Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Фармакогенетика и противоопухолевая химиотерапия 9
Дигидропиримидиндегидрогеназа 12
Тиопуринметилтрансфераза 13
Глюкуронилтрансфераза 13
Цитохром р450 : 15
Р-гликопротеин и другие белки полирезистентности 16
1.2. Цисплатин: фармакология и фармакогенетика 19
Транспорт через клеточную мембрану 20
Внутриклеточный метаболизм 21
Повреждение днк и индукция апоптоза 22
Устойчивость к цисплатину: фармакогенетическии анализ 24
1.3.глутатион-8-трансферазы 26
1.4. Белки репарации днк 31
1.5. Химиотерапия рака яичников в свете фармакогенетических исследований 35
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Клиническая часть 39
2.2. Генетическое тестирование 44
2.3. Статистическая обработка 47
Глава 3. Результаты 48
3.1. Клинические данные 48
3.1.1. Общая характеристика больных ; 48
3.1.2. Побочные действия 50
3.1.3. Эффективность химиотерапии 53
3.1.4. Последующее лечение 58
3.2. Данные генетического тестирования 60
3.3. Корреляция клинических и генетических данных 63
3.3.1. Результаты химиотерапии и полиморфизм генов глутатион-s-трансфераз 63
3.3.2. Побочные действия и полиморфизм генов глутатион-б-трансфераз 73
3.3.3. Результаты химиотерапии и полиморфизм генов, кодирующих белки репарации днк 80
3.3.4. Побочные действия и полиморфизм генов репарации днк. 86
Глава 4. Обсуждение 89
4.1. Сравнительный анализ клинических результатов 89
4.2. Полиморфизм генов глутатион-б-трансфераз и результаты химиотерапии 93
4.3. Полиморфизм генов репарации днк и результаты химиотерапии 97
Заключение 99
Выводы 101
Литература 102
- Фармакогенетика и противоопухолевая химиотерапия
- Цисплатин: фармакология и фармакогенетика
- Генетическое тестирование
- Корреляция клинических и генетических данных
Введение к работе
Успехи химиотерапии злокачественных новообразований относятся к наиболее выдающимся достижениям внутренней медицины последних 50 лет. С помощью цитостатиков появилась возможность излечивать опухоли яичка, хориокарциному, лимфомы и лейкозы, на многие годы продлевать жизнь при раке молочной железы и яичников. Одновременно изучалась молекулярная биология опухолей, синтезировались новые препараты, расширялся круг нозологии, подлежащих химиотерапии, разрабатывались новые схемы и подходы к лечению, а также методы поддерживающей терапии. Это бурное развитие сопровождалось неуклонным улучшением результатов химиотерапии: выживаемость увеличивалась, в то же время переносимость лечения, несмотря на усложнение схем, в целом даже улучшалась [Калабрези, 2006; Переводчикова, 2005].
Однако тенденции последних нескольких лет заставляются задуматься о том, что эффективность химиотерапии постепенно выходит на плато: за редким исключением, новые препараты уже не дают существенного прироста выживаемости. В то же время кратно возрастает стоимость лечения, что сильно затрудняет широкое применение последних разработок на практике [Lyman, 2007; Main, 2006; Tappenden, 2007].
Основные усилия современной онкофармакологии сосредоточены на изучении молекулярно-генетических особенностей опухолевого роста и поиске препаратов, воздействующих на те или иные молекулярные «мишени». Благодаря такому подходу разработано практически все последнее поколение противоопухолевых средств. С этими препаратами связывались большие надежды — вплоть до полного излечения злокачественных новообразований. К сожалению, лишь в отдельных случаях новые препараты принципиально улучшили результаты лечения (ритуксимаб при некоторых лимфомах, има-тиниб при хроническом миелолейкозе и стромальных опухолях ЖКТ, трасту-
зумаб при раке молочной железы с экспрессией HER2/neii) [Калабрези, 2006; Garattini, 2002]. По-видимому, в обозримом будущем сложно рассчитывать на появление универсальных препаратов, позволяющих кардинально улучшить результаты лечения основной массы онкологических больных [Arbiser, 2007].
В результате все большую актуальность для современной химиотерапии приобретает индивидуальный подход к подбору препаратов и их доз, направленный на повышение эффективности и уменьшение токсичности имеющегося арсенала противоопухолевых средств. Поскольку традиционные прогностические факторы не позволяют предсказать, какие препараты окажутся эффективными у данного больного, выбор схем химиотерапии носит в известной мере эмпирический характер, что чревато развитием лекарственной устойчивости и нарастанием побочных эффектов, таких, как нейро- и миелотоксичность. Соответственно, требуется поиск дополнительных критериев, указывающих на чувствительность (или устойчивость) опухоли к тем или иным цитостатикам и повышенный риск тех или иных осложнений.
Расчеты показали, что до 95% индивидуальных различий в эффективности и токсичности цитостатиков могут быть генетически обусловленными [Abraham, 2006; Efferth, 2005]. Такими генетически запрограммированными различиями в реакциях организма на лекарственные средства занимается фармакогенетика — дисциплина на стыке фармакологии и медицинской генетики, сложившаяся в 50-х годах и в последнее десятилетие переживающая бурное развитие [Evans, 2003; Gardiner, 2006; Relling, 2001].
Фармакогенетические исследования в химиотерапии уже дали первые практические результаты, относящиеся к таким препаратам, как меркаптопу-рин, иринотекан, а также фторурацил и его производные (см. ниже, Обзор литературы). Однако фармакогенетика препаратов платины изучена недостаточно — несмотря на многочисленные работы, опубликованные за последнее десятилетие, целостная картина пока не сформировалась (в отличие от упомянутых выше цитостатиков). Это связано со сложностью метаболизма и ме-
ханизма действия цисплатина и его аналогов, что требует одновременного исследования многочисленных генов, а также с многообразием схем, в которые входят эти препараты, — что затрудняет подбор однородных групп больных. В то же время выявление прогностических факторов, позволяющих предсказать эффективность и токсичность препаратов платины, способно существенно улучшить результаты химиотерапии большинства солидных опухолей [Kelland, 2007; Wang, 2005].
Производные платины — цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин — являются одними из наиболее активных цитостатиков и входят в схемы химиотерапии большинства злокачественных новообразований, прежде всего эпителиального происхождения: таких, как рак яичников, легкого, толстой кишки, опухоли головы и шеи. Однако наряду с высокой активностью эти препараты характеризуются значительной токсичностью, вызывая в первую очередь тошноту и рвоту, миело-, нейро- и нефротоксическое действие. И если тошнота и рвота достаточно успешно преодолеваются с помощью современных противорвотных препаратов, то другие осложнения в значительной мере ограничивают возможности химиотерапии, приводя к снижению дозы, а зачастую и отмене препарата. Как показывает клинический опыт, одни больные переносят стандартные дозы препаратов платины вполне удовлетворительно, для других же они оказываются слишком токсичными.
Представленная работа посвящена фармакогенетике цисплатина и направлена на поиск генетических маркеров эффективности и токсичности этого столь важного цитостатика. Предпосылкой для нее стал опыт отделения химиотерапии РОНЦ РАМН, указывающий на существенные этнические (то есть генетически обусловленные) различия в переносимости химиотерапии. В частности, проведенный нами сравнительный анализ результатов использования цисплатина при раке яичников у женщин славянского происхождения и якуток показал, что побочные эффекты у якуток возникали достоверно чаще, тогда как частота ремиссий была ниже [Moisseev, 2006].
Цель исследования
Изучение генетических факторов, позволяющих предсказать эффективность и токсичность цисплатина при раке яичников, с целью оптимизации результатов лечения путем индивидуального назначения химиотерапии на основе данных генетического тестирования.
Задачи исследования
і. Изучить связь полиморфизма генов глутатион-Б-трансфераз (GSTA1, GSTM1, GSTM3, GSTP1 и GSTT1) с токсичностью и эффективностью цисплатина у больных раком яичников.
2. Изучить связь полиморфизма генов, кодирующих белки репарации ДНК (ERCC1, XRCC1, XPD) с токсичностью и эффективностью лечения в той же группе больных.
Научно-практическая значимость
Настоящее исследование направлено на выявление генетических параметров, позволяющих предсказать эффективность и токсичность цисплатина при раке яичников (в составе стандартной схемы СР: цисплатин 100 мг/м" + циклофосфамид 600 мг/м2). Не ставя перед собой задачу выработать конкретные рекомендации для клинического применения, она призвана очертить круг фармакогенетических маркеров (полиморфных локусов), определение которых позволило бы в дальнейшем выработать индивидуальный подход к использованию цисплатина и, возможно, других препаратов платины при целом ряде солидных опухолей.
Влияние полиморфизма генов, отвечающих за репарацию ДНК, на результаты химиотерапии при раке яичников практически не изучалось. Хотя значение полиморфизма генов, глутатион-8-трансфераз для эффективности цисплатина уже исследовалось в ряде работ, однако все они были ретроспек-
тивными и имели недостатки, изложенные ниже (Обзор литературы, раздел 1.5). Настоящее исследование является одной из немногих проспективных работ, посвященных фармакогенетике цисплатина, а также первой попыткой одновременно проанализировать столь обширный спектр полиморфизмов с потенциальным влиянием на результаты химиотерапии. Более того, это первое исследование, в котором систематически изучается связь полиморфизма указанных генов с различными побочными действиями химиотерапии (12 полиморфизмов для 8 генов).
Объем и структура диссертации
Диссертация представлена на ПО страницах, разделена на введение, 4 главы (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), заключение и выводы. Работа дополнена 19 таблицами и проиллюстрирована 25 рисунками. Перечень использованной литературы включает 128 источников на русском и английском языках.
Фармакогенетика и противоопухолевая химиотерапия
Фармакогенетика — это раздел медицинской генетики, посвященный генетическим особенностям реакций организма на лекарственные препараты. Сам термин "фармакогенетика" был предложен в 1959 г. [Vogel, 1959]. Первые данные о наследственной предрасположенности к побочным эффектам лекарственных средств относятся к началу 50-х гг., когда были установлены этнические различия в частоте нейропатии на фоне противотуберкулезного средства изониазида и обнаружилось, что противомалярийные препараты вызывают гемолиз у людей с врожденной недостаточностью глюкозо-6-фосфатазы [Carson, 1956; Hughes, 1954]. Поначалу исследования в этой области были основаны на изучении родословных и носили в основном эмпирический характер, и лишь достижения молекулярной генетики последних лет вывели фармакогенетику на качественно иной уровень [Evans, 2003; Gardiner, 2006; Relling, 2001]. (Вдохновленные бурным прогрессом генетических исследований, в частности, расшифровкой генома человека, многие исследователи начали использовать термин «фармакогеномика»).
Молекулярным субстратом фармакогенетики служит генетическое разнообразие: одни и те же гены имеют различные варианты, из-за чего строение (или количество) кодируемых ими белков у разных людей может отличаться. ДНК человека насчитывает 2,9 миллиардов (2,9 х 109) пар нуклеоти-дов и кодирует около 25 тыс. генов, образующих геном человека (традиционная оценка в 100 000 генов оказалась сильно завышенной) [Lander, 2001]. Следует заметить, что на гены приходится лишь около 30% нуклеотидов (причем собственно на экзоны, кодирующие последовательность аминокислот в белках — менее 1,5%), назначение же остальной части ДНК остается предметом исследований. Расовые и индивидуальные особенности объясняются сравнительно небольшими отличиями генома: у двух людей могут различаться не более 0,05% общего числа нуклеотидов (различия между шим панзе и человеком укладываются в 1%). Варианты последовательности ДНК, которые встречаются в популяции с частотой не менее 1%, называют полиморфизмами, более редкие варианты — мутациями (в принципе, эта грань условна) [Bentley, 2004; Miller, 2005; Sachidanandam, 2001]. Количество распространенных полиморфизмов, встречающихся с частотой не менее 5%, может достигать 7 миллионов; редких полиморфизмов и мутаций намного больше [Bernig, 2006]. Хотя на кодирующие участки ДНК приходится лишь сравнительно небольшая часть полиморфизмов, полиморфные аллели обнаружены почти у всех известных генов. Таким образом, большинство генов имеет несколько различных вариантов, когда-то возникших в результате мутаций и передаваемых из поколения в поколение.
Полиморфизм генов определяет многочисленные различия между людьми, в том числе и различные реакции на лекарственные средства. Это связано с полиморфными аллелями, которые кодируют белки, участвующие в метаболизме препаратов, а также белки-мишени этих препаратов. Соответственно, меняются фармакокинетика и фармакодинамика препаратов, что может вести к снижению эффективности или усилению побочных действий лечения. Например, большое клиническое значение имеет полиморфизм генов, которые кодируют ферменты, сопряженные с цитохромом Р450 — CYP2D6 (метаболизирует бета-адреноблокаторы и ряд психотропных средств) и CYP2C9 (варфарин, фенитоин) [Gardiner, 2006].
В случае противоопухолевой химиотерапии изменение фармакокине-тики цитостатиков может оказаться критическими, так как они обладают крайне узким терапевтическим диапазоном и по токсичности намного превосходят средства, применяемые в большинстве других областей медицины — в той же кардиологии или неврологии. В Таблице 1 представлены 3 наиболее изученных полиморфизма, имеющих значение для химиотерапии: все они приводят к замедлению метаболизма соответствующих цитостатиков и усиливают токсичность лечения.
Цитостатики Ген Полиморфизм Клиническое значение
Фторурацил Капецитабин DPYD Замена нуклеотида с нарушением сплайсинга РНК Нейротоксичность, усиление миелотоксичности и стоматита
Меркаптопурин Тиогуанин ТРМТ Замена нуклеотида с ускорением катаболизма белка Усиление миелотоксичности и риска вторичных опухолей
Иринотекан UGT1A1 Увеличение числа повторов ТА в промоторе со снижением транскрипции Усиление поноса и миелотоксичности
Обозначения генов: DPD — дигидропиримидиндегидрогеназа, ТРМТ — тио-пуринметилтрансфераза, UGT — уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.
В последние годы накапливались обширные экспериментальные и клинические данные, посвященные этим полиморфизмам, и в ведущих онкологических клиниках росла убежденность в необходимости более широкого клинического использования этих данных. Наконец, в 2005 г. Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) постановило внести в инструкцию по применению иринотекана рекомендации по генетическому тестированию в целях снижения риска тяжелых осложнений, в 2006 г. аналогичное решение было принято относительно мер-каптопурина. В случае меркаптопурина изучение полиморфизма гена тиопу-ринметилтрансферазы позволяет избежать угрожающей жизни панцитопении и при лечении острого лимфолейкоза у детей, это исследование уже вошло в повседневную практику в некоторых центрах (детская клиника св. Иуды в Мемфисе, США). Предсказать повышенный риск побочных действий ирино-текана помогает выявление вариантного аллеля глюкуронилтрансферазы — фермента, отвечающего за его инактивацию. В ряде ведущих онкологических клиник исследуется также полиморфизм гена дигидропиримидиндегидроге-назы, недостаточность которой ведет к повышенной токсичности фторураци-ла и его аналогов [Gardiner, 2006]. Накапливаются данные о влиянии на токсичность и эффективность цитостатиков полиморфизма других генов — в частности, кодирующих ферменты, сопряженные с цитохромом Р450 и различные белки-переносчики [Deeken, 2007; Huang, 2007].
Таким образом, определение некоторых полиморфизмов уже перестает быть лабораторной экзотикой и становится клинической практикой, в других случаях еще предстоят многочисленные исследования. Остановимся вкратце на упомянутых полиморфизмах.
Цисплатин: фармакология и фармакогенетика
Цисплатин и его аналоги используются уже более 30 лет и составляют основу химиотерапии многих солидных опухолей, однако многие аспекты его фармакокинетики и фармакодинамики стали известны сравнительно недавно или до сих пор неясны. Основной мишенью препаратов платины является ДНК, повреждение которой вызывает апоптоз опухолевых клеток. Ммногочисленные промежуточные этапы, связанные с проникновением препарата в клетку и его метаболизмом (рис. 1), а также взаимодействием с ДНК и последующей реакцией клетки на повреждение, остаются предметом исследований [Kelland, 2007; Siddik, 2003; Wang, 2005].
Далее мы коротко остановимся на транспорте и метаболизме цисплатина, а затем более подробно обсудим глутатион-Б-трансферазы и белки репарации ДНК, а также обоснуем ключевую роль генов, кодирующих эти ферменты, для фармакогенетики цисплатина. Транспорт через клеточную мембрану
Долгое время считалось, что цисплатин проникает через клеточную мембрану путем простой диффузии. Однако молекула цисплатина гидрофильна, и скорость его диффузии в клетку недостаточна для создания цито-токсической концентрации. На рубеже 80-х—90-х годов появились экспериментальные данные, указывающие на специальные белки-переносчики, но идентифицировать их долгое время не удавалось [Gately, 1993].
Лишь недавно выяснилось, что существенную роль в транспорте цисплатина и его аналогов в клетку и из клетки играют белки-переносчики ионов меди (Cu+) [Ishida, 2002; Komatsu, 2000; Tien Kuo, 2007]. Большая часть цисплатина попадает в клетку с помощью переносчика меди CTR1, в норме обеспечивающего поступление меди. Транспорт цисплатина из клетки осуществляют другие переносчики меди — АТФазы АТР7А и АТВ7В: вначале он выводится в комплекс Гольджи, после чего покидает клетку путем эндо-цитоза. Естественная функция АТР7А — всасывание меди в тонкой кишке, недостаточность этого белка вызывает редкую Х-сцепленную болезнь Мен-кеса; основная задача АТВ7В — экскреция меди в печени и почках, его дефект вызывает болезнь Вильсона [Tien Kuo, 2007].
В выведении цисплатина из клетки участвуют также аналоги Р-гликопротеина (см. выше). Прежде всего, это белок MRP2, меньшее значение имеют белки MRPl, MRP3 и MRP5 [Kelland, 2007; Kruh, 2003]. В отличие от белков АТР7А и АТВ7В, они захватывают не сам цисплатин, а его конъюгат с глутатионом, и выводят его непосредственно в межклеточное пространство. Благодаря локализации не только на клеточной, но и на ядерной мембране белок MRP2 способен выводить цисплатин непосредственно из ядра [Su-rowiak, 2006]. Внутриклеточный метаболизм
Хотя основной точкой приложения цисплатина служит ДНК, в ядре обычно содержится не более 1% препарата, попавшего в клетку. По-видимому, это связано с отсутствием в ядерной мембране белка-переносчика CTR1 (тогда как там содержится MRP2, выводящего конъюгат цисплатина в цитоплазму), а также с быстрой внутриклеточной инактивацией цисплатина [Tien Kuo, 2007].
Внутри клетки концентрация ионов хлора (СГ) примерно на порядок ниже, чем в межклеточной жидкости и плазме. Это способствует гидролизу цисплатина, в результате чего атомы хлора замещаются водой и образуются активные электрофильные моно- и диаквапроизводные цисплатина, которые активно реагируют с нуклеофильными группами, прежде всего тиоловыми группами белков (в составе цистеина и метионина), а также азотистыми основаниями ДНК (см. ниже).
Основную роль в связывании цисплатина и его аналогов играют богатые тиоловыми группами трипептид глутатион (у-глу-цис-гли) и группа низкомолекулярных белков — металлотионеинов. Глутатион и металлотионеи-ны участвуют в защите клетки от эндогенных и экзогенных токсических веществ — свободных радикалов, супероксидов, тяжелых металлов, канцерогенов и проч., а также связывают многие цитостатики, прежде всего производные платины и алкилирующие средства.
Связывание с глутатионом резко снижает активность цисплатина в отношении ДНК; кроме того, как говорилось выше, образующийся конъюгат (2 молекулы глутатиона связывают 1 молекулу цисплатина; рис. 2) быстро выводится из клетки под действием белков-переносчиков из семейства MRP [Kelland, 2007; Tien Kuo, 2007; Yang, 2006].
Генетическое тестирование
Все генетические исследования проводились в Институте молекулярной генетики (ИМГ) РАН, в отделе молекулярных основ генетики человека.
Перед началом химиотерапии у всех больных однократно (обычно непосредственно перед 1-м циклом) забирали по 10 мл крови в специальные пробирки, содержащие 1 мл 0,5М раствора ЭДТА (рН 8,0) в качестве консерванта. Образцы крови в течение 7 дней доставлялись в ИМГ РАН для переработки и выделения ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. Была использована следующая схема [Milligan, 1998]: 1) Осаждение ядерной фракции из содержащих сахарозу лизатов цельной крови с последующим ресуспендированием осадка в соответствующем буфере. 2) Депротеинизация образцов ядерной фракции с помощью протеиназы К (100 мкг/мл) в течение 16 часов при 42 С. 3) Экстракция ДНК из гидролизатов двукратной обработкой смесью фенол-хлороформа. 4) Осаждение ДНК из водной фазы 96% этанолом, охлажденным до -70 С. 5) Ресуспендирование ДНК в деионизированной воде. Полученные водные препараты ДНК использовались для генетического анализа.
Далее методом полимеразной цепной реакции (ГЩР) были амплифици-рованы фрагменты ДНК, содержащие изучаемые полиморфизмы. Каждый цикл ГЩР включал комбинацию стадий денатурации, отжига и элонгации, специфичную для различных пар праймеров. Использованные праймеры представлены в таблице 4. ТАБЛИЦА 4 ИЗУЧЕННЫЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ И ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ПРАИМЕРЫ
XRCC1 Arg3yyGln 5 -CAA GTA CAG CCA GGT CCT AG-3 5 -CCT TCC CTC АТС TGG AGT AC-3 Matullo, 2001 Для амплификации фрагментов генов GSTT1 и GSTM1 проводилась мультиплексная ПЦР, в которой внутренним контролем служила амплификация участка 4-го экзона гена GTP-циклогидролазы 1 (праймеры: 5 -GTC СТТ ТТТ GTT ТТА TGA GGA AGG С-3 и 5 -GGT GAT GCA CTC TTA TAA TCT С AG C-3 ). Амплификация остальных фрагментов выполнялась по обычной методике. В случае GSTT1, GSTM1 и GSTM3 продукты ПЦР были непосредственно использованы для анализа генотипов. Остальные ПЦР-продукты подвергались расщеплению с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции (2—5 ед. фермента на пробу): GSTA1 — Earn 11041, GSTP1 Ilel05Val — Alw26I, GSTP1 Ala114Val — Bshl236I, ERCC1 118C/T — Tail, ERCC1 C8092A — MboII, XPD Asp312Asn — ЕсоІЗОІ, XPD Lys751Gln — PstI, XRCC — Mspl (все рестриктазы произведены компанией Fermentas АВ, Вильнюс, Литва; ссылки — см. табл. 3).
Рестрикцию проводили непосредственно в реакционной смеси, в которой протекала ПЦР, предварительно разбавляя смесь и уравновешивая ее буфером, оптимальным для используемого фермента. Время инкубации ферментов в реакционной смеси составляло 15 ч при температуре 37—65С. Далее выполнялось генотипирование тестируемых полиморфных локусов, основанное на оценке различия длин рестрикционных фрагментов. Анализ продуктов амплификации и рестрикции проводили с помощью электрофореза в 2,5%-ном агарозном геле. 2.3. Статистическая обработка
На завершающем этапе клинические данные были сопоставлены с результатами генетического анализа. По каждому из изученных полиморфизмов больные разбивались в зависимости от генотипа на 2 или 3 группы, которые сравнивались между собой по описанным выше параметрам эффективности и токсичности химиотерапии. Исследовались также сочетания генотипов, для которых были выявлены статистически значимые различия или явные тенденции.
Для статистической обработки данных использовался пакет программ STATISTICA 6.0 [Реброва, 2003]. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия х в случае малых выборок рассчитывался точный критерий Фишера. Различия считались достоверными при р 0,05. Кривые выживаемости были построены по методу Каплан—Майера, для сравнения между группами использовался критерий log rank. Глава 3. Результаты 3.1. Клинические данные
Общая характеристика больных Включение больных в исследование продолжалось с мая 2003 по июнь 2007 г. Информированное согласие подписали 109 больных. Пятеро из них были исключены из исследования до начала лечения в силу следующих причин: у одной больной в процессе дополнительного обследования диагноз рака яичников был отвергнут, у одной был выявлен сопутствующий хронический миелолейкоз; остальные трое в процессе обследования отказались от химиотерапии или генетического тестирования. Таким образом, химиотерапию в рамках исследования получили 104 женщины.
Возраст больных составил 23—65 лет (верхняя граница была ограничена критериями включения, см. выше) при медиане 52 года.
Распределение больных в зависимости от морфологической структуры опухоли было следующим: серозная аденокарцинома — 82 больных (высо-кодифференцированная — 12 больных, умеренно дифференцированная — 32 больных, низкодифференцированная — 23 больных, без уточнения степени — 15 больных), муцинозная аденокарцинома — 7 больных, светлоклеточная аденокарцинома — 2 больных, аденокарцинома без дополнительного уточнения — 11 больных, рак без дополнительного уточнения — 2 больных.
У большинства больных — 74 (71,2%) — была диагностирована III стадия рака яичников; I, II и IV стадии заболевания имели соответственно 13, 7 и 10 больных. Локализация отдаленных метастазов у больных с IV стадией оказалась следующей: плеврит — 4 больных, печень — 4, лимфоузлы — 3, селезенка — 1, надпочечник — 1 (9 больных имели отдаленные метастазы лишь одной локализации, у одной больной были метастазы в печень, селезенку и лимфоузлы). Среди всей группы асцит определялся у 37 больных (36%), 19 (18%) имели стелющийся опухолевый инфильтрат в малом тазу, 10 (10%) — метастазы по капсуле печени, 8 (8%) — метастазы в регионарные лимфоузлы.
32 больных получали химиотерапию до операции (в неоадъювантном режиме, сроки последующей операции определялись индивидуально в зависимости от эффекта лечения), остальные 72 — после операции. В последней группе у 21 больной химиотерапия была адъювантной (в случае радикальной операции и при нормальном уровне СА-125), в том числе у всех 13 женщин с I стадией, 6 из 7 женщин со II стадией и у 2 — с III стадией заболевания. 51 больная получала лечебную химиотерапию (после операции сохранялась остаточная опухоль или повышенный маркер СА-125). Демографические и клинические характеристики больных обобщены в таблице 5.
ТАБЛИЦА 5 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ Общее число — 104 Возраст 23—65 лет Медиана — 52 года Распределение по стадиям: I ст. — 13 больных (12,5%) II ст. —- 7 больных (6,7%) III ст. — 74 больных (71,2%) IV ст. — 10 больных (9,6%) Варианты химиотерапии: Неоадъювантная — 32 больных (30,8%) Адъювантная — 21 больная (20,2%) Лечебная — 51 больная (49%) Всего было проведено 506 циклов химиотерапии, 60 больных получили все запланированные 6 циклов лечения, 4 больных — по 5 циклов, 22 — по 4 цикла, 6 — по 3 цикла, 8 — по 2 цикла и 4 — только по 1 циклу химиотерапии. 44 больные прекратили лечение досрочно: в 23 случаях причиной стали побочные действия, в 11 — прогрессирование болезни или недостаточный эффект, в 6 — отказ больной от завершения химиотерапии; у 4 больных с I стадией лечение было ограничено 4 циклами ввиду благоприятного прогноза.
Корреляция клинических и генетических данных
Связь между результатами химиотерапии и генотипом оказалась наиболее сильной для полиморфизма GSTP1 Не 05Val. Полные ремиссии несколько чаще встречались при генотипе Ие/Пе (у 50% больных) по сравнению с остальными генотипами (у 42% больных), однако эти различия статистически не значимы (р = 0,48 для %2, рис. 9).
Намного более выраженной оказалась связь с отдаленными результатами: время до прогрессирования у женщин с генотипом Пе/Пе было достоверно выше, чем у остальных больных, то есть при генотипах lle/Val и Val/Val (log-rank test, р = 0,00027; рис. 10А). Особенно бросается в глаза рас хождение кривых после 8 месяцев. Расчетная медиана времени до прогресси-рования в группе Пе/Пе составляет 23,5 месяцев, то есть примерно вдвое больше, чем для всей группы. Для группы Ile/Val этот показатель составил 10 месяцев, для группы Val/Val — лишь 7 мес. Медиана общей выживаемости в группе Ile/Val составила 25 месяцев, в других группах она не достигнута. Хотя различия в выживаемости между группами Пе/Пе и Ile/Val статистически достоверны (log-rank test, р = 0,04), при объединении групп Ile/Val и Val/Val значение р возрастает и статистическая значимость утрачивается. В любом случае, очевидна тенденция в пользу женщин с генотипом Пе/Пе (log-rank test, р = 0,14); расхождение кривых начинается на полгода позже, чем в случае времени для прогрессирования, и становится заметным к 2 годам (рис. 10Б).
Любопытна судьба больных с генотипом Val/Val. Эта группа насчитывала 10 человек, но две женщины выпали из-под наблюдения вскоре после прогрессирования; вероятно, они умерли в течение 12—24 мес. от начала химиотерапии, но точных данных нет. Все прослеженные больные с этим генотипом еще живы, хотя у 7 из 8 отмечено прогрессирование, причем в большинстве случаев достаточно быстрое. В целом, эти женщины показали достаточно высокую чувствительность к химиотерапии, включая препараты, использованные во 2-й и последующей линиях (см. Обсуждение, раздел 4.2).
Время от начала химиотерапии, мес. 54 Рисунок 10. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников в зависимости от полиморфизма GSTP1 Ile105Val. A — время до прогрессирования, Б — выживаемость. 1 — генотип Ile/Ile, 2 — генотипы Ile/Val и Val/Val. В случае полиморфизма GSTP1 Ala114Val прослеживалась лишь слабая тенденция в пользу генотипа Ala/Ala для времени до прогрессирования (рис. ПА) и общей выживаемости (рис. 11Б). Заметной зависимости непосредственной эффективности химиотерапии (частоты полных ремиссий) от этого полиморфизма также не обнаружено. Обращает на себя внимание неравновесное сцепление между полиморфными аллелями GSTP1: среди 26 женщин с генотипом II4Ala/Val было лишь 2 гомозиготы по генотипу 10511е (р 0,001). Сочетание генотипов GSTP1 114Ala/Val и 105Ile/Val или Val/Val не оказывало статистически значимого влияния на время до прогрессирование (р = 0,25) или выживаемость (р = 0,85).
Рисунок 11. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников в зависимости от полиморфизма GSTP1 Ala114Val. А — время до прогрессирования, Б — выживаемость. 1 — генотип Ala/Ala, 2 — генотип Ala/Val. Делеция гена GSTM1 была сопряжена с некоторым увеличением частоты полных ремиссий (50% по сравнению с 40% при хотя бы одном функциональном аллеле, таблица 8), однако эти различия были далеки уровня статистической значимости, как и в случае полиморфизма GSTP1 Ile105Val (р = 0,36 для критерия % ).
