Введение к работе
Актуальность работы определяется тем, что она посвящена поиску новых путей регуляции Фенотипа клетки, связанных с меж- . деточннмн взаимодействиями, взаимодействиями клеток с внекле-очным матрикиом, изменениями клеточной формы. Под фенотипом в данном случае понимается набор признаков, объединяющих как морфологические характеристики гепатодита, так и экспрессию различных сывороточных, цитоскелетных и мембранных маркеров, локализацию мембранных домен-спенифйческих антигенов, функционирование. Еыеокппроницаемых межклеточных контактов.
Изучение регуляции экспрессии различных признаков, входя-tEjtt в этот наРор, привело нас к пониманию того, что они являются членами дискретных блоков - эмбрионального и взрослого. Нэ-сомненно. что к вышеперечисленным признакам относятся также и прслиг^ративннЛ статус клетки, а таюке экспрессия онкогенов. Как экспрессия раково-эмбриональных антигенов и изоферментов, так пролиферация гепатоцитов и экспрессия ряда онкогенов, входят, как нам.представится, в "<шбркональный" блок признаков, активно ра'ботаТбщий. в развивающейся и регенерируюпгй печени, а
- 2 -так* в гепатоцеллшшрных карциномах. Как в ходе эмбрионального становления организации печени, так и в процессе регенврацик существуют рвгуяяторные ывхаинвми, вьашзчавдие ,,эuбpиoнaльныfi,, блок признаков и вюючагаше "взрослый".
Конечно яэ, регуляция экспресс:^ генов связана непосредст-бэнно с событиями, изучение которых возмохшо лишь на молекудяр-ио-биологкческоц уровне. Однако многие набладаеііш нами и другими авторами закономерности позволяют предположить суіззствова-ние иного уровня регуляции - тканевого. Именно изучению этоп уровия регуляции и посвящена настоящая работа. Под тканевьс уровнем в дальнейшем мы будем подразумевать весь комплекс вваи-ыодействий, протекающий в многоклеточных сообществах, сосредо точась в основной на кант&ктиьк взаишдействиях клеток и и взаимодействиях с внеклеточным ыатриксом. Несомненно, сюда ю следует отнести различные дистантные воздействия - ростовы факторы, іюдиатори и гормоны. Ш, однако, практически не буде; рассматривать эти воздействия. Их детальное изучение заслуззша ет отдельной работы.
Цель и задачи работы. Целью настоящей диссертационной ра боты являлось изучение закономерностей экспрессии АФП и выяс снекие основных характеристик тканевого уровня регуляции эксп рессии этого белка, роли межклеточных взаимодействий и вааимо действий клеток с внеклеточным матриксом в регуляции синтез v АФП. В соответствии с этим задачи работы заключались в следук вам:
-
Поиск иммунологических паркеров, ' характеризующих прс цессы становления и нарушено^ дефинитивной балочной структур печени.
-
Иммуноыорфологическое изучение закономерностей синтез АФП, в сочетании с другими маркерами гепатоцитов, в развивал вейся и регенерирующей печени мышей, а также в диффер-нцирова* ных спонтанных гзпатоцеллюдярных карциномах мышей.
-
Изучение ваконоиерностей ро-экспрессии АФП в первичні ыокослойных культурах взрослых мышиных гепатоцитов.
-
Конструирование модельных систем in vitro, позволяют сохранить в культуре дифференцировочные признаки гепатоцитов изучение в этих культурах закономерностей индукции и ингиоиці синтеза АФП.
-
Изучение влияния компонентов внеклеточного матрикса и его физической организации на синтез АФП in vitro.
-
Кзучевие возможной роли высокопроницаемых шжсветочнья контактов в регуляции синтеза АФП.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа относится, в основном, к фундаментальным исследованиям. В ней впервые описаны закономерности ре-экспрессии раково-эмбрионального сывороточного белка альфа-фетопротеина, позволяющие с уверенностью утверждать, что его обратимая супрессия во взрослом организме определяется межклеточными взаимодействиями. Это подтверждено как наблюдениями in vivo, так и прямыми опытами in vitro с первичными культурами взрослых гепатоцитов из интактной печени мышей. Впервые обнаружена отчетливая обратная корреляция между функционированием высокопроницаемых контактов в гепатоци-тах и экспрессией в них альфа-фетопротеина. Впервые найдено, что трехмерная организация искусственного внеклеточного матрикса в культуре гепатоцитов является необходимым и достаточным фактором ингибиции "эмбрионального" фенотипа гепатоцита Обнаружено, что сама по себе форма гепатоцита является важнейшим фактором регуляции экспрессии фетальных и взрослых признаков в гепатоците. Описание, наряду с вышеперечисленным, топографических закономерностей распределения различных гепатоцитарных маркеров в развивающейся, взрослой, регенерирующей печени, а такяз в первичных гепатомах позволило сформулировать и конкретизировать представления о тканевом уровне регуляции синтеза как альфа-фетопротеина, так и всего фенотипа гепатоцита. Эти представления открывают перспективы изучения коррекции на тканевом уровне трансформированного (опухолевого) фенотипа клеточных популяций. С этим связано основное значение работы в теоретическом аспекте. Наряду с этим, разработанные в ходе работы модели реконструкции взрослой печени в тканевой культуре могут иметь и практическую ценность, поскольку они могут быть использованы для исследования различных гепатотропных препаратов in vitro, а такне и в других экспериментальных работах, иудцакдихся в куль-туральных моделях печени.
Публикации и апробация работа to твт диссертации опубликовано 23 работы. Материалы рботы были долонвны на VII
(Marburg, FRG, 1979), VIII (Таллин, 1980). XIV (Hebnikl, Finland, 1986). XVII (Freiburg, KRG, luu9) и XVIII (Москва, 1990) ежегодных конференциях международного общества раково-эм-Сриональной биологин и медицины; на I соне :кп французском симпозиуме по иммунологии опухолей (Москва, 1978); на В;ЄС0ЮЗН0М совещании "Иммунологические аспекты биологии развития" ('4осква, 1982); на II советско-французском симпозиуме ио иммунологии опухолей (москва, 1986); на всесоюзном совещании "Проблемы детерминации" (москва,1988); на II симпозиуме "Hepatic Gene Function in Health and Disease" (Cold Spring Harbor, USA, 1989); на симпозиуме "Sapporo seminars on cancer and differentiation" (Sapporo, Japan, 1989).
Работа проведена в основном с помощью морфологических и иммуногистохимических и иммуиохимических методов.
1. Изучение локализации различных антигенов в развивающейся, нормальной, регенерирующей печени мышей и в гепатомах. .
Проводились исследование локализации АФП. альбумина, тран-сферрина; мембранных антигенов геиатоци/ов мыши - т. н. антигена желчных капилляров (АГ I), АГ II. рецептора к асиалогликопроте-инам; компонентов внеклеточного матрикса - фибронектина, лами-нина, энтактина, коллагена IV типа, генаран-сульфат протеогли-кана; элементов цитоскелета - цитокератина с мол. массой 49 кДа, внментина и актина
Выявление вышеназванных антигиюн проводили либо неарямьь
ИММУНОфЛУОреСЦеНТНЫМ МеТОДОМ, ЛИСи НеПрИМММ ИММуїКИ.с.'риКСИДаЗНЬа
иетодом. либо пероксидазнш угодам н---моч^ных члгител с исполь-вованием ПАІЬкомплекса. Для ьи,івлени>і ги. .,--ті -чных и мембранньо антигенов использовали материал, залигый в парафин после фиксации либо смесью формалин ацетон-Фосфашый буфі.р (0.03 U.pl 6.1), либо 10Х формалином на 0.1M фосфатном буфере ;' 7.3, либс смесью параформ-лизин-перйодат Na Is ряле ел, чаев был использован материал, зафиксированный безводным ацетоном с последующе* проводкой через петролейний эфир (см. Глейб*рм.ш и др. ,1979; Engelhardt et al. ,1979. Компоненты цитоскелета выявляли как ш криостатных срезах из нефиксированного замороденного материале с последующей фиксацией срезов либо 1071 формалином, либо ацетоном, так и на парафиновых срезах после фиксации смесью пара-
- Б -
форм-лизин-перйодат Na. В последнем случае, депарафинированные срезы перед обработкой антителами инкубирогали в течение 30 мин с 0.25Х раствором трипсина (см. Глейберман и др. ,1984). Компоненты внеклеточного матрикез выявляли на криостатиых срезах ив нефиксированного материала с последующей фиксацией срезов либо 10Х формалином, либо ацетоном. В ряде случаев для выявления сывороточных белков проводили блокировку их секреции. Для этого за 2-А часа до фиксации мыяш инъецировали внутрибрюамнно колхицин из расчета 50 нкг на г веса (CM.Glelberman et al. ,1980).
2. Культуры гепато-щргов из взрослой интактной печени мышей
а) монослопные культуры
Суспензию гепатоцитов получали после перфузии печени in situ последовательно растворами ЭГТА и коллагеиазы. Суспензию клеток помешали в пластиковые бактериологические чашки Петри диаметром 40 ті, которые обычно предварительно покрывала иела-тиной. В ряде экспериментов в качестве субстрата использовали другие компоненты внеклеточного матрикса - коллаген I типа, фибронектин, ламинин. Культивирование проводили в среде Лейбо-вича L-15 с 107. феталыюй сыворотки (см. Глейберман, 1982).
б) культуры с использованием кол.тагенового геля
Коллагеновыя гель готовили из раствора уксуснокислого коллагена
I типа, выделенного из хвостовых сухожилий крыс. Уксуснокислый
коллаген на холоду смешивали в соотношении 4:1 с 5-кратной сре
дой Лальбекко, содержащей 0.125 М NaOH и 0.26 М NaHCOg. Затем
смесь вносили в чашки для культивирования и помешали в термос
тат на 37С на несколько минут для полимеризации. При культиви
ровании внутри коллагенового геля после прикрепления гепатоци-
тов к коллагеновому субстрату в чашки вносили дополнительную
порцию смеси коллагена со средой для полимеризации и после
окончанию полимеризации вносили полную среду для культивирования
(CM.Gleiberman at al. ,1989). Среду меняли ежесуточно.
в) ко-культуры гепатоцитов с крысиными эпителиальная! клет
ками печени
Методика ко-культивирования гепатоцитов с эпителиальными клетками печени впервые была разработана в лаборатории A-Guillouzo (см. A. Guillouzo.C. Guguen-Gulllouzo. 1986). Ш слегка модифицировали эту методику, убрав из культуральной среды глгкокортико-иды и уменьшив клеточную плотность. В культуральнно чашки диа-
метром 40 мм вносили около 3 х 10 живых гепатоцитов и после № прикрепления спусія примерно 2 часа добавляли около б х 10 крысиных эпителиальных клеток линии IAR-20. Среду в этих культурах меняли 2-3 рааа в неделю.
3. Иммуногиетологичеекое и иммунохимическое изучение культу; гепатоцитов
Локализацию вышеперечисленных антигенов в культурах гепа тоцитов проводили непрямыми иммунофлуоресцентным и имыуноперок сидазным иетодами. Культуры фиксировали 10Х формалином на забу ференном физиологическом растворе с добавлением 0.05Х сапонин как в фиксатор, так и в последующие промывочные растворы и растворы антител, для пермеабилигацин клеток В ряде случае для выявления промежуточных филаментов перед фиксацией клетк обрабатывали IX раствором тритона на физиологическом растворе Актин выявляли с помощью меченого TRITC фаллокдина.
СеКреЦИЮ СЫВОРОТОЧНЫХ беЛКОВ В СреДУ ИЗуЧаЛИ С ПОМОЮ)
иаотахофореза на ацетат-целлюлозных мембранах с последующим № мунологическим проявлением после кросс-электрофореза в агарозу содержащую актисьгаоротки к соответствующим белкам. В ряде сад чаев АФП в среде полуколичественно измеряли реакцией пассивнс гемаггхютинации с бараньими эритроцитами, нагруженными антюк лами к AMI (см.Глейберман.адьгорт,1984).
А. Изучение высокопроницаемых контактов в культуре Высокопроницаемые контакты (ВПК) изучали с помощью ннъе» ции в клетки флуоресцентного красителя ' Люциферового излтоп Инъекции проводили на люминесцентном микроскопе Люмам И-2 п< фазовым контрастом с водноимкерсионним объективом 40х с помовд стеклянного микроэлектрода с диаметром отверстия меньве 1 мга Поступление красителя в клетки обеспечивалось нонофоревом. Сті пень выраженности ВПК регистрировалось по двум параметрам - і числу клеток, в которые перетекал краситель за 2 минуты пос инъекции ("степень связи") и по проценту инъекции, при котор наблюдалось перетекание в соседние клетки ("процент связи"), кадаую временную точку проводилось не менее И инъекц (см. Глейберман и др. ,1987; Gletbennan et al.,1989; Глейберма Шаровская.1990).
- 7 -5. Антитела, использованные в работе
В работе использовали кроличьи аффинно очищенные антитела к мышиному АФП. Их выделение из соответствующих моиоспецифичес-ких антисывороток проводили на иммуюеорбегпе на основе цианб-ромированной сефарозы 4В, содержащем злектрофоретически чистый АФП. Кроличьи аффинно очищенные антитела к мышиным альбумину и траясферрину были предоставлены В. С. Полтораяиной и RB. Энгель-гардт (ВОНЦ АШ СССР); кроличья моноспецифическая антисыворотка к мышиному рецептору к асиалогликопротеинам - Д. М. Беленьким (ЙБЮС АМН СССР); к коллагену IV типа мыши - Е. Йнгвал (США); к фибронектину, ламинику, гепаран-сульфат протеогликану - А. В. Любимовым (ЮЩ АМН СССР), к цитокератину 49 кДа - С. М. Трояновским (ВОНЦ АШ СССР); к виментину - И. М. Тинт (МГУ); к антигену яелчных капилляров (I АГ) и к АГ II мышиных гепатоцитов -Н. И. Куприной и Т. Д. Рудинской (ВОНЦ АМН СССР).
