д9±0,08 клеток/бедро xlO6), чем в группе только облученных животных (0,08±0,03 клеток/бедро х10б) (р 0,05).
Изучение уровня глутатиона и его редокс состояния в спленоцитах сублетально облученных мышей, получавших гликозид аскорбиновой кислоты
Ключевая роль в защите системы кроветворения при окислительном стрессе отводится системе глутатиона [41]. Восстановленный глутатион является основным модулятором окислительно-восстановительного статуса в клетках и является критическим фактором выживания клеток [118]. В норме содержание окисленной формы глутатиона (GSSG) в тканях и плазме крови млекопитающих поддерживается на уровне, во много раз более низком, чем для восстановленной формы трипептида (GSH) [57]. Окислительный стресс может привести к существенному накоплению GSSG в печени и выбросу его в кровь. Повышенное содержание GSSG в плазме крови, в свою очередь, может вызвать окисление тиоловых групп белков крови и их инактивацию [142,210].
Глутатион играет важную роль в защите различных типов клеток и, в первую очередь, клеток иммунной системы, от повреждающего действия ионизирующей радиации [141, 155, 188, 223]. С помощью восстановленного глутатиона осуществляется детоксикация Н2О2 и гидроперекисей липидов, которые образуются при реакции активных радикалов кислорода с ненасыщенными жирными кислотами. В экспериментах in vivo и in vitro установлено, что глутатион и предшественники его синтеза снижают повреждающее действие окислительного стресса и ионизирующей радиации [156]. Необходимо также подчеркнуть, что от действия наиболее опасных гидроксильных радикалов в организме нет ферментативной защиты, и все функции по обезвреживанию этих частиц осуществляют низкомолекулярные (неферментативные) антиоксиданты, среди которых ключевую роль играет глутатион. Эффективными модификаторами токсичности противоопухолевого лечения являются тиоловые соединения, которые, повышая уровень SH-групп в организме, могут увеличивать детоксикацию активных метаболитов, а также токсичных реактивных продуктов их воздействия на клетки. Однако высокая стоимость (амифостин), неэффективность при использовании ряда цитостатиков, необходимость поддержания высокой дозы в течение длительного времени (месна) ограничивают их применение. Недавние исследования показали, что аскорбиновая кислота играет важную роль в поддержании нормального уровня глутатиона в условиях окислительного стресса [264].
Нами показано, что введение AAG за 1 час до облучения, существенно подавляет развитие окислительного стресса, защищает кроветворные клетки от повреждающего действия гамма-излучения и циклофосфана, а также снимает проявления саназол-индуцированной нейротоксичности (смотри гл. 3.1, 3.2 и 3.3). Мы предположили, что в механизме защитного эффекта гликозида аскорбиновой кислоты при окислительном стрессе определенную роль играет не только его прямое антирадикальное действие, но и опосредованное влияние на свободнорадикальное окисление через систему глутатиона.
В связи с тем, что AAG во всех описанных выше экспериментальных ситуациях проявляет более выраженный биологический эффект, мы провели сравнительное изучение влияния гликозида витамина С и аскорбиновой кислоты на содержание общего глутатиона, восстановленной и окисленной форм трипептида и их соотношение в спленоцитах мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе (5,6 Гр).
Было установлено, что через 12 часов после тотального воздействия ионизирующей радиации в сублетальной дозе наблюдается существенное снижение уровня общего глутатиона в клетках селезенки мышей (9,1 ±0,6 нмоль/мг белка), (р 0,05) в сравнении с группой необлученных животных (16,5±1,1 нмоль/мг белка) (таблица 7). Через сутки после воздействия гамма радиации наблюдалось дальнейшее снижение уровня общего глутатиона (6,6±0,4 нмоль/мг белка), (р 0,05) и максимальное падение этого показателя отмечалось на 3-й сутки эксперимента (4,5±0,6 нмоль/мг белка), (р 0,05) (таблица 7). Снижение уровня глутатиона в этот период обусловлено, по-видимому, значительной активацией свободнорадикального окисления, о чем свидетельствует повышенное содержание в спленоцитах его промежуточных продуктов - гидроперекисей липидов (рисунок 17).
На 14-е сутки после облучения мышей уровень общего глутатиона в клетках селезенки повышался, однако не достигал величины значения в группе необлученных животных (17,0± 0,4 нмоль/мг) и составил 11,5 ±0,4 нмоль/мг белка (р 0,05). На 21-е сутки уровень общего глутатиона в спленоцитах облученных мышей статистически значимо не отличался от показателя у необлученной группы животных (таблица 7).
Снижение уровня общего глутатиона под влиянием ионизирующей радиации может быть обусловлено несколькими механизмами: ингибированием его синтеза [178, 194, 204], расходованием в глутатионпероксидазной реакции при элиминации гидропероксидов, образующихся в реакциях свободнорадикального окисления, с генерацией окисленной формы трипептида, реагирующей с белками с образованием смешанных дисульфидов [149], а также в реакциях образования коньюгатов глутатиона с конечными продуктами липидной пероксидации альдегидов и кетонов в глутатионтрансферазной реакции [256].
Предварительное введение мышам до облучения гликозида витамина С приводило к- значимо меньшему падению уровня общего глутатиона в спленоцитах облученных мышей. Уровень общего глутатиона в клетках селезенки у облученных животных, которым предварительно вводили AAG, через 12 часов после действия ионизирующей радиации был статистически значимо выше (11,7±0,6 нмоль/мг белка) его уровня у животных, которые подвергались только облучению (9,1 ±0,6 нмоль/мг белка), хотя и оставался ниже в сравнении с этим показателем у необлученных мышей (16,5±1,1 нмоль/мг белка), (р 0,05) (таблица 5). Введение аскорбиновой кислоты животным в той же дозе оказывало менее выраженный защитный эффект при действии гамма-радиации на содержание общего глутатиона в спленоцитах. Его уровень через 12 часов после облучения статистически значимо не отличался (10,0±0,4 нмоль/мг белка) (р 0,05) от группы животных, подвергшихся только облучению (9,1±0,6 нмоль/мг белка).
Через сутки после облучения в группах животных, получавших AAG и витамин С, наблюдалось дальнейшее снижение содержания общего глутатиона в клетках селезенки (9,6±0,7 и 8,8±0,6 нмоль/мг белка, соответственно) (р 0,05) по сравнению с необлученными животными (16,0± 1,0 нмоль/мг белка), однако его уровень был значимо выше, чем в группе по животных, подвергшихся только облучению (6,6 ± 0,4 нмоль/мг белка). На третьи сутки эксперимента у животных, которым предварительно вводили гликозид аскорбиновой кислоты и витамин С наблюдалось статистически значимое повышение содержания общего глутатиона в спленоцитах (11,1±0,3 и 9,0±0,7 нмоль/мг белка, соответственно), (р 0,05) по сравнению с группой облученных животных (4,5 ±0,6 нмоль/мг белка). Следует отметить тот факт, что введение гликозида аскорбиновой кислоты приводило к более выраженному повышению уровня общего глутатиона по сравнению с группой животных, получавших витамин С. На четырнадцатые сутки эксперимента в группе животных с AAG, наблюдалось полное восстановление содержания общего глутатиона (16,2±0,6 нмоль/мг белка) и его уровень статистически значимо не отличался от уровня у необлученных животных (17,0±0,4 нмоль/мг белка), а к концу эксперимента даже превышал его (22,4±1,0 нмоль/мг белка). Введение аскорбиновой кислоты мышам перед облучением способствовало нормализации уровня общего глутатиона в клетках селезенки только на 21 сутки.
Таким образом, предварительное введение гликозида витамина С способствовало сохранению более высокого уровня глутатиона в спленоцитах мышей в ранние сроки после облучения и более быстрому восстановлению его уровня до контрольных значений в отдаленные сроки.
