Содержание к диссертации
Введение
Глава 1... Эпидемиология, диагностика, лечение и мониторинг рака шейки матки . 16-22
Глава 2. Материалы и методы . 65-110
Глава 3. Результаты исследования. Рак шейки матки у женщин Республики Карелия . 110-161
Глава 4. Вирусологические, иммунологические, молекулярно-генетические методы диагностики РШМ 162-221
Глава 5. Модель вторичной профилактики преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки . 222-264
Заключение 265-271
Выводы 271-273
Практические рекомендации . 274
Список сокращений и условных обозначений 274-276
Список литературы 277-318
Приложения 319-320
- Эпидемиология, диагностика, лечение и мониторинг рака шейки матки
- Результаты исследования. Рак шейки матки у женщин Республики Карелия
- Вирусологические, иммунологические, молекулярно-генетические методы диагностики РШМ
- Модель вторичной профилактики преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки .
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно статистическим данным WHO/ICO (http://www.who.int/hpvcentre), рак шейки матки (РШМ) – второе по встречаемости онкологическое заболевание среди женщин и является одной из главных причин смертности женщин, страдающих онкологическими заболеваниями [Ferlay J, et al., 2013]. Пятилетняя выживаемость больных РШМ в России составляет не более 45%, при I стадии этот показатель достигает 86,7%, при II – 51,7%, а при III – 31,6% [Мерабишвили, В.М., и соавт., 2012, Чиссов В.И., и соавт., 2011, Давыдов М.И., и соавт., 2011]. Несмотря на то, что за последние годы в России отмечен незначительный рост показателей 5-летней наблюдаемой и относительной выживаемости больных РШМ с 46,1 до 49,3% наблюдаемой и с 51,5% до 54,3% относительной выживаемости за 1994-2000гг и 2001-2005 гг [Мерабишвили В.М., и соавт., 2012], около 50% больных инвазивными формами РШМ не переживают пятилетний период наблюдений после лечения В странах Европы [Berrino F. и соавт., 2003; Sant M., и соавт., 2009], и США показатель 5-летней относительной выживаемости несколько выше, но не превышает 70% [Verdecchia A., и соавт., 2007]. Таким образом, в настоящее время усовершенствование методов лечения инвазивных форм РШМ не решает проблему снижения смертности от этого заболевания, которая является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний у женщин 15-39 лет [Чиссов В.И., и соавт., 2009]. Поскольку РШМ – единственная злокачественная опухоль, для которой установлен доказанный этиологический фактор – вирус папилломы человека (ВПЧ) и существует надежный метод цитологического скрининга решение проблемы снижения смертности от РШМ лежит в русле снижения заболеваемости инвазивными формами. Низкая заболеваемость РШМ наблюдается в странах с высоким экономическим уровнем, где и зависящим от него уровнем применяемых в стране профилактически мер, и, прежде всего, с уровнем цитологического скрининга и охвата женского населения этим скринингом [Бахидзе Е.В. и соавт., 2012].
Результаты многочисленных исследований показывают, что отсутствие в большинстве регионов РФ организованного цитологического скрининга (ЦС), как основного механизма вторичной профилактики РШМ, не позволяет выстраивать эффективную систему противораковых мероприятий в данной области [Давыдов М.И., и соавт., 2011, Леонов М.Г., 2011, Лялина Л.В., 2011, Мерабишвили В.М. и соавт., 2012, Хасанов Р.Ш. и соавт., 2011]. В связи с этим представляется целесообразным провести анализ клинико-эпидемиологической обстановки в отдельном регионе (Республике Карелия. РК) за 15 летний период (1998—2012 гг), который позволит оценить имеющийся уровень ранней диагностики РШМ и сопоставить ее с показателями охвата ЦС в районах.
С другой стороны, значительный рост РШМ, высокий процент запущенных форм, малоудовлетворительные результаты лечения определяют необходимость поиска новых методов углубленной диагностики и оценки степени распространения РШМ [Ашрафян Л.А., и соавт., 2009, Бахидзе Е.В., и соавт., 2012, Козаченко В.П., и соавт., 2009, Коломиец Л.А., и соавт., 2012, Максимов Я.В., и соавт., 2012, Новик В.И., 2012, Новикова Е.Г., и соавт., 2010, Прилепская В.Н., и соавт., 2013, Anttila A., 2010, Arbyn M, et al., 2012, Yang, H.P., 2012]. Развитие и прогрессия РШМ этиологически обусловлено двумя неразрывно связанными, взаимно определяющими аспектами – молекулярно-генетическим профилем опухоли и иммунным статусом пациентки [, et al., 2009, Hwang S.J., et al., 2012, Имянитов Е.Н., 2012]. При этом иммунный статус служит основой, формирующей условия для персистенции ВПЧ и индукции развития РШМ [Moody C.A. и соавт., 2010, Кадагидзе З.Г, и соавт., 2013, Орнер И.Ю., и соавт., 2010]. ,
Одним из важных процессов, связанных с подавлением противоопухолевого и противовирусного иммунного ответа под влиянием вирусов, является апоптоз иммунных клеток [ R, 2010]. Главными эффекторами данного процесса являются каспазы, индукция которых может происходить под воздействием опухолевых и вирусных факторов [ , и соавт., 2006, , и соавт., 2007, Mahata, S., 2011]. В настоящее время имеются только экспериментальные данные, оценивающие уровень мРНК и активность каспаз в клетках эпителия шейки матки и в лейкоцитах периферической крови при развитии РШМ [, и соавт., 2011; R, 2010, , и соавт., 2010, , и соавт., 2011, , и соавт., 2010]. Между тем, некоторые транскрипционные факторы, в частности c-Myc, c-Fos и c-Jun, активирующиеся при стимуляции покоящихся клеток ростовыми факторами, и участвующие в регуляции процессов клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ могут быть перспективными маркерами и мишенями для терапевтического воздействия [Eilers M., и соавт., 2008, Shaulian E., и соавт., 2010]. Однако большинство вопросов, касающихся установления связи между активностью этих генов и клинико-патологическими характеристиками РШМ, остаются открытыми [Mahata, S., 2011, Mason J.M., 2009, Gustafson W.C., и соавт., 2010].
Все вышеизложенное позволяет считать чрезвычайно актуальным, исследование сложных вопросов молекулярно-генетических изменений, вызываемых ВПЧ и их корреляций с иммунологическими и клиническими параметрами в процессе развития опухолевого процесса, и на фоне анализа эпидемилогических данных в регионе Республика Карелия оценить возможности применения полученных данных с целью решения проблемы ранней диагностики и новых методов лечения преинвазивного и микроинвазивного РШМ.
Цель исследования. На основе проведения клинико-эпидемиологического, молекулярно-генетического и иммунологического исследований предложить новые технологии, решающие проблему раннего выявления и лечения предрака и ранних форм рака шейки матки и рекомендации по оптимизации системы профилактики РШМ.
Задачи исследования
1. Исследовать динамику заболеваемости и смертности РШМ и рака in situ шейки матки у женщин Республики Карелия с 1998 по 2012 гг.
2. Изучить вирусологические параметры при предраке и РШМ у женщин разных возрастных групп.
3. Оценить состояние состояние клеточного и гуморального иммунитета по результатам количественного анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических, регуляторных Т-клеток, В-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток) и предрасположенность данных клеток к апоптозу при развитии и прогрессии РШМ.
4. Изучить экспрессию генов каспаз -3,-6,-8,-9 на уровне мРНК и протеазной активности в клетках цервикального эпителия и лейкоцитах крови у больных с ЦИН 3 и РШМ.
5. Изучить экспрессию генов раннего пролиферативного ответа (c-myc, c-fos, c-jun) на уровне мРНК и количества белка в клетках цервикального эпителия пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями 3 степени (ЦИН 3) и РШМ I-IV стадий.
6. Разработать программу комплексного обследования пациенток с целью раннего выявления предрака и ранних форм рака шейки матки.
7. Исследовать влияние комплексной терапии на показатели клеточного иммунитета и апоптоза пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ.
8. Разработать рекомендации по оптимизации системы профилактики РШМ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Уровень ранней диагностики РШМ определяется частотой выявления дисплазии и карциномы in situ по отношению к инвазивным формам РШМ, что отражает полную картину диагностики и представление о проводимом цитологическом скрининге в Республике Карелия.
2. Развитие и прогрессия РШМ сопровождается нарушением клеточного и гуморального иммунитета по результатам количественного анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических, регуляторных Т-клеток, В-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток) и предрасположенностью данных клеток к апоптозу.
3. Развитие и прогрессия РШМ сопровождаются усилением активности Fas-регулируемой инициаторной каспазы-8 и эффекторных каспаз -3 и -6 вследствие активации CD95-зависимого пути апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови.
4. Развитие РШМ связано со становлением агрессивного апопто-резистентного фенотипа в опухолевых клетках за счет подавления протеолитической активности инициаторной каспазы-9 и эффекторных каспаз -3 и -6.
5. Развитие РШМ характеризуются специфичным паттерном активности генов c-myc, c-fos, c-jun.
6. Применение комплексного лечения (хирургическое + иммунотерапия) у пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ значительно чаще приводит к элиминации ВПЧ по сравнению с одним только хирургическим лечением, что доказывается достоверным снижением ВПЧ-позитивных пациенток и отсутствием онкобелка Е7.
7. Изменения апоптотической программы в лимфоцитах периферической крови и иммунологических показателей у больных преинвазивным и микроинвазивным РШМ носят системный, но обратимый характер и не наблюдаются через 3 месяца после комплексного лечения.
8. Предложенная двухэтапная модель вторичной профилактики РШМ будет способствовать снижению заболеваемости и смертности от инвазивных форм РШМ.
Научная новизна.
Впервые дана оценка уровня диагностики РШМ с учетом рака in situ, I и II стадии, проведено сопоставление с показателями охвата ЦС в районах РК за 1998 – 2012 гг. Доказано, что ранняя диагностика РШМ связана с охватом ЦС в Карелии. Это позволило выделить 3 группы районов с различным ее уровнем. При этом широта охвата ЦС женщин в районах с уровнем выше 80% составила от 50 до 72,7%; в районах с относительно низким уровнем этого показателя (70% и менее) – соответственно от 29 до 40,2%.
Проведено комплексное динамическое исследование вирусологического, кольпоскопического, молекулярно-генетического параметров на этапах скрининга, диагностики, лечения и последующего мониторинга ЦИН 3 и РШМ, при котором получены новые данные о частоте выявления ВПЧ среди пациенток с патологией шейки матки в РК и о частоте встречаемости среди них различных генотипов ВПЧ.
В результате этого исследования обнаружен комплекс фенотипических изменений в лимфоцитах крови при РШМ, их количественного состава и функционального состояния, которые усиливаются при прогрессии опухоли. При этом впервые обнаружено, что изменение функциональной активности лимфоцитов крови у больных с РШМ обусловлены активацией Treg супрессорных клеток, экспрессирующих маркер CD25, функциональное состояние которых у больных с ЦИН 3 и РШМ впервые оценено по уровню экспрессии гена трансформирующего фактора роста-1 (TGF-1) и уровню экспрессии гена транскрипционного фактора (FOXP3) в лимфоцитах периферической крови (ЛПК).
Выявлено, что роль иммунной системы при развитии РШМ трансформируется. Это проявляется в последовательной смене противоопухолевого иммунного ответа толерантностью, анергией, а затем наступает этап, когда иммунная система способствует развитию РШМ и становится фактором опухолевой прогрессии. Одним из таких механизмов в развитии РШМ является сдвиг в дифференцировке Treg-клеток (Th1, Th3) и активация супрессорных субпопуляций с фенотипом CD4+CD25+ (Tr1) с соответствующими изменением спектра секретируемых цитокинов (усиление синтеза TGF- и др).
В рамках диссертационной работы впервые показано, что изменения апоптотической программы в лимфоцитах периферической крови и иммунологических показателей у больных преинвазивным и микроинвазивным РШМ носят системный, но обратимый характер и не наблюдаются через 3 месяца после комплексного лечения.
Практическая значимость
На основании полученных эпидемиологических данных в РК доказано, что уровень диагностики РШМ с учетом рака in situ, I и II стадии отражает полную ее картину и дает полное представление о проводимом цитологическом скрининге. Выделены группы районов с различным уровнем РД: районы уровнем диагностики выше 80% и уровнем ЦС от 50 до 72,7%; районы с относительно низким уровнем диагностики от 70% и менее, где уровень ЦС от 29 до 40,2%. Показано, что уровень диагностики РШМ объективно отражает скрининг, проводимый в Карелии. При этом отмечено, что за последние годы ее уровень повысился, и продолжаются дальнейшие организационные мероприятия по повышению эффективности ЦС в районах Карелии.
На основании полученных данных обоснована целесообразность применения иммунологических исследований в комплексной диагностике, оценке результатов лечения, а также для мониторинга больных с РШМ. Выявленные прогностические иммунологические факторы дают возможность гинекологам и онкогинекологам оценивать радикальность выполненной операции и прогноза заболевания.
Динамика и мониторинг экспрессии транскрипционных факторов c-Myc, c-Fos и c-Jun у больных с ЦИН 3 и инвазивном РШМ также может рассматриваться в качестве дополнительного диагностического маркера, так прогноза заболевания.
Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, могут являться основой для последующей разработки диагностических тест-систем, направленных на повышение специфичности, объективности и точности критериев диагностики интраэпителиальных неоплазий и ранних стадий рака шейки матки. Гены раннего ответа (c-myc, c-fos, c-jun) и каспазы могут быть использованы в качестве биомаркеров, характеризующих степень смещения баланса между процессами пролиферации и апоптоза вместе с маркерами ангиогенеза, инвазии и другими. Изученные параметры иммунного статуса могут быть использованы для долгосрочного наблюдения пациенток после курса лечения в комплексе со стандартным клиническим обследованием, тестом на ВПЧ и цитологическим исследованием.
Результаты диссертационного исследования позволили на этапе преинвазивного и инвазивного РШМ предложить модель вторичной профилактики РШМ.
Полученные результаты в рамках работы позволяют рекомендовать тест на ВПЧ параллельно с цитологическим скринингом на основе комплексного подхода к диагностике заболеваний шейки матки. При этом поиск ранних диагностических маркеров ВПЧ-индуцированного злокачественного роста, таких как транскрипционные факторы c-Myc, c-Fos и c-Jun позволит повысить раннюю диагностику предрака и ранних форм РШМ и дифференцированно и индивидуально подходить к выбору эффективного лечения.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность ГУЗ «Республиканский онкологический диспансер» МЗ Республики Карелия (Петрозаводск, Лососинское шоссе, 11). Результаты исследования внедрены также в практическую деятельность акушеров-гинекологов женских консультаций г. Петрозаводска и районов Республики Карелия, а также в в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в рамках НИР 5.3. Материалы диссертации используются в учебном процессе преподавания кафедр лучевой диагностики, лучевой терапии, онкологии, фтизиатрии и урологии, госпитальной хирургии, акушерства и гинекологии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета (Петрозаводск, пр. Ленина, 33).
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК № 2012-1.2.1-12-000-1014-027.
Апробация диссертации
Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном научном семинаре кафедры лучевой диагностики, лучевой терапии, онкологии, фтизиатрии и урологии, Лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета Петрозаводского государственного университета (ПетрГУ) и кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ 15 ноября 2013 года. Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (отделение онкогинекологии) 17 декабря 2013 г.
Основные положения и выводы диссертационной работы представлены на VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013); на Международном онкологическом научно-образовательном форуме ОНКОХИРУРГИЯ-2012 (С-Петербург, 2012), ОНКОХИРУРГИЯ-2010 (Москва, 2010); на IX, X, XI, XII, XIII, XIY Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013). В материалах 4, 5 съездов акушеров-гинекологов России (Москва, 2008, 2013). На Всероссийских конгрессах «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» (Москва, 2010, 2012, 2013). На Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные новообразования» (Санкт-Петербург, 2009, 2011). На XIY, XY, XYI, XYII Всероссийских Конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013). На IX, X Международных конференциях «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2008, 2009); на III и IV Всероссийских научно-практических конференциях «Цитоморфометрия в медицине и биологии» (Москва, 2010, 2011); на VI Всемирном конгрессе по иммунопатологии и респираторной аллергии (Москва, 2011); на VII Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Новосибирск, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010); на V Всероссийской Симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); на III Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, 2011); на I Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011); на XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); на I Международной научной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012); на научно-практической конференции с международным участием «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2009); на Международном конгрессе по патологии шейки матки (Москва, 2003), на Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике» (Москва, 2007); на Международной конференции «Профилактика рака шейки матки – взгляд в будущее» (Москва, 2008); «Ранняя диагностика, профилактика и современные методы лечения заболеваний шейки матки» (Москва, 2009); «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2010); Симпозиум в помощь практическому врачу: «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011). Центр лазерной медицины С-Петербурского государственного медицинского университета «Диагностика, профилактика и лечение заболеваний шейки матки, влагалища и наружных половых органов» (Санкт-Петербург, 2011), на II Российском симпозиуме с международным участием «световой режим, старение и рак» (Петрозаводск, 2013). Материалы научно-практической конференции акушеров-гинекологов и онкогинекологов Республики Карелия (2003, 2004, 2005, 2007, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013).
На Международном конгрессе «The 14th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society» (Vancouver, Canada, 2012); на Международном конгрессе «The 28th Congress of the new European Society for Comparative Physiology and Biochemistry ESCPB» (Bilbao, Spain, 2012); на Международном конгрессе по иммунологии «15th International Congress of Immunology» (Milan, Italy, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 89 научных работ, из них 25 в центральных изданиях, 1 монография и 2 пособия для врачей. На основании результатов исследования подана заявка в Роспатент на изобретение «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки» (№ 2012157453 от 26.12.2012 г).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глава – изложение материала и методов обследования и лечения больных, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 326 страницах машинописного текста, иллюстрирована 69 рисунками и 112 таблицами. Библиографический указатель содержит 76 работы отечественных и 307 зарубежных авторов.
Конкурсная поддержка и благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность доц., д.м.н Бахлаеву И.Е., проф., д.б.н. Волковой Т.О., д.б.н. Олейник Е.К. за всестороннюю помощь в подготовке диссертационной работы, заведующей кафедрой молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Немовой Н.Н.
Эпидемиология, диагностика, лечение и мониторинг рака шейки матки
РШМ принадлежит первое место среди злокачественных новообразований женских половых органов и 5-е место среди всех онкологических заболеваний. В структуре смертности РШМ у женщин занимает 2-е место в мире. Частота заболеваемости варьирует от 10 до 80 случаев на 100 тыс. женского населения. Ежегодно в мире выявляется 493,2 тыс. больных РШМ (5% среди всех злокачественных новообразований). Большинство случаев РШМ (85%) приходится на развивающиеся страны, что соответствует 15% всех злокачественных опухолей [156]. В развитых странах РШМ составляет 4,4% от новых случаев рака [90]. По данным Международного агенства по изучению рака (МАИР) «Рак на пяти континентах» (т. IX, 2008) [112], наиболее высокие показатели заболеваемости женщин РШМ зарегистрированы в Зимбабве – 47,3%000, Уганде – 45,8%000 и Перу – 43,9%000., выше 30%000 в Бразилии. Близкие к этим уровням показатели заболеваемости женщин Индии – 28,0%000 и Сербии – 25,7%000. По данным раковых регистров США, разброс стандартизированных показателей заболеваемости женщин РШМ находится в пределах от 5 до 15%000. В Великобритании, Франции, Италии разброс этих показателей от 5 до 9%000. Наиболее низкие показатели отмечены в странах с максимальным уровнем проводимых скрининговых программ, в первую очередь, в Финляндии (4,0%000) и Израиле (5,4%000) [112]. В странах Евросоюза смертность от РШМ снизилась на 15% за последние 10 лет [197, 198, 199, 200, 245, 320]. Эпидемиологические исследования в Финляндии показали, что организованный цитологический скрининг снижает частоту инвазивных форм на 90%, а смертность – на 60%, при этом на 121 больную с преинвазивным раком приходится 100 больных инвазивным РШМ. [111]. В Норвегии, где с 1995 года проводится организованный скрининг РШМ, произошло значительное снижение заболеваемости и смертности [330]. Выживаемость больных РШМ связана со стадией заболевания, способами лечения, периодом времени после окончания лечения и другими факторами. По сводным данным популяционных раковых регистров стран Европы, 1-летняя выживаемость больных РШМ в 90-х годах составила 84%, 3-летняя – 66%, 5-летняя – 62% [93]. Наименьшая 5-летняя выживаемость отмечена в Польше (51%), наибольшая – в Исландии (84,7%). В Европе (программа Eurocare-4) в 1995-1999 гг, показатель 5-летней наблюдаемой и относительной выживаемости составлял соответственно 62,0 и 66,7% и соответственно в 2000-2002 гг.– 64,4% (в Исландии – 70,6%, Италии – 67,0%, Швеции – 66,7%) [93, 306]. В США показатель 5-летней относительной выживаемости составил 65,8% [351]. Хорошие прогнозы отмечены в странах с низким риском развития РШМ (в США – 70%, в европейских странах – 60%). В развивающихся странах, где чаще диагностируются запущенные случаи РШМ, выживаемость достигает 48%; самые низкие показатели – в Восточной Европе [93, 306]. 1.2. Рак шейки матки в России. В Российской Федерации РШМ занимает 5-е место среди онкологических заболеваний (6,4%) и 2-е место как причина смерти от рака женщин до 45 лет [1, 11, 41, 42, 72]. При этом констатируются неудовлетворительные показатели активного выявления (12,9%) онкологических заболеваний и неудовлетворительная работа первичного звена здравоохранения в части «онкологической настороженности». У гинекологов практически отсутствует онкологическая настороженность во время осмотра молодых женщин. В России ежегодно (2009 г) регистрируется более 14 тыс. женщин (14351) случаев РШМ, «грубый» показатель равен 18,82%000, стандартизированный – 13,4%000 [61] Всего под наблюдением онколога наблюдается 159774 женщин, пролеченных по поводу РШМ. [14]. Отмечен прирост заболеваемости РШМ (с 10,6 случаев на 100 тыс. женского населения в 1991 г. до 13,4 в 2009 г.). По данным В.И. Чиссова и соавт. [72], средний возраст заболевших – 52,6 лет, из них более половины – моложе 49 лет. У пациенток со злокачественными новообразованиями в возрасте от 15 до 40 лет РШМ является основной причиной смерти, достигая 15,9%; у женщин 40-54 лет РШМ занимает 5-е место (8,5%). Максимальные возрастные показатели заболеваемости РШМ зарегистрированы в 45-64 года [1, 41, 72]. В России за последние 5 лет заболеваемость выросла на 7,9%, а запущенность (выявление заболевания в III-IV стадии) не снижается и составляет 38,9% всех вновь выявленных случаев (III стадия – 28,8%, IV – 10,1%) [11]. Максимальные стандартизированные показатели заболеваемости женщин РШМ зарегистрированы в Забайкальском крае – 30,74%000, Республике Алтай – 27,03%000 и в Карелии – 27,03%000. Выше 20%000 показатель заболеваемости женщин РШМ в Псковской, Калининградской, Сахалинской и Магаданской областях [60]. В Москве его уровень составляет 9,77%000, в Санкт-Петербурге – 9,55%000. Меньший уровень зарегистрирован в Чувашии – 9,13%000, Пензенской – 8,11%000 и Тамбовской (9,37%000) областях [41]. Более 6 тыс. больных (4,7% среди всех женщин со злокачественными новообразованиями) ежегодно умирают от РШМ в России [1, 11, 72]. «Грубый» показатель смертности в 2009 г. составил 8,11%000, стандартизированный – 5,13%000. Средний возраст умерших составляет 58 лет (в 1991 году – 64 года). Смертность от РШМ в 2009 г. в среднем по России составила 5,3 на 100 тыс. женского населения, что в 2 раза ниже, чем заболеваемость – 13,4 на 100 тыс [41, 42].
Результаты исследования. Рак шейки матки у женщин Республики Карелия
В структуре заболеваемости злокачественными заболеваниями у женщин в РК РШМ занимает 3-е место, уступая лишь раку молочной железы и раку кожи (кроме меланомы). С целью анализа эпидемиологической ситуации в районах РК, связанной с РШМ, были использованы данные Карельского республиканского ракового регистра за 1998–2012 гг., материал централизованной цитологической (ЦЦЛ) и гистологической лабораторий, а также данные Республиканского медицинского информационного аналитического центра (РМИАЦ). За указанный период проведен ретроспективный анализ материала от 552 пациенток с преинвазивным раком (рак in situ) и 1248 инвазивным РШМ за 15-летний период (1998 – 2012 гг.) в возрасте от 19 до 86 лет (n= 1800). С целью оценки динамики частоты РШМ в Карелии выделены 3 периода: I период – 1998-2002 гг. (5 лет); II – 2003-2007 гг. (5 лет); III – 2008-2012 гг. (5 лет)
В РК отмечается значительный рост заболеваемости РШМ. При анализе (рис. 3.1) видно, что до 2003 года показатель заболеваемости РШМ колебался от 10,5 до 13,3 на 100 тыс. женского населения. С 2004 г. этот показатель вырос почти в три раза с 14,9 до 40,3 случаев, в 2012 г – 30,5 случаев на 100 тыс. женского населения, превышая среднероссийский уровень – 16,98 [61, 72].
Динамика заболеваемости и смертности от РШМ в Карелии на 100 тыс. женского населения (n= 1248). Показатель смертности от РШМ в РК находится на уровне среднероссийского, варьируя от 4,1 до 10,1 случаев на 100 тыс. женского населения. Диагностика РШМ в I и II стадии процесса (ранняя диагностика) за 1998-2012 гг. составила 72,5% (905 из 1248 больных) (табл. 3.1, рис. 3.2). Таблица 3.1
Традиционно, в России, при определении уровня ранней диагностики РШМ учитываются только I и II стадии процесса [1, 11, 41, 42, 72], рак in situ шейки матки, формально, к ранней диагностике не относится. В то же время анализ данных больных с преинвазивным раком позволяет оценить уровень ранней диагностики РШМ в условиях женских консультаций (ЖК) и смотровых кабинетах. В среднем по России на 100 больных с инвазивной формой РШМ приходится 17 преинвазивных форм опухолей, в том числе по Санкт-Петербургу – 35 на 100 инвазивных форм [41, 42]. Так, в 2007 г. в России было выявлено 3356 (в 2000 г. – 2348) больных с преинвазивным раком [1]. Основная масса таких пациенток (n= 2220) имела локализацию на шейке матки – 17 на 100 больных с инвазивным раком этой локализации; значительно выше показатель в Финляндии – 121 на 100 больных [112].
Следует отметить, что при установленном диагнозе рак in situ пациентка подлежит специальному лечению и находится впоследствии на диспансерном учете. При этом необходимо учитывать, что чем больше выявляется рака in situ, тем ниже, может оказаться уровень ранней диагностики. Так, в РК процентное соотношение больных преинвазивным РШМ к числу инвазивных раков в 2008г. составило 97,8 % (среднероссийский показатель – 19,4 %), При этом ее уровень 2008г. оказался ниже, чем в 2009 г. (58,7%) (Рис. 3.3). Далее в 2010г. – 48,6%, в 2011г. – 37,3%, в 2012г. – 71,8%, при этом следует отметить достоверное увеличение частоты выявления преинвазивных форм РШМ в 3 периоде (P 0,05) (среднее значение 62,8±20,9%) по сравнению с 1 (24,34±9,2%) и 2 периодом (33,16±9,1%) в РК.
Всего 552 (30,7) 905 (50,3) 343 (19,0) 18 Выживаемость больных при РШМ зависит от стадии болезни, способов лечения и других факторов, в том числе от уровня ранней диагностики (рак in situ, I–II стадии). За период 1998–2000 гг. наблюдалось увеличение этого показателя с 59,6% до 91,3%, в 2001–2009 гг. с 53,1% до 86,2%, 2010–2012 гг. 83,6-86,2% -86,8 (Рис. 3.3-3.4). Рис. 3.4. Диагностика рака шейки матки в Карелии по периодам
В процессе анализа отмечено, что диагностика преинвазивного рака шейки матки увеличилась с 11,6±5,0 случаев в 1 периоде до 26,8±11,2 во 2 периоде и соответственно до 68±11,0 случаев в 3 периоде. Выявлено повышение диагностики РШМ I-II стадии с 30,8±9,36 случаев в 1 периоде до 96,6±21,2 случаев в 3 периоде (p 0,05). При этом частота РШМ III-IY стадии (абсолютные числа) также имеет тенденцию к увеличению с 15,8±5,8 до 28,2±4,3 случаев (p 0,05) в 3 периоде (Табл. 3.4, табл. 3.5). Таблица 3.4
При анализе стадийности РШМ отмечено, что доля РШМ 0-I-II стадий в III периоде (2008–2012гг.) по сравнению с I периодом (1998–2002 гг.) повысилась до 85,7% (соответственно 72,8%–76,5%–85,7% по периодам). Доля рака in situ увеличилась на 16,7% в 3 периоде по сравнению с 1 периодом, тогда как РШМ III и IV стадии стал диагностироваться на 12,8% реже (табл. 3.5 и 3.6).
Фактическую запущенность опухолевого процесса, а также качество лечения более достоверно характеризует показатель одногодичной летальности. Среднероссийский показатель одногодичной летальности при РШМ в 1998-2012 гг. варьировал от 19,0 до 20,9%, в РК – 12,5–24,1%. В исследуемый период, этот показатель в РК имел волнообразный характер, в среднем составляя 19,6%, в 2010-2011-2012 годах соответственно 5,7% – 9,4% – 10,2, что является объективным критерием запущенности онкологического заболевания. Следует отметить, что, как правило, речь идет о больных III и IV стадиями РШМ, поздно обратившихся в ЖК и смотровые кабинеты при поликлиниках (Рис. 3.5). Показатель одногодичной летальности (%) в России и СЗФО составляет соответственно 17,4 – 15,8% [41, 42]. Показателем качества диагностики РШМ и онкологической настороженности акушеров-гинекологов и врачей общей лечебной сети служит показатель активной выявляемости РШМ (Рис. 3.6). Рис. 3.6. Рак шейки матки, выявленный на профилактических осмотрах в Республике Карелия Данный показатель характеризует степень охвата населения профилактическими осмотрами и цитологическим скринингом (ЦС). Так, с 1998 г. по 2006 г. в РК показатель выявляемости РШМ при профилактических осмотрах составлял от 3,6% (1998г) до 15% (2006г), а с 2007 г отмечено увеличение активной выявляемости до 60,5% и составляет в 2012 году 55,3% (рис. 3.6). Некоторые выводы по эпидемиологии РШМ в РК: 1. В РК заболеваемость РШМ за последние 15 лет (1998–2012 гг.) выросла в 3 раза – с 10,5 до 30,5 случаев на 100 тыс. женского населения. 2. За этот период зарегистрировано повышение уровня диагностики в I–II стадии РШМ с 66,1% до 77,4%, показатель запущенности (III–IV стадия) уменьшился с 33,9% до 22,6%. 3. Достоверно увеличилась частота преинвазивных форм РШМ с 24,34±9,2% в 1 периоде и 33,16±9,1% случаев во 2 периоде до 62,8±20,9% в 3 периоде (P 0,05). 4. За период исследования уровень диагностики преинвазивного и инвазивного (I–II стадии) РШМ вырос с 72,8% (1998) до 85,7% в 2012 году. 5. В РК необходимо создание программы организованного цитологического скрининга РШМ, где должен быть обеспечен компьютерный учет пациенток, подлежащих цитологическому скринингу, четко отлажена преемственность между врачами–цитологами, гинекологами и онкологами. 6. Решающими факторами, влияющими на эффективность цитологического скрининга РШМ, является широта охвата скринингом женского населения и качество забора материала для цитологического исследования.
Вирусологические, иммунологические, молекулярно-генетические методы диагностики РШМ
Роль вируса папилломы человека в возникновении РШМ общепризнана, что отражено в пресс-релизе Всемирной организации здравоохранения 2006 г. [363]. По данным EUROGIN более 99,7% случаев РШМ вызывается высокоонкогенными типами ВПЧ, преимущественно 16 и 18 типов, достигая максимума к 30-летнему возрасту [145, 220, 287].
С целью скрининга ВПЧ комплексно обследовано 1742 женщин с патологией шейки матки. В гл. 2.1 (ВПЧ-типирование) описаны методы, с помощью которых проводился скрининг на наличие ВПЧ-ДНК и идентификация генотипа ВПЧ, выявление мРНК вирусных онкогенов Е7.
При скрининге общей инфицированности ВПЧ среди женщин с различной патологией шейки матки отмечено, что из 1742 обследованных ДНК вируса папилломы выявлен у 654 (37,5%) в возрасте от 20 до 61 года (средний возраст составил 31,8±3,7). Среди обследованных пациенток 68,9% (451) составили молодые женщины в возрасте 20-30 лет, при этом 37,5% (245) - пациентки в возрастном диапазоне от 20 до 25 лет, и 31,5% (206) - пациентки от 26 до 30 лет включительно. Пациентки в возрасте от 31 до 40 лет в группе составили 19,1% (125), от 41 до 49 лет – 7,5% (49), старше 50 лет составили 4,4% (29). Распределение ВПЧ у пациентов с заболеваниями шейки матки представлено в таблице 4.1. Среди них у 248 (37,9%) женщин при расширенной кольпоскопии отмечены аномальные кольпоскопические картины, в виде шиповидных выростов эпителия, мозаики, пунктуации, йод негативных зон, атипических сосудов. В этих зонах выполнена прицельная биопсия, выявлено 67 (10,2%) случаев цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН): 14 – ЦИН I степени, 10 – ЦИН 2, 43 – ЦИН 3 степени (11 – дисплазий 3 степени и 32 случая – рака in situ). Фоновые заболевания шейки матки у женщин с ВПЧ составили 89,8%случаев. В эту группу включены пациентки с осложненными эктопиями, кистами, полипами цервикального канала и шейки матки, деформацией шейки матки. Трансформация в дисплазию 3 степени и рак in situ в группе обследования произошла в 43 наблюдениях (6,6%). Проведенный в Карелии клинико-эпидемиологический анализ 1800 женщин с РШМ за 1998-2012 гг. (Гл. 3) показал, что пик заболевания отмечен в возрасте 31-40 лет и 41-50 лет. В тоже время, пик уровня инфицированности ВПЧ у женщин РК наблюдается в 18-25 и 26-30 лет, а затем падает до 2% (Рис. 4.1), что согласуется с данными F.X. Bosch et al. [96]. В группе с фоновыми заболеваниями количество ВПЧ положительных лиц составляет 33,7% (587) на 1742 обследованных пациентов. При этом больные с ЦИН (67) шейки матки в группе обследованных женщин (n=1742) составляют всего 3,8% (по данным скрининга). При изучении распределения генотипов вирусов папилломы среди ВПЧ-позитивных женщин выявлено, что в большинстве случаев (44,9%) у женщин РК преобладает ВПЧ 16-го типа, что согласуется с данными литературы [30, 73, 145, 220, 287, 382, 383]. Далее следуют ВПЧ 33, 18 и 31 типов соответственно в 15,6%, 13,3% и 11,8% случаях у женщин с патологией шейки матки (Табл. 4.1). 4.1.2. Определение вирусной нагрузки при преинвазивном и микроинвазивном РШМ.
Проведено определение ВПЧ, вирусной нагрузки, онкобелка Е7 в группах здоровых пациентов (n= 30) (средний возраст составил 33,3±1,7 лет), фоновых заболеваний шейки матки (n= 86) (средний возраст – 32,5±2,5 лет), преинвазивного (n= 75) (средний возраст 32,9±7,4) и микроинвазивного (n= 45) (средний возраст – 31,3±6,0 лет) рака шейки матки. Доказанным фактом является этиологическая роль папилломавирусной инфекции с возникновением рака шейки матки. Данные, представленные в таблице 4.2, демонстрируют неуклонное увеличение количества инфицированных пациентов. При этом следует отметить, что ВПЧ-позитивные образцы получены и в контрольной группе.
В группе здоровых женщин (n= 30) ДНК ВПЧ был отмечен у 26,7% (8) пациентов. ДНК ВПЧ при фоновых заболеваниях у пациентов выявлена в 33,7%, в основной группе – 92,5%, в контрольной группе №2 – 100% (Табл. 4.2) (P 0,05), что соответствует данным литературы [140, 141]. Таким образом, ДНК ВПЧ не обнаружена при верифицированном диагнозе в основной группе у 7,5% больных. Почему? По-видимому, латентная вирусная инфекция, которая «скрыта» от иммунного надзора, умножает число возможных сценариев индукции канцерогенеза не только прямым внедрением генома ВПЧ в клеточный геном, но и через продукты транскрипции и трансляции вирусного генома, вызывая стойкие эпигенетические изменения в клетках хозяина. Таким образом, ВПЧ может быть элиминирован из клеток, и единственным следом их инфицирования является перепрограммированная на онкогенез клетка [164, 302, 380]. Большое внимание исследователи уделяют возможности определения концентраций ВПЧ с целью показать взаимосвязь между увеличением вирусной нагрузкой и риском развития РШМ [30, 33, 129, 267, 295, 310]. Обнаружено, что персистенция вируса с высокой нагрузкой способствует быстрой прогрессии цитологически нормальных клеток шейки матки в диспластически измененные и даже опухолевые [92, 136, 170]. В табл. 4.4 представлены результаты исследования вирусной нагрузки среди ВПЧ-позитивных лиц. Повышенные вирусные нагрузки ( 5 lg) наблюдаются у 50,5% и 43,3%, значимые ( 3 lg) – у 39,6% и 46,7%, малозначимые ( 3 lg) – у 9,9% и 10,0% пациентов основной и контрольной №2 группах с преинвазивным и микроинвазивным РШМ соответственно. Напротив, в контрольной группе №1 выявлены малозначимые вирусные нагрузки у 26,7% женщин.
Показано, что частота выявления пациенток с повышенной и значимой вирусной нагрузкой наблюдается у 89,7% и 90,7% больных основной группы и 90,0% контрольной группы №2, статистически значимо превышая аналогичный показатель для больных с малозначимой вирусной нагрузкой (р 0,05). Таким образом, данные полученные в ходе диссертационной работы свидетельствуют о необходимости разработки дополнительных методов исследования, позволяющих точнее сформировать прогноз, лечебные и профилактические мероприятия при РШМ. В Гл.1 показана актуальность изучения онкобелка Е7 у больных с преинвазивным и микроинвазивным РШМ, обусловленная его трансформирующим эффектом на клетки эпителия шейки матки. При этом вирусный геном персистирует в интегрированной форме и разрыв в вирусном геноме, который необходим для встраивания происходит именно в области генов Е1-2. Таким образом, в трансформированных клетках гены Е6 и Е7 остаются интактными. Следует отметить, что интеграция ДНК ВПЧ в геном клеток сопровождается нарушением структуры гена Е2, который является репрессором Е7 (188, 196, 256]. При интеграции ДНК-вируса синтез белка Е2 прекращается вследствие нарушения соответствующего гена и активируется синтез белка Е7 [121, 357]. Таким образом, происхождение онкобелка Е7 связано с жизненным циклом интегрированной формы ВПЧ и может являться маркером преинвазивного и микроинвазивного РШМ [191]. При этом измерение уровня онкобелка Е7 позволяет уточнить характер вирусной инфекции, а также возможность злокачественной трансформации при интегрированной форме ВПЧ [173, 256].
Модель вторичной профилактики преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки .
Отмечено, что локальная деструкция клинических и субклинических очагов ВПЧ у пациенток 1 и 2 групп позволяет излечить только участок ткани, где произошла манифестация инфекции, при этом в окружающих тканях вирус сохраняется. Так в 1 и 2 группах, где не проводилось иммуномодулирующая терапия, через 3 месяца ВПЧ выявлена в 36,3% (20) и 30% (9) случаях соответственно (Табл. 8.2), в 3 группе 4,4% (1) (P 0,05). В 3 группе у пациенток с ВПЧ 2 этапом дополнительно проведено лечение препаратом аллокин-альфа (1мг 6 раз через день, подкожно).
В 1 группе (n=100) эффективность криолечения шейки матки на аппарате «МКК-5» составила 67 (67%) – основная слизистая, 18 (18%) – йод негативные зоны с зоной трансформации и 15 (15%) – незаконченная зона эпителизации шейки матки. Всем проведено дополнительное лазерное лечение. При этом ВПЧ через 3 месяца диагностирован в 36,3% (20) случаев.
Во 2 группе (n=100) – эффективность диатермоэксцизии шейки матки составила 87%, при этом основная слизистая отмечена у 87 (87%) пациенток, гиперкератоз – у 3 (3%), йод негативные зоны с зоной трансформации – у 5 (5%), эндометриоз шейки матки – у 4 (4%), неполная эпителизация – у 1 (1%). В 13 случаях было проведено дополнительное лечение. При этом ВПЧ через 3 месяца была диагностированэ в 30,0% (9) случаев.
В 3 группе (n=177) эффективность лазерного лечения у пациенток с ВПЧ (n=92) составила 95,6%. В 4 (4,4%) наблюдениях через 3 месяца была выявлена ВПЧ в клинически малозначимых концентрациях вируса (менее 3lg на 105 клеток), через 6 месяцев – в 2 наблюдениях. Также отмечена неполная эпителизация (2) и йод-негативная зона (2), что потребовало дополнительного лечения. Эффективность только лазерного лечения у женщин с патологией шейки матки без ВПЧ (n=85) составила 85,7%. Осложнения в виде неполной эпителизации отмечены у 13 (14,3%) пациенток. Результаты комплексного лечения заболеваний шейки матки с применением лазерной деструкции показали целесообразность проведения противовирусного лечения 2 этапом, что позволяет предупредить рецидивы папилломавирусных заболеваний шейки матки и повысить эффективность лечения. 5.2.2. Место противовирусной терапии в комплексном лечении предопухолевых заболеваний шейки матки с ВПЧ. В результате многочисленных эпидемиологических, клинических и молекулярно-биологических исследований установлено, что важнейшим фактором канцерогенеза шейки матки является инфицирование женщин ВПЧ [114, 115, 145, 188, 220, 266, 383]. Роль определенных типов ВПЧ в возникновении РШМ общепризнана, а РШМ в последнее время стали относить к заболеваниям, передаваемым половым путем [71, 266]. Несомненным успехом современной медицины является вручение Нобелевской премии 2008 г. по медицине и физиологии Харальду цур Хаузену за доказательство этиологической роли ВПЧ в онкогенезе РШМ [383]. По заключению большинства ученых, вирусная концепция РШМ должна принципиально изменить подходы к лечению диспластических процессов шейки матки, а выявление вирусной ДНК, его количественное определение даст возможность точного прогноза при лечении диспластических процессов шейки матки. Результаты этих работ показывают, что при ЦИН 2, 3 степени вирус уже содержится в геноме клетки, и одни противовирусные препараты бессильны остановить процесс опухолевой трансформации [113, 114, 145, 220, 255]. В настоящее время препаратов, избирательно воздействующих на вирус папилломы человека, не существует [211]. Наиболее часто для лечения ВПЧ–инфекции применяют интерфероны и различные иммуномодуляторы. Однако, даже длительная интерферонотерапия, не приводит к излечению ВПЧ [261]. В последнее время значительно интерес к применению препаратов животного и растительного происхождения. К таким препаратам относится препараты животного происхождения алллокин–альфа и растительного происхождения – панавир. Аллокин–альфа новое противовирусное средство – олигопептид, по фармакологическому действию близок к интерферону–альфа и является активатором системы естественных клеток–киллеров [119]. В 1999 году группой ученых (Черныш С.И., Ким Су Ин, Беккер Г.П., Махалдиани Н., Хоффманн Ж., Бюле Ф., Патент РФ № 2172322) были выделены противовирусные цитокиноподобные пептиды из гемолимфы насекомых с общим названием Аллофероны. В системах in vitro данное соединение способно повышать цитотоксическую активность мышиных спленоцитов и МНПК здоровых доноров или онкологических больных в отношении клеток опухолевых линий; также установлена способность аллоферона стимулировать продукцию эндогенного интерферона-гамма [119]. Затем на основе пептида Аллоферон-1 был разработан лекарственный препарат «Аллокин-альфа» лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения (Р №002829/01). Аллоферон индуцирует синтез эндогенных интерферонов и является селективным специфическим стимулятором функциональной активности натуральных киллеров (НК), что связано с непосредственным усилением цитотоксической активности этих клеток, а не с увеличением их количества [119]. НК узнают определенные структуры высокомолекулярных гликопротеинов, которые экспрессируются на мембране инфицированных вирусом клеток. При этом НК не являются антигенспецифическими клетками, вызывают независимый от антител и комплемента лизис клеток-мишеней, распознают свои клетки-мишени без участия антигенов гистосовместимости и относятся к факторам естественной резистентности. Клетка реагирует на стимулы, к которым есть рецепторы на мембране. У них есть рецепторы для цитокинов (IL -2, 4, 10, 12, IFN-gamma), для антигенов МНС-1, CD16 (Fc-gammaRIIIA), что ведет к литическому эффекту клетки с помощью инициации процессов апоптоза [182]. Противовирусную и противоопухолевую активность препарата связывают именно с потенциированием естественных цитотоксических реакций, однако, прямые доказательства такого механизма действия на данный момент отсутствуют. В отличие от известных индукторов интерферона (ИФН) препарат выступает в качестве кофактора, позволяя продуцирующим ИФН- лейкоцитам эффективно реагировать на вирусный антиген. Анализ изменений иммунного ответа после лечения аллокином-альфа больных гепатитом С выявил нормализацию титров циркулирующего в сыворотке крови (90%) и спонтанно вырабатываемого ИФН (80%), увеличение продукции ИФН- и ИФН-, появление мРНК фактора некроза опухоли-, интерлейкина (ИЛ)-12, ИЛ-4 и снижение встречаемости ИЛ-6 и ИЛ-10, увеличение или восстановление функциональной активности Т-лимфоцитов с нормализацией ответа по Th1-типу [13].
