Введение к работе
Актуальность темы. Рак печени различного генеза в настоящее время имеет широкую распространенность и является острейшей медико - социальной проблемой. Ежегодно в мире от гепатоцеллюлярной карциномы погибает 1 25000 человек. Заболеваемость этим злокачественным новообразованием имеет географические отличия. В Европе злокачественные опухоли гепатобилиарной зоны встречаются у 1 - 3 чел. на каждые 100 тыс. населения, в различных регионах Африки и Дальневосточной Азии ими заболевают 10 - 15 чел. на 100 тыс. населения [Шерлок Ш., Дули Дж., 1999]. В России первичный рак печени составляет 3 - 5 % в общей структуре злокачественных новообразований. Ежегодно регистрируется более 8000 новых случаев заболевания. Мужчины заболевают в 2 раза чаще, чем женщины. В 1992 году показатель заболеваемости раком печени и внутрипеченочных желчных протоков в России составил 5,7 на 100000 населения, а в 2001 году - 4,9 на 100000 населения [Ганцев Ш.Х., 2004]. В России наибольшие показатели заболеваемости данным злокачественным новообразованием были отмечены в республике Саха (Якутия) - 11,0 на 100000 населения.
Исследование механизмов гепатоканцерогенеза является актуальной задачей современной онкологии. Известно, что злокачественная трансформация сопровождается прибавлением клеточной массы, которое опережает клеточную гибель либо за счет активации процессов пролиферации, либо вследствие угнетения процессов апоптоза, а чаще всего - за счет сочетанного нарушения этих обоих процессов [Григорьев М.Ю. 2003; Фильченков А.А., 1998; Wells А., 1999]. Блокирование процесса апоптоза, связанное с постоянным действием промоторов опухолевого роста, приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток, которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях [Лихтенштейн А.В., Шалот B.C., 1998; Cohen J.J., 1993].
Долгое время считалось, что традиционно используемые в онкологической практике лекарственные препараты вызывают гибель опухолевых клеток путем повреждения ДНК или блокирования в них важнейших путей метаболизма [Стручков В.А., Стражевская Н.Б., 2000]. Сейчас достоверно известно, что антибластомная активность многих из этих препаратов также связана со способностью индуцировать в клетках - мишенях апоптоз [Фильченков А.А., 1998; Eastman А., 1990; Sachs L., 1993; Story М., 1998]. Поэтому поиск и отбор лекарственных средств, способных индуцировать апоптоз, представляет собой важное направление в оптимизации схем терапии злокачественных новообразований.
Благодаря успеху липидологии стало известно, что липиды являются не только основным структурными элементом клеточных мембран, но также играют определяющую роль в различных клеточных процессах, в том числе -пролиферации и апоптозе. Важное значение в регуляции клеточных функций
принадлежит продуктам расщепления сфингомиелина: нерамиду и сфингозину [Liskovich М., 1994; Hakomory S. - 1995; Hannun Y.A., 1996; Divecha N., 1995]. Известно, что сфинголипиды являются иммуномодуляторами и вторичными мессенджерами, играющими существенную роль в гистогенезе тканей, росте и дифференцировке клеток, онкогенезе [Алесенко А.В 1998; Дятловицкая Э.В. 1998; Стручков B.C., Стражевская Н.Б.2000; Hannun Y.A., 1997; Don, M.D. Rockey, 2001; Divecha N., 1995].
Актуальной задачей является изучение роли компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции пролиферации и апоптоза при гепатоканцерогенезе, что в дальнейшем может служить основой для поиска новых препаратов, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака печени и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией.
Цель работы - изучить роль компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции процессов пролиферации и апоптоза при экспериментальном гепатоканцерогенезе. Задачи исследования:
Оценить влияние сфингомиелина и церамида на морфологическую картину печени крыс в процессе экспериментального гепатоканцерогенеза.
Изучить влияние сфингомиелина и церамида, заключенных в липосомы, на пролиферативную активность и индукцию апопгоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы на модели in vitro.
Оценить изменение пролиферативной активности и индукции апоптоза клеток печени крыс в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также при курсовом вігутривенном введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, в динамике гепатоканцерогенеза на модели in vivo.
Исследовать активность сфингомиелиназы и церамидазы, содержание компонентов цикла сфингомиелина (сфингомиелин, церамид, сфингозин) в норме и в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также после курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака.
Научная новизна
Впервые показано, что курсовое введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне индукции гепатоцеллюлярного рака приводило к более длительному течению воспалительного процесса и задержке формирования гепатоцеллюлярной карциномы до 35 суток по сравнению с группой животных - опухоленосителей, без введения липосом. При введении липосом, нагруженных церамидом, на фоне введения N - нитроздиэтиламина, отмечено наличие минимальной степени выраженности воспалительного процесса и не выявлено структур злокачественных опухолей на протяжении всего периода наблюдений.
Впервые проведено комплексное исследование влияния метаболитов цикла сфингомиелина, заключенных в липосомы на активность пролиферативньгх процессов и индукцию апоптоза трансформированных
гепатоцитов в динамике геаптоканцерогенеза на моделях in vitro и in vivo. Выявлено, что сфингомиелин, введенный в составе липосом, в моделях in vitro и in vivo, на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы приводит к наибольшему подавлению уровня пролиферации и наиболее выраженной индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях опухолевого роста (до 35 суток). При введении церамида, заключенного в липосомы, аналогичное влияние на изучаемые показатели наблюдалось на поздних стадиях (60 - 90 сутки) формирования гепатоцеллюлярного рака.
Впервые показана корреляционная зависимость между увеличением содержания сфингомиелина и повышением пролиферативной активности клеток гепатоцеллюлярной карциномы в процессе канцерогенеза. При этом отмечена обратная корреляционная зависимость между снижением содержания церамида и сфингозина и повышением пролиферативной активности трансфомированных гепатоцитов.
Установлено, что курсовое введение липосом, нагруженных церамидом на фоне введения N - нитроздиэтиламина iv vivo приводит к активации сфингомиелиназы и церамидазы и повышению содержания церамида и сфингозина с достижением максимальных значений данных показателей на 60 - 90 сутки наблюдений, что способствует, по данным корреляционного анализа, наибольшему снижению пролиферативной активности и индукции апоптоза гепатоцитов на данном этапе наблюдений. Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели клеток метаболитами сфингомиелшювого цикла в динамике гепатоканцерогенеза. Данные о взаимосвязи активности ключевых ферментов сфингомиелинового цикла с интенсивностью процессов пролиферации и апоптоза могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биохимических характеристик трансформированных гепатоцитов, которые, в свою очередь можно использовать в качестве факторов прогноза опухолевой трансформации. Полученные данные показывают принципиальную возможность использования сфингомиелина и церамида с целью ингибирования гепатоканцерогенеза и служить основой для создания новых противоопухолевых и антиканцерогенных средств.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Введение липосом, нагруженных церамидом, приводит к подавлению
экспериментального гепатоканцерогенеза, индуцированного N-
нитроздиэтиламином, и препятствует формированию гепатоцеллюлярной
карциномы.
2. Введение липосом, нагруженных сфингомиелином, в моделях in vitro и in
vivo, приводит к наиболее выраженному подавлению пролиферации и
индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях
формирования гепатоцеллюлярной карциномы.
3. Введение церамида, заключенного в липосомы, при индукции
гепатоцеллюлярного рака на моделях in vitro и in vivo подавляет
пролиферацию и активирует апоптотическую гибель трансформированных
гепатоцитов на поздних стадиях гепатоканцерогенеза.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 2 статьи в
журналах, рекомендованных ВАК.
Апробация работы
Основные результаты работы представлены на VIII Российско -Корейском Международном симпозиуме (Томск, 2004); на конференции молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005); симпозиуме FEBS № 05 - 28W «Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders», (Dijon, France, 2005); V Сибирском Физиологическом съезде, (Томск, 2005); 9th International Conference «Eicosanoids and Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation and Related Diseases», (San Francisco, USA, 2005); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», (Тюмень, 2005); на региональной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», (Томск, 2006); на Всероссийской научно - практической конференции «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», (Казань, 2006). Объем и струїсгура диссертации
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками и 19 таблицами, и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты и их обсуждение», «Список литературы». Библиография включает 171 литературный источник, в том числе 80 отечественных и 91 иностранных.
