Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Взаимодействие вируса и клетки 15
1.1.1. Разновидности взаимодействия вируса и клетки.. 15
1.1.2. Морфологические проявления взаимодействия вируса и клетки 18
1.1.3. Особенности размножения РНК~содержащих вирусов 21
1.2. Онкотропизм вирусов 24
1.3. Механизмы противоопухолевой активности онкотропных вирусов 33
1.3.1. Вирусный онколиз 35
1.3.2. Гетерогенизация опухолей , 38
1.3.3. Неспецифическая иммуномодуляция 41
1.4. Основные направления использования вирусов в онкологии 43
1.4.1. Виротерапия опухолей , 43
1.4.2. Противоопухолевая вакцинация 45
1.4.3. Гемотерапия злокачественных опухолей 48
1.5. Заключение по главе 1... 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 57
2.1. Экспериментальные модели злокачественного роста 57
2.2. Характеристика терапевтических агентов, использованных в работе 59
2.2.1. Вирусные вакцины 59.
2.2.2. Вирусные онколизаты 61
2.2.3. Цитостатики 62
2.2.4. Иммуномодулятор 62
2.3. Методы оценки эффективности виротерапин 62
2.3.1. Определение коэффициента торможения роста опухолей 62
2.3.2. Определение индекса ингибирования метастазирования 63
2.3.3. Модель условного метастазирования 64
2.3.4. Моделирование процесса метастазирования после удаления первичного опухолевого узла 65
2.4. Методы определения цитоморфологических нарушений в опухолевых клетках 65
2.4.1. Подсчет количества клеток, определение их жизнеспособности... 65
2.4.2. Приготовление мазков и подсчет цитологических показателей... 65
2.5. Методы оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток... 66
2.5.1. Методы выделения иммунокомпетентных клеток 66
2.5.2. Мембранотоксический тест 68
2.5.3. Цитостатический тест 69
2.5.4. Цитотоксическая активность макрофагов 69
2.6. Статистическая обработка результатов 70
ГЛАВА 3. Противоопухолевые и антиметастатические свойства вирусных вакцин и онколизатов 71
3.1. Он ко- и органотропные свойства вируса ВЭЛ 71
3.2. Противоопухолевая активность вируса ВЭЛ на модели экспериментальных опухолей 73
3.2.1. Изучение противоопухолевой активности вируса ВЭЛ на модели неметастазирующей опухоли Эрлиха 74
3.2.2. Противоопухолевая активность вируса ВЭЛ на модели "условного метастаза 76
3.2.3. Изучение противоопухолевой активности вирусов на модели метастазирующих опухолей 78
3.3. Влияние вирусных вакцин на развитие послеоперационного метастазирования 88
3.4. Влияние вакцинного штамма вируса ВЭЛ на эффективность цитостатической терапии в эксперименте 95
3.5. Антиметастатическая активность вирусного онколизата 98
3.5.1. Определение иммуногенности онколизата вируса ВЭЛ in vitro 98
3.5.2. Послеоперационая терапия животных с меланомой В16 онколизатом вируса ВЭЛ 98
3.5.3. Комбинированная терапия животных вирусом ВЭЛ, онколизатом и Т-активином 102
ГЛАВА 4. Морфологические нарушения в опухолевых клетках, индуцированные вирусными вакцинами 105
4.1. Цитологические изменения опухолевых клеток при воздействии вакцинных штаммов вирусов в системе in vitro 105
4.1.1. Изменение показателей митотического режима клеток аденокарциномы Эрлиха, инфицированных вирусом венесуэльского энцефаломиелита 105
4.1.2. Влияние вакцинных штаммов вирусов на жизнеспособность и уровень цитологических нарушений в клетках карциномы Эрлиха 107
4.1.3. Цитопатические изменения, происходящие под действием вакцинных штаммов вирусов в клетках опухоли гортани человека (Нер-2) 120
4.1.6. Влияние вакцинных штаммов вирусов на морфологические характеристики экспериментальных опухолей 126
4.2. Влияние вакцинных штаммов вирусов на цитоморфологические характеристики опухолевых клеток в системе in vivo 131
4.2.1. Влияние вакцинных штаммов вирусов на уровень цитологических нарушений в клетках асцитной карциномы Эрлиха 131
4.2.2. Влияние вакцинных штаммов вирусов на уровень цитологических нарушений в клетках солидной карциномы Эрлиха 133
4.2.3. Влияние сочетаннои терапии винкристином и вирусом ВЭЛ на цитоморфологические характеристики карциномы Эрлиха 135
4.2.4. Цитоморфологические нарушения в клетках карциномы легких Льюис, индуцированные вакцинными штаммами вирусов 140
ГЛАВА 5. Иммунологические механизмы противоопухолевого действия вирусных вакцин 144
5.1. Иммуномодулирующая активность вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита 144
5.2. Функциональное состояние перитонеальных и опухолеассоциированных макрофагов животных на фоне терапии вирусными вакцинами 156
5.3. Функциональное состояние спленоцитов экспериментальных животных на фоне терапии вирусными вакцинами 166
Заключение 176
Выводы 194
Литература 196
- Морфологические проявления взаимодействия вируса и клетки
- Изучение противоопухолевой активности вирусов на модели метастазирующих опухолей
- Влияние вакцинных штаммов вирусов на жизнеспособность и уровень цитологических нарушений в клетках карциномы Эрлиха
- Иммуномодулирующая активность вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита
Введение к работе
Актуальность. Терапия опухолей представляет собой сложную, а при злокачественных формах, не всегда разрешимую задачу. Одну из главных ролей среди противоопухолевых воздействий общего типа играет химиотерапевтическое, которое предусматривает прямой цитотоксический эффект. Внедрение в онкологическую практику различных схем комбинированного и комплексного лечения с применением новых химиопрепаратов, гормон о- и адъювантной терапии, позволило повысить эффективность традиционных методов и добиться, в отдельных случаях, полной ремиссии, что, однако, не изменило ситуации в целом. Показатели общей смертности от рака практически не снизились, при этом, значительный удельный вес занимают местнораспространенные и метастатические формы заболевания [7, 47, 55, 113, 156]. Часто гибель больного, на фоне успешно излеченного первичного опухолевого узла, обусловлена метастазами, которые уже существуют к моменту постановки диагноза. То есть, в подавляющем большинстве случаев, системная химиотерапия, применяемая для предотвращения и контроля метастазов, не приводит к желаемому эффекту [156]. Известно, что в настоящее время химиотерапия используется, как самостоятельный метод лечения, лишь при определенных формах быстрорастущих новообразований, при этом они либо полностью излечиваются, либо подвергаются глубокому угнетению с длительным исчезновением клинических симптомов. Однако, существует целый ряд препятствий при применении этого метода лечения. Даже в тех случаях, когда наблюдается ярко выраженный терапевтический эффект, он, обычно, сопровождается тяжелыми побочными явлениями, не дающими, порой, возможности довести лечение до успешного завершения [127].
Существующее положение ставит перед исследователями сложную задачу по изысканию принципиально новых методов и схем лечения
злокачественных новообразований, причем, эти воздействия должны обладать высокой избирательностью, т. е. не поражать нормальных органов, либо вызывать в них минимальные изменения, не препятствующие проведению терапии основного заболевания.
Основная тенденция современной онкологии - комплексная терапия, главной целью которой является оптимизация и повышение эффективности традиционных методов. Этот подход обусловлен достижениями современной науки, позволившими получить новые сведения о многообразии факторов, участвующих в процессе онкогенеза, и его тонких механизмах. Вышесказанное служит достаточно веским основанием для формирования терапевтических подходов, при которых предусмотрено не только прямое повреждающее действие на опухолевые клетки, но и возможность влияния на различные регуляторные процессы, включающие факторы естественной противоопухолевой резистентности, рост и дифференцировку клеток, иммунные механизмы.
Использование такого терапевтического воздействия, которое позволяет одновременно оказывать повреждающее действие на опухолевые клетки и активировать защитные силы организма, способные оказывать антибластомный эффект, было бы наиболее перспективным в этом плане. В последние годы в число наиболее мощных биотерапевтических воздействий входят модификаторы биологических реакций (МБР), такие, как цитокины, генотерапия, трансплантация костного мозга и эмбриональных тканей с высоким иммуно- и гемопоэтическим потенциалом [50, 70, 167, 216, 227, 234, 336, 384]. Достаточно перспективными на сегодняшний день считаются такие методы биологической терапии рака, как противоопухолевая вакцинация и генотерапия [67, 90-94, 151,219, 245, 328, 330, 377, 407].
Неоднократно предпринимались попытки применения в качестве антибластомных средств различных инфекционных агентов, в том числе, и вирусной природы [96, 143, 233, 276, 290, 303, 305, 319, 402]. Интерес к
проблеме противоопухолевого действия вирусов, возникшей в начале нашего столетия, переживал подъемы и спады. Это было обусловлено диссонансом между обнадеживающими экспериментальными данными и результатами их практической реализации в клинике.
При репликации онколитических вирусов в опухолевых клетках концентрация их, в сравнении с нормальными, может превышать 104/мл [175, 210, 290, 319, 363]. При этом, перспективно выглядит использование в терапии неоплазм некоторых вакцинных штаммов экзогенных вирусов, апатогенных для организма человека. Они могут вызывать образование интерферона, индуцировать изменения антигенной и иммуногенной характеристик опухолевых клеток, оказывая модулирующее действие на систему иммунитета [217, 256, 274, 304, 324,340].
Однако, онкотропные и онколитические свойства вирусов, принадлежащих к разным семействам, несколько отличны друг от друга и, по мнению А.Я. Муцениеце (1972), целесообразно заниматься изучением вопросов, связанных с различной чувствительностью опухолей к вирусам, путем регуляции этого процесса в желаемом направлении. Последний вопрос представляется особенно важным для решения проблем виротерапии, ибо она только тогда встанет на практическую почву, когда «случайность» тропизма вирусов к определенным опухолям станет закономерностью.
При изучении свойств онкотропных вирусов была показана возможность опухолєспецифической иммунизации интактных животных препаратами опухолевых клеток, инфицированных вирусами и подвергнутых разрушению, или их фракциями [181, 185, 398]. Иммуногенными свойствами обладают как естественный материал вирусного онколиза и живые вирус-инфицированные клетки, так и онколизаты - гомогенаты опухолевых культур, зараженных вирусами in vitro [181, 296]. Индуцированные вирусами иммуногенные свойства опухолевых клеток позволяют использовать онколизаты для профилактической или послеоперационной
противоопухолевой вакцинации с целью стимуляции противоопухолевых иммунных реакций организма [172, 286]. Феномен онкотропизма вирусов лежит в основе методов геннотерапевтического воздействия на опухолевый рост [171, 179, 206,261, 263, 264, 325].
В клинической практике продолжается начатое в начале 90-х годов изучение вирусных онколизатов: препараты вводятся, в основном, после удаления первичного опухолевого узла, с целью усиления противоопухолевых иммунных реакций организма. В целом, согласно экспериментальным протоколам, применение данного вида терапии достаточно эффективно — активно ингибируется метастазирование, повышается противоопухолевый иммунный ответ, отмечены отдельные случаи полной регрессии опухолей [172, 202, 286]. Завершились успехом клинические испытания генноинженерных методов повышения иммуногенности злокачественных новообразований [171, 179, 259,261,329].
Онкогропные вирусы, сочетающие в себе как антинеобластомные, так и иммуномодулирующие свойства, являются достаточно перспективным объектом исследования. Однако, несмотря на многочисленные публикации, посвященные проблеме использования вирусов в терапии злокачественных опухолей, вопрос о механизмах, обеспечивающих их противоопухолевый эффект, практически не освещен, хотя актуальность его очевидна. Решение его представляет, на наш взгляд, большой практический интерес, так как дает возможность для реального внедрения этих препаратов в онкологическую практику. Применение в терапии опухолей стандартных вирусных вакцин снимает проблему высокой вирулентности патогенных штаммов и привлекает возможностью, в случае положительного эффекта, иметь готовый официнальный препарат для клинического использования. Цель исследования. Изучить эффективность и механизмы реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе.
Задачи:
Оценить онкотропные свойства вирусных вакцин (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа, осповакцины) в системах in vivo и in vitro.
Изучить онколитические свойства вакцинных штаммов вирусов в отношении первичных опухолей и оценить их влияние на процессы послеоперационного рецидивирования и метастазирования.
Изучить степень цитоморфологических нарушений в клетках опухолей экспериментальных животных в процессе терапии вакцинными штаммами вирусов и лизатами клеток, инфицированных in vitro.
Исследовать роль внутриопухолевых и системных факторов естественной резистентности в реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов.
Исследовать влияние вакцинных штаммов вирусов на активность иммунокомпетентных клеток на фоне химиотерапии и оперативного вмешательства при экспериментальном онкогенезе.
Положения, выносимые на защиту:
Вакцинные штаммы вирусов и их онколизаты проявляют
выраженную противоопухолевую и антиметастатическую
активность в отношении перевиваемых опухолей
экспериментальных животных. - Механизмы противоопухолевой и антиметастатической активности вирусных вакцин базируются как на прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевых иммунных функций организма. Основные механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вакцинных штаммов вирусов и их способность повышать эффективность традиционных методов терапии опухолей связаны с
нормализацией, либо стимуляцией функциональной активности отдельных звеньев системы иммунитета. - Наиболее эффективным вариантом терапии неоплазий вирусными вакцинами является их системное применение в комбинации с оперативным вмешательством
Научная новизна. Впервые изучены противоопухолевые и
антиметастатические свойства вакцинных штаммов тога- и
парамиксовирусов, а также их онколизатов при экспериментальном онкогенезе.
Механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются как на прямом цитодеструктивном действии на опухолевые клетки, так и на модуляции неспецифических параметров иммунного ответа: цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов, активности натуральных киллеров, ответе лимфоцитов на митогены.
Выявлена различная степень противоопухолевой активности лимфоцитов из опухолевого узла и иммунокомпетентных органов.
Впервые показано, что вакцинные штаммы вирусов обладают выраженной тропностью и литической активностью в отношении экспериментальных опухолей. Терапия вирусными вакцинами, на фоне оперативного вмешательства, приводит к угнетению послеоперационного рецидивирования и метастазирования опухолей, которое ассоциируется с активацией иммунокомпетентных клеток.
Вакцинные штаммы вирусов индуцируют появление в опухолевых клетках дополнительных ядер, микроядер и вызывают вакуолизацию цитоплазмы клеток. Кроме того, вирусы венесуэльского энцефаломиелита и паротита значительно подавляют митотическую активность опухолевых клеток in vivo.
Вакцинный штамм вируса венесуэльского энцефаломиелита индуцирует в культуре опухолевых клеток достоверное увеличение числа патологических митозов за счет снижения нормальных.
Теоретическая и практическая значимость.
Проведенные исследования позволили получить новую информацию относительно спектра вирусных вакцин, которые могут найти применение в терапии злокачественных опухолей.
На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин.
Изученные в эксперименте механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вирусных вакцин дают теоретические предпосылки для их патогенетически обоснованного применения в онкологии.
Проведенные исследования, расширив круг представлений о механизмах, лежащих в основе иммуномодулиругощего действия вирусных вакцин, позволили оценить целесообразность их применения, в сочетании с традиционными методами воздействия, в терапии онкологических заболеваний.
Апробация работы.
Основные положения диссертации представлены и обсуждены на
International Congress on Anti-Cancer Treatment (Paris, France,
1996,1997,1998); Europian Cancer Conference (Germany, 1997); Международном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1997; Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", С-
(«Г
Петербург, 2001, 2002; юбилейной конференции "Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции", Томск 1997; конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 1998; IV ежегодной российской онкологической конференции, Москва, 2000; VI ежегодной российской онкологической конференции, Москва, 2002; юбилейной конференции НИИО ТНЦ СО РАМН "Проблемы современной онкологии", Томск, 1999.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 11 - в реферируемых российских и зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 239 страницах, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 46 рисунками. Библиографический указатель включает 411 источников, из них 170 отечественных и 241 зарубежных.
Морфологические проявления взаимодействия вируса и клетки
Насчитывается несколько исходов взаимодействия клетки и вируса. Во многих системах инфицирование клетки вирусом, сопровождающееся быстрым угнетением синтеза клеточных макромолекул, приводит к ее деструкции. На более поздних стадиях инфекционного процесса происходит полное нарушение метаболизма клетки, включая прекращение дыхания, гликолиза, а также любых синтетических реакций. В частности, способности к митотическому делению. Наряду с биохимическими и функциональными нарушениями, в них развиваются морфологические изменения, выявляемые с помощью различных методов световой микроскопии. Существует два пути развития деструктивных процессов в клетке: при внешнем воздействии цитотоксический эффект могут вызвать внеклеточные вирионы или отдельные их компоненты. Альтернативный вариант связан с проникновением и функционированием генома вируса непосредственно в клетке. Развивающиеся вследствие этого изменения метаболизма клетки могут быть результатом угнетение синтеза клеточных нуклеиновых кислот или белков [126]. Одним из наиболее ярких проявлений морфологического взаимодействия вируса и клетки является цитопатический эффект (ЦПЭ), под которым подразумевают патологические изменения инфицированных вирусами клеток, видимые при микроскопии нативных препаратов или после использования простейших методов окраски [126]. Цитопатические изменения клеток являются, обычно, следствием нарушения метаболизма, связанного с репродукцией вирусов. При этом, основной причиной патологических изменений служит, видимо, подавление нормального биосинтеза клеточных нуклеиновых кислот и белков, вызываемого многими вирусами. Частным случаем ЦПЭ является раннее цитотоксическое действие вируса, которое не связано с его размножением, развивается вскоре (через 2 4 часа) после инфицирования и характеризуется образованием конгломератов клеток с быстро наступающим сморщиванием их. Цитотоксины обнаружены у аденовирусов, вирусов полиомиелита и осповакцины [126], Существует следующая классификация ЦПЭ: 1) равномерная мелкозернистая деструкция клеток, вызываемая вирусами полиомиелита, оспы, гриппа; 2) очаговая мелкозернистая деструкция с тяжами сохранившихся клеток; 3) гроздевидные скопления пораженных клеток, характерные для аденовирусной инфекции; 4) равномерная крупнозернистая деструкция; 5) формирование симпластов при инфекции вирусами кори, осповакцины, некоторыми вирусами группы ECHO [126]. Морфологическая картина цитопатического эффекта, развивающегося при острой вирусной инфекции, очень разнообразна. Внутриклеточное развитие вируса приводит к деструкции и гибели большинства клеток культуры и влечет за собой развитие морфологических изменений, специфичных для различных групп вирусов. Например, аденовирусы и вирусы группы герпеса развиваются, главным образом, в ядрах чувствительных клеток, вызывая изменения, характерные для каждой из этих групп. ДНК-содержащие вирусы осповакцины и эктромелии размножаются в цитоплазме, где возникают специфические включения, которые легко отличить от аналогичных, вызываемых вирусом кори. Симпластоподобные образования при заражении различными вирусами также отчетливо различаются по внешнему виду [126]. На первое место среди факторов, определяющих морфологическую картину ЦПЭ, ставят свойства инфицирующего вируса. Как бы ни различались проявления ЦПЭ данного вируса в различных видах пермиссивных клеток, всегда находится ряд общих черт, характерных для этой группы. В развитии специфических признаков ЦПЭ существенная роль принадлежит особенностям чувствительных клеток. Например, симпласты, развивающиеся при действии вируса осповакцины на культуру клеток Нер-2, существенно отличаются по размерам, форме и числу содержащихся в них ядер от аналогичных структур, которые появляются при инфицировании этим вирусом культуры клеток J-96 [126]. Симпластообразование является одним из частых проявлений цитопатогенного действия вирусов: агломерацию клеток и формирование симпластов могут вызвать вирусы группы оспы, герпеса, парамиксовирусы, пенящие вирусы и др. В основе этого феномена лежит слияние плазматических мембран двух или нескольких клеток. Принято выделять две формы симпластообразующего действия вирусов: слияние извне и изнутри. Слияние извне развивается быстро, на первых этапах взаимодействия вируса и клетки (при множественности заражения 100-1000 вирусных частиц на клетку). Для этого процесса не требуется полного вируса и каких-либо вирусиндуцированных синтезов [126]. Слияние изнутри (так называемый, поздний поликариоцитоз) происходит на поздних этапах вирусной инфекции и связано с индукцией синтеза вирусспецифических антигенов. Могут, также, сливаться зараженные и незараженные клетки, что способствует быстрому вовлечению большего числа их в инфекционный процесс. Вирусы вызывают слияние не только одинаковых, но и разнородных клеток одного и того же, а также разных видов и разных классов животных, при этом образуются гетерокарионы. Действие на клетки токсических веществ, связанных с вирусом, во многих случаях отличается от собственно цитопатогенного действия, обусловленного внутриклеточным размножением вируса, по срокам развития поражений клеточной популяции, отсутствию характерных для данного вируса морфологических изменений клеток и другим признакам. Была показана связь цитопатических изменений инфицированных вирусами клеток с нарушениями проницаемости мембран лизосом и выходом из них гидролаз, приводящих клетку к гибели [8]. Высказывалось мнение, что в основе цитопатогенного действия вирусов лежит реакция клеток на их белковые компоненты [151]. Установлено, что РНК вируса полиомиелита не вызывает дезинтегративного набухания ядер клеток до тех пор, пока в клетке не появятся первые структурные белки вируса. Если в культуру клеток вводили вирус, обработанный гидроксиламином, который инактивирует РНК полиовируса, не разрушая его белковый компонент, в клеточной популяции уже к 3 часам опыта развивалось обычное дезинтегративное набухание ядер.
Изучение противоопухолевой активности вирусов на модели метастазирующих опухолей
Представлял определенный интерес вопрос о влиянии вируса ВЭЛ на развитие вторично-привитых опухолей у мышей, перенесших первичный опухолевый процесс и оперативное вмешательство. Как известно, процесс роста опухоли в организме сопровождается определенными изменениями в иммунном ответе - активируются системы макрофагов, натуральных киллеров и клеточной цитотоксичности [155].
В серии опытов по изучению противоопухолевой активности вируса ВЭЛ на модели условного метастазирования мышам после удаления первичных опухолей Эрлиха, развившихся в подушечке задней конечности, имплантировались вторичные, так называемые "условные метастазы", а через сутки после операции вводился вирус. Дозы прививки первичной и вторичной опухолей составляли 3x106 клеток/мышь. Экспериментальные животные также распределялись по двум группам — контрольной и опытной. Первую группу составляли мыши с удаленными первичными опухолевыми узлами и привитыми вторичными, вторую — такие же животные, получившие вирус. По мере роста вторичных опухолей измерялся их объем. Полученные данные представлены на рис.2.
Динамика роста «метастазов» у мышей контрольных групп существенно не отличалась от таковой аналогично перевитых первичных опухолей, что не противоречило литературным данным [241]. Однако, динамика роста вторичных опухолей у животных, получивших вирус, была отлична от соответствующего показателя первичных, развивавшихся в тех же условиях (рис. 1,2). К 15-20 суткам после перевивки вторичных опухолей у мышей контрольных групп они имели выраженные размеры и были отчетливо некротизированы, в опытных же группах наблюдалось резкое торможение опухолевого роста. У 90-100% подопытных животных опухоли, развившись до небольшого размера, полностью регрессировали. Кроме того, у всех животных контрольных групп на месте удаленного первичного опухолевого узла развивались рецидивы, тогда как в опытных группах этого явления не наблюдалось. У 80-90% мышей, получивших вирус, в течение 4 месяцев после имплантации первичных опухолей не отмечалось рецидивирования, что свидетельствовало об их полном излечении.
Таким образом, результаты наших наблюдений показали, что только естественной противоопухолевой реакции организма-опухоленосителя недостаточно для подавления роста вторично-привитых опухолей у животных контрольных групп. В ситуации с первичными опухолями Эрлиха инъекция вируса, приводящая к 50-80% торможению опухолевого роста, на фоне уже развившихся в организме противоопухолевых иммунных реакций, в большинстве случаев вызывала полное отторжение вторичных опухолевых узлов у мышей опытных групп.
Как известно, удаление опухоли индуцирует временное снижение резистентности организма, в ситуациях с метастазирующими опухолями их удаление зачастую стимулирует метастазирование [155]. Однако, в выбранной нами экспериментальной системе эти изменения не оказывали существенного влияния на рост вторичных опухолей. Нами не было зарегистрировано достоверных различий между скоростью роста «метастаза» и первичной опухоли (рис.3).
Метастазирование опухоли - один из ключевых признаков ее злокачественности, так как именно раннее метастазирование ограничивает эффективность всех известных способов терапии необластом [69, 110, 246, 335].
В представленной серии опытов нами изучались как противоопухолевая, так и антиметастатическая активность вирусных вакцин на экспериментальных моделях перевиваемых опухолей мышей — карциномы легких Льюис и меланомы В-16. В каждой серии экспериментов животные распределялись по двум группам: контрольная - опухоленосители, опытная -опухоленосители, получившие вирус. Введение вакцинных штаммов вирусов вызывало у животных-опухоленосителей менее выраженное торможение роста первичных опухолевых узлов карциномы Льюис и меланомы В16, чем аденокарциномы Эрлиха (50-80%). Так, согласно результатам, полученным на модели карциномы Льюис, представленным на рис.4, 5 торможение роста этой опухоли в разные сроки наблюдения составляло 20-48%, 16-45% и 15-28% для вирусов ВЭЛ, паротита и оспы, соответственно. Аналогичные показатели у мышей с меланомой В16 были еще ниже - 15-37% (рис. 6, 7). Полученные данные свидетельствует о сниженной чувствительности этих опухолей к воздействию вирусов в условиях in vivo. Более активно исследуемые вирусные штаммы ингибировали развитие метастазов. Так, на 17- 23 сутки после имплантации опухолей, индекс ингибирования метастазирования карциномы Льюис вирусами ВЭЛ, оспы, паротита был равен 50-75%, 45-62%, 58-68%, соответственно (рис.8, 9). При этом, частота метастазирования опухолей составляла 100%. Влияние терапии вирусом ВЭЛ на рост и метастазирование экспериментальных опухолей представлено в табл.6. Нами показано, что вакцинные штаммы исследованных вирусов наиболее активны в отношении небольших опухолевых образований - метастазов, а также на ранних стадиях опухолевого процесса. По мере развития первичных опухолевых узлов, противоопухолевая активность вирусов постепенно снижается.
Влияние вакцинных штаммов вирусов на жизнеспособность и уровень цитологических нарушений в клетках карциномы Эрлиха
При исследовании в системе in vitro жизнеспособности клеток асцитного варианта аденокарциномы Эрлиха статистически значимый цитотоксический эффект зарегистрирован как при 24-, так и при 48-часовом культивировании их с вирусом ВЭЛ. Обратный эффект наблюдался при воздействии вирусов паротита и гриппа - они вызывали незначительную стимуляцию жизнеспособности клеток АКЭ через 24 часа и 48 часов культивирования, соответственно (рис. 23).
Исследование патологии ядра в интерфазе клеток асцитного рака Эрлиха, инфицированных вирусом ВЭЛ, показало достоверное, в сравнении с ингактной культурой, увеличение количества многоядерных клеток через 24 часа культивирования. Через 48 часов различия данного показателя в опыте и контроле были статистически незначимы. При этом, другие вакцинные штаммы вызывали достоверное снижение количества многоядерных клеток (рис. 24,29).
Обнаружено, что статистически значимое увеличение количества микроядрасодержащих клеток в клеточной культуре асцитного рака Эрлиха происходит при инфицировании вирусами гриппа и ВЭЛ через 24 и 48 часов культивирования, вирус паротита не вызвал достоверных изменений исследованного показателя (рис. 25).
Исследование митотической активности клеток АКЭ, инфицированных вакцинными штаммами вирусов, показало угнетение данного показателя вирусами: ВЭЛ - через 24 и 48 часов культивирования; паротита - через 24 часа. Вирус гриппа оказывал парадоксальный эффект - существенно повышал их митотическую активность через 48 часов культивирования (рис. 26). Все исследованные вакцинные штаммы вызывали достоверное увеличение вакуолизации цитоплазмы клеток асцитного рака Эрлиха, однако, влияние на исследуемый показатель вируса паротита оказалось более выраженным, чем ВЭЛ и гриппа как через 24, так и через 48 часов культивирования (рис. 27, 29).
Митотическая активность клеток Нер-2 подавлялась всеми исследуемыми штаммами вирусов в разной степени. Наиболее активно снижал данный показатель вирус гриппа как через 24, так и 48 часов культивирования. В меньшей степени этим свойством обладали вирусы ВЭЛ и паротита (табл. 13,14).
Изучение патологии интерфазного ядра в клетках Нер-2 показало существенное изменение под влиянием вирусов паротита и ВЭЛ числа многоядерных клеток (рис. 29). В меньшей степени на этот показатель влиял вирус гриппа.
Микроядерный анализ показал, что заражение вирусом паротита клеток Нер-2 приводит, через 48 часов культивирования, к удвоению этого показателя. Аналогичный результат имел место как через 24, так и через 48 часов культивирования Нер-2 с вирусом венесуэльского энцефаломиелита. При инфицировании культуры клеток вирусом гриппа достоверно снижался процент микроядросодержащих клеток как через 24, так и через 48 часов культивирования.
Процентное содержание клеток Нер-2 с вакуолизированной цитоплазмой (рис. 28) при воздействии исследуемых РНК-содержащих вирусов имело следующие изменения: вирус гриппа достоверно снижал данный показатель как через 24 часа, так и через 48 часов, другие исследуемые штаммы вирусов достоверно повышали данный показатель во все сроки наблюдения (табл. 13-16).
При исследовании жизнеспособности клеток К-562 статистически значимый цитотоксический эффект зарегистрирован через 24 и 48 часов после инфицирования вирусом паротита, вирусы ВЭЛ и гриппа не оказали существенного влияния на изученный показатель (табл. 15).
Исследование патологии ядра в интерфазе клеток К-562, инфицированных вирусами ВЭЛ и паротита, показало достоверное увеличение количества многоядерных клеток (рис. 29) через 24 и 48 часов культивирования. Однако, вирусы гриппа снижали данный показатель на всем протяжении наблюдения (табл. 16,17).
Микроядерный тест показал значительное увеличения данного показателя при воздействии на изученные клетки вируса паротита и, в меньшей степени, вирусов ВЭЛ и гриппа через 24 и 48 часов культивирования (табл. 16,17).
Процент делящихся клеток К-562, зараженных вирусом гриппа, снижался после 24- и 48-часового культивирования, меньшие изменения данного показателя вызывал вирус ВЭЛ, а стимулирующий эффект оказывал вирус паротита. Все исследуемые вирусные штаммы вызывали вакуолизацию цитоплазмы клеток К-562, но наиболее ярко эта способность была продемонстрирована вирусом венесуэльского энцефаломиелита (табл . 16,17; рис. 28,30).
Иммуномодулирующая активность вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита
В настоящем параграфе представлены данные по исследованию влияния вакцинного штамма вируса ВЭЛ на различные звенья иммунной системы в опытах in vivo у мышей с перевиваемыми опухолями и в условиях моделирования ситуации развития вторичных опухолей (условное метастазирование) после удаления первичных опухолевых узлов.
Иммунологические показатели оценивались у мышей BALB/c с первичными опухолями Эрлиха на 11-13 и 21-23 сутки после имплантации опухолевых клеток и в те же сроки у животных с «условными метастазами».
Прогрессирующий рост первичных опухолей Эрлиха приводил к постепенному угнетению иммунных функций, что согласуется с данными литературы [52, 152, 78, 128]. Определение на 10 сутки после введения вируса спонтанной пролиферации, а также пролиферативной активности спленоцитов в ответ на Т- и В-клеточные митогены показало, что эти параметры были снижены в группе 2 (опухоленосители), оставаясь в группе 3 (опухоленосители, получившие терапию вирусом ВЭЛ) сопоставимыми с таковыми у интактных мышей (группа 1). Полученные данные представлены на рис. 39А. Кроме того, в указанный срок у мышей, которым вводили вакцину, была отчетливо снижена супрессорная активность спленоцитов (22%) в сравнении с таковой у нелеченных животных (50,4%). На рис. 40А и 41А представлены данные, характеризующие способность клеток селезенки к цитостатическому и мембранотоксическому действию на 10 сутки после введения вируса. У мышей-опухоленосителей цитостатическая активность спленоцитов несколько выше, а активность натуральных киллеров ниже, чем у интактных животных, что согласуется с литературными данными [ПО]. У мышей, получивших вирус, мы наблюдали выраженное увеличение этих показателей на 10 день исследований (рис. 40А). Однако, на 20 сутки после введения вируса различия между перечисленными параметрами у животных с первичными опухолями контрольных и опытных групп статистически недостоверны, что согласуется с данными, полученными нами в опытах in vivo - на 23-25 сутки у мышей опытных групп вновь начинают интенсивно развиваться опухоли. Так, практически одинаково, снижены показатели спонтанной пролиферативной активности сштеноцитов, а также их ответа на митогены у мышей групп 2 и 3 в сравнении с показателями группы 1 (рис. 39 Б). Сопоставимы индексы цитостатической и мембранотоксической активности спленоцитов мышей групп 2 и 3 (рис. 40Б, 41 Б), которые ниже в сравнении с аналогичными, полученными на 10 сутки после введения вируса и существенно ниже, чем у интактных животных (рис. 40А, 41 А). При этом также повышается супрессорная активность лимфоцитов: на 20 сутки после введения вируса индекс супрессии у мышей контрольной и опытной групп был равен, соответственно, 80,5 и 77%, что, примерно, в 3 раза выше, чем у интактных животных (26,2%).
При оценке характера иммунной реакции у мышей с вторично-привитыми опухолями, на 8-20 сутки после введения вируса мы получили аналогичные результаты - вирус опосредованно стимулировал регистрируемые показатели, однако, реакция иммунной системы была более растянута во времени (их снижение наблюдалось в более поздние сроки, чем у животных опытных групп с первичной опухолью). Кроме того, в указанные сроки наблюдения определяемые показатели у оперированных животных были несколько выше, чем у тех, опухоли которых не были удалены, следовательно, вторичные не перевивались.
