Содержание к диссертации
Введение
Глава I. «Применение антиоксидантных средств в онкологии» Обзор литературы 23
1.1. Активированные кислородные метаболиты 23
1.1.1. Физиологические функции АКМ 28
1.1.2. Патофизиологические функции АКМ 31
1.2. Антиоксидантное звено системы детоксикации 37
1.3. Природные антиоксиданты различных классов 41
1.3.1. Белковые антиоксиданти 42
1.3. 2. Витамины-антиоксиданты 62
1.3.3. Фенольные антиоксиданты 77
Глава П. Материалы и методы исследований 86
Глава III. « Состояние антиоксидантной и иммунной систем организма с токсикозом, индуцированным злокачественным процессом и противоопухолевым лечением » 114
III. 1. Оценка активности окислительно-антиокислительных процессов у животных с токсикозами различной природы 114
Ш.2. Состояние гомеостаза у больных с опухолями органов желудочно-кишечного тракта 122
Ш.З. Состояние гомеостаза у больных с опухолевымизаболеваниями молочной железы 131
Ш.4. Состояние гомеостаза у больных с предопухолевыми и опухолевыми заболеваниями шейки матки 138
Глава IV . Препарат «Лапрот» на основе белкового антиоксиданта - разработка и экспериментальное изучение 151
IV. 1. Получение высокоочищенных субстанций ЛФ женского молока и нейтрофилов 151
IV.2. Оценка антиоксидантной активности ЛФ in vitro и in vivo 156
IV.3. Оценка специфической активности препарата «Лапрот» 158
1V.3.1. Изучение антиоксидантной активности препарата «Лапрот»... 159
IV.3.2. Изучение детоксицирующего действия препарата «Лапрот»... 162
IV.3.3. Изучение антиканцерогенного действия препарата «Лапрот».177
IV.3.4. Изучение антибактериального действия препарата «Лапрот».183
IV.3.5. Изучение влияния препарата «Лапрот» на рост злокачественных опухолей 184
IV. 4. Изучение фармакокинетики препарата «Лапрот» 189
Глава V . Антиоксидантные витаминные комплексы -доклиническое изучение 200
V.I. Антиоксидантная активность индивидуальных витаминов и поливитаминных комплексов 201
V.2. Влияние антиоксидантных витаминов на рост перевивных опухолей у животных 206
V.3. Детоксицирующее действие р-каротина и поливитаминных комплексов на его основе 213
Глава VI . БАД «Антиоксифит» на основе лекарственных растений - разработка и экспериментальное изучение 224
VI.1. Скрининг экстрактов растительного происхождения для разработки биологически активной добавки 226
VI.2. Разработка БАД на основе растительного экстракта 233
VI.3. Предклиническое изучение БАД «Антиоксифит» 235
VI.3.1. Изучение безвредности (общетоксического действия) БАД «Антиоксифит» 235
VI.3.2. Изучение влияния БАД «Антиоксифит» на организм животных-опухоленосителей и рост перевиваемых опухолей у животных 237
VI.3.3.№y4eHne специфической активности БАД «Антиоксифит»...242
VI.3.4. Оценка влияния БАД «Антиоксифит» на лечебный эффект цитостатиков 261
VI.3.5. Оценка антиканцерогенного действия БАД «Антиоксифит»...264
Глава VII. Оценка эффективности применения антиоксидантних средств различных классов в схемах поддерживающей терапии онкологических больных 270
VII. 1. Применение препарата «Лапрот» у больных послеоперационными гнойно воспалительными осложнениями 270
VII.2. Применение препарата «Лапрот» у больных, находящихся на химио-лучевом лечении 278
VII.3. Применение поливитаминного комплекса ПВК у больных раком шейки матки, находящихся на химио-лучевом лечении 283
VII.4. Применение БАД «Антиоксифит» у больных раком шейки матки, находящихся на химио-лучевом лечении 287
VII.5. Применение БАД «Антиоксифит» у больных с генерализованным опухолевым процессом 296
VII. 6. Применение БАД «Антиоксифит» у больных, находящихся на химиотерапевтическом лечении 302
Глава VIII. Препарат Имунофан на основе синтетического модифицированного тимического гормона - оценка эффективности применения в схеме поддерживающей терапии онкологических больных 314
Практические рекомендации 334
Выводы 336
Список использованной литературы 340
- Активированные кислородные метаболиты
- Оценка активности окислительно-антиокислительных процессов у животных с токсикозами различной природы
- Получение высокоочищенных субстанций ЛФ женского молока и нейтрофилов
- Антиоксидантная активность индивидуальных витаминов и поливитаминных комплексов
Введение к работе
1. Актуальность темы
Человек существует в аэробной среде, и кислород и его активные метаболиты (АКМ) играют существенную роль в поддержании гомеостаза организма в нормальном состоянии [Bergendi L., et al, 1999, Seifried HE, et al, 2003]. АКМ обладают широким спектром физиологического действия: проявляют антибактериальные свойства, участвуют в регуляции состояния клеточных мембран, тонуса сосудов, клеточной пролиферации, индуцируют транскрипцию определенных генов и являются пусковым фактором апоптоза [Salganik RL, 2001, Droge W, 2002, Clement MV, 1999, Owuor ED, 2002, Kong AN., 2001].
Техногенно индуцированные в окружающей среде АКМ, различные виды лечения (медикаментозное, лучевое), ряд пищевых продуктов приводят к значительному увеличению образования в организме свободных радикалов (кислородных и органических) и других высокоактивных окислителей, что в свою очередь обусловливает интенсификацию окислительных реакций в организме [McCord JM, 2000, Marnett LJ, 2003, Ohshima H., 2003].
Контроль свободнорадикальных процессов в организме осуществляет антиоксидантное звено системы детоксикации [Fang Y-Z, et al, 2002, Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. Оно представляет собой разветвленную многокомпонентную сеть физиологически активных соединений -ферментных, белковых и витаминных. В него входят соединения гидрофобной и гидрофильной природы, что позволяет осуществлять антиоксидантную защиту как в водной среде организма (цитозоле клеток и в биологических жидкостях), так и в липидных структурах (мембранах клеток).
В нормальных условиях существования антиоксидантная система - III звено системы детоксикации - обеспечивает сбалансированное протекание окислительных и антиокислительных процессов в организме, инактивируя избыточное количество всего многообразия высокоактивных окислителей и устраняя повреждения, вызванные свободными радикалами.
Усиление свободнорадикальных реакций ведет к ответной реакции системы антиоксидантной защиты, что в свою очередь вызывает напряжение, а в ряде случаев истощение механизмов антиоксидантной защиты -возникает дисбаланс окислительных-антиокислительных процессов и избыточные окислители начинают оказывать повреждающее действие на ткани организма.
Патогенетическая функция активных метаболитов кислорода и органических свободных радикалов идентифицирована более чем для 100 заболеваний человека и в различной степени присуща любым патологическим состояниям [Н.К.Зенков и др., 2001]. Повреждающее действие высокореакционных окислителей обусловлено такими эффектами, как блокирование SH-групп ферментов и их инактивацией, гидроксилированием оснований ДНК и ее фрагментацией, активацией перекисного окисления липидов и, как следствие, дестабилизацией клеточной мембраны [Oberley TD, 2002, Marnett LJ, et al, 2003]. Эти процессы вызывают торможение репликации ДНК и, соответственно, угнетение пролиферативной активности быстро делящихся клеток, в первую очередь, кроветворной ткани, иммунокомпетентных клеток и эпителия кишечника.
Одним из самых серьезных последствий длительного воздействия на организм повышенного количества свободнорадикальных соединений и других высокоактивных окислителей является неопластическая трансформация клеток, приводящая к развитию злокачественной опухоли [XuC,etal,2005].
Развитие опухолевого процесса ведет к появлению выраженных нарушений в системах гомеостаза больного. Все методы противоопухолевой терапии: хирургический, химиотерапевтический, лучевой, в свою очередь, способствуют углублению этих нарушений путем индукции повышенного радикалообразования [Mantovani G, 2002].
В результате организм оказывается неспособным справиться с избыточной активацией окислительных процессов. Это приводит к
повреждению мембран большого количества клеток, в том числе нормальных, что вызывает в них структурные и метаболические нарушения и обусловливает развитие выраженных местных и системных токсических реакций. В частности, повреждение иммунокомпетентных клеток приводит к развитию вторичного иммунодефицита, который, в свою очередь, ухудшает переносимость лечения и качество жизни больных.
Таким образом, для уменьшения повреждающего действия окислителей
на клетки в условиях недостаточной активности эндогенной
антиоксидантной защиты необходимо вводить либо экзогенные антиоксидантные средства (прямые антиоксиданты), осуществляя заместительную терапию, либо лекарственные средства, способные активировать эндогенные антиоксидантные механизмы (косвенные антиоксиданты). При этом для эффективной коррекции необходимо добиваться соответствия активности используемого антиоксидантного средства глубине нарушений окислительно-антиокислительного баланса в организме.
В настоящее время во всем мире проводится широкий поиск и разработка лекарственных средств с антиоксидантными свойствами, эффективных как для профилактики различных, в том числе онкологических, заболеваний, так и для их вспомогательной терапии [Kontogiorgis АС, 2005].
Однако пока набор официнальных антиоксидантных лекарственных средств в современной медицине остается довольно ограниченным. Он представлен в основном однотипными препаратами на основе синтетических витаминов, которые обладают низкой антиоксидантной активностью и недостаточно эффективно выполняют защитную функцию. Биологически активные добавки к пище, широко представленные в торговой сети, как правило, недостаточно корректно исследованы предклинически и их свойства не соответствуют аннотированным в сопроводительной документации и рекламных проспектах.
Таким образом, актуальным остается целенаправленный поиск более эффективных детоксицирующих средств, которые обладают совокупностью следующих свойств: эффективно корригируют нарушения в различных звеньях антиокислительной системы; купируют токсические реакции, вызванные лечением онкологического заболевания или осложнения (химио-, лучевой, антибактериальной терапии, хирургического вмешательства, физических методов лечения); безвредны и хорошо переносятся при длительном приеме; удобны для длительного использования в амбулаторных условиях; не снижают терапевтический эффект лечения основного заболевания. Важным является тщательное изучение их физиологического действия в экспериментальных исследованиях, доказательство отсутствия влияния на рост опухолей, отработка показаний к их применению, подбор оптимальных доз, так как известно, что при определенных условиях и в высоких дозах ряд антиоксидантов способен проявлять прооксидантные свойства.
В экспериментальных исследованиях показано, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают белковые антиоксиданты: церулоплазмин, супероксиддисмутаза, лактоферрин [Немцова Е.Р., 2003]. Однако препараты на их основе слабо представлены в фармакопее. В современной клинической практике в России используют лишь препарат на основе церулоплазмина, а за рубежом клинические испытания проходят препараты на основе рекомбинантного лактоферрина человека для перорального применения [Varadhachary А, 2004, Hayes TG, 2005]. Лактоферрин человека представляется одним из наиболее перспективных соединений для разработки лекарственного препарата на его основе, так как помимо высокой антиоксидантной активности, обусловливающей его детоксицирующее действие, он обладает антибактериальным и иммуномодулирующим эффектами, которые реализуются путем прямых механизмов воздействия на патогены и иммунокомпетентные клетки, а не опосредованы антиоксидантными свойствами [Valenti Р, 2004, Ward РР,
2005]. Однако, несмотря на огромные усилия исследователей различного профиля, в настоящее время в мировой фармакопее отсутствуют официнальные препараты на основе лактоферрина человека. Поэтому разработка такого лекарственного препарата, прежде всего для парентерального применения, представляется актуальной и своевременной.
Большой интерес представляют комплексные антиоксидантные средства на основе экстрактов лекарственных растений, содержащих широкую гамму биологически активных соединений, в том числе активные природные антиоксиданты - полифенольные соединения. Подтверждением серьезного изучения в мире возможности применения биологически активных добавок к пище (БАД) явилось создание в США в 1998 году Национального центра комплементарной и альтернативной медицины (NCCAM), включающего четыре ботанических центра и отделение пищевых добавок [Richardson MA, 2001]. Этот центр входит в состав Национальных институтов здоровья США (NIH) - крупнейшей организации, поддерживающей медицинские исследования во всем мире.
В настоящее время во многих ведущих онкологических центрах мира клиницисты признают необходимость проведения поддерживающей терапии больных со злокачественными опухолями и возможность использования в схемах лечения БАД на основе лекарственных растений [Deng G, 2005]. Однако существенным недостатком доклинического изучения подавляющего большинства БАД является отсутствие специальных исследований, направленных на оценку их влияния на рост злокачественных опухолей, что ограничивает применение БАД в онкологической практике. Поэтому актуальной остается также разработка и тщательное доклиническое изучение БАД с высокой антиоксидантной активностью на основе лекарственных растений, предназначенных для применения у больных со злокачественными новообразованиями.
В качестве непрямых антиоксидантов в онкологической клинике могут найти свое применение иммунотропные препараты, обладающие
комплексным действием на организм больного - стимулирующим иммунную и антиоксидантную системы.
Для обоснованного назначения того или иного средства поддерживающей терапии и определения его эффективности актуальной является динамическая оценка показателей антиоксидантнои и иммунной систем онкологических больных в процессе противоопухолевой и поддерживающей терапии.
2.Цель исследования
Оценка состояния антиоксидантнои и иммунной систем гомеостаза больных со злокачественными новообразованиями; разработка, экспериментальное изучение и апробация в клинике средств для коррекции нарушений в системах гомеостаза при эндо- и экзотоксикозах различного генеза.
3. Задачи исследования
Разработать алгоритм оценки системы детоксикации организма на основе изучения продуктов окисления и эндогенных антиоксидантов.
Изучить в экспериментальных моделях влияние роста злокачественной опухоли и химиотерапевтического лечения на развитие токсикоза.
Изучить состояние антиоксидантнои и иммунной систем у больных с токсикозами, обусловленными онкологическими заболеваниями.
Оценить влияние различных методов лечения (хирургического, химио-лучевого, химиотерапевтического, фотодинамического) на состояние антиоксидантного и иммунного звеньев гомеостаза у больных со злокачественными новообразованиями.
5. Разработать методологические подходы к созданию и
доклиническому изучению антиоксидантных средств,
предназначенных для применения в онкологической клинике.
6. Разработать оригинальные средства для коррекции токсических
состояний различного генеза:
препарат на основе белкового антиоксиданта - лактоферрина женского молока, получивший название «Лапрот»;
биологически активную добавку на основе сухих экстрактов лекарственных растений, получившую название «Антиоксифит».
В экспериментальных исследованиях на животных с токсикозами различного генеза изучить физиологическое действие антиоксидантных средств: препарата «Лапрот», БАД «Антиоксифит», витаминов - индивидуальных и комплексных.
Оценить корригирующее влияние антиоксидантных средств различных классов: белкового препарата Лапрот, витаминных комплексов, БАД на антиоксидантное и иммунное звенья гомеостаза больных со злокачественными новообразованиями на различных этапах противоопухолевого лечения.
Оценить эффективность применения препарата Имунофан в качестве стимулятора эндогенной защиты у больных со злокачественными новообразованиями.
4.Новизна исследования
Осуществлен новый подход к диагностике и коррекции нарушений антиоксидантного и иммунного звеньев гомеостаза больных с онкологическими заболеваниями путем разработки и внедрения новых диагностических и лечебных технологий:
разработана оригинальная схема лабораторного исследования крови больного, позволяющая выявить нарушения гомеостаза больных с различными формами заболеваний на более тонком уровне, чем общепринятые в настоящее время варианты анализа;
впервые на основании лабораторных данных предлагается индивидуальный подход к коррекции антиоксидантного звена гомеостаза средствами заместительной терапии с различной антиоксидантной
активностью и (или) индукторами эндогенной антиоксидантной защиты организма.
Впервые для проведения заместительной антиоксидантной терапии разработан, изучен в эксперименте по оригинальной схеме, отработанной для отбора корригирующих средств для онкологических больных, и сертифицирован для применения в клинике ряд оригинальных средств на основе субстанций различной природы:
- не имеющий аналогов в мировой фармакопее препарат Лапрот на
основе белкового антиоксиданта - лактоферрина человека
детоксицирующего и противовоспалительного действия для внутривенного и
местного применения;
иммунотропный препарат Имунофан в качестве средства для индукции активности эндогенной антиоксидантной защиты и нормализации клеточного иммунитета у онкологических больных;
оригинальная биологически активная добавка «Антиоксифит» на основе лекарственных растений с антиоксидантной активностью, превышающей таковую индивидуальных витаминов, витаминных комплексов и БАД, используемых в клинической практике в настоящее время.
Впервые с учетом показателей антиоксидантного и иммунного статусов больных определена роль антиоксидантных витаминов в поддерживающей терапии больных с местнораспространенным опухолевым процессом.
Показано, что разработанные технологии позволяют наиболее рационально осуществлять активацию и поддержание деятельности защитных эндогенных систем организма - антиоксидантной и иммунной.
5. Практическая значимость исследования
Разработан алгоритм оценки состояния окислительно-
антиокислительного и иммунного звеньев гомеостаза у больных с
онкологическими заболеваниями до начала противоопухолевой терапии, а также на различных этапах специфического лечения.
Обоснована целесообразность проведения корригирующей терапии выявленных нарушений средствами с различной антиоксидантной активностью и разработаны показания к ее назначению.
Разработан оригинальный препарат «Лапрот» на основе белкового антиоксиданта лактоферрина человека, обладающий детоксицирующим и противовоспалительным действием. На этот препарат оформлена и зарегистрирована нормативно-техническая документация (Фармакопейная статья предприятия, регистрационный № 42 - 0618-6810-05) и налажено его опытное производство, позволившее обеспечить проведение I и II фаз клинических испытаний. Изучение физиологического действия этого препарата в эксперименте позволило обоснованно рекомендовать его применение у больных. В результате апробации этого препарата в клинике разработаны показания к его применению и даны практические рекомендации по его использованию в различных клинических ситуациях. На основании этих рекомендаций оформлена и утверждена «Инструкция по медицинскому применению препарата «Лапрот» (Протокол № 2 заседания Бюро ФГУ НЦ ЭСМП от 26.01.2006). Препарат находится на регистрации в Федеральном агентстве по здравоохранению и социальному развитию РФ.
Оценена эффективность применения отечественного
иммуномодулирующего препарата Имунофан у больных со злокачественными процессами, что позволило обосновать целесообразность назначения этого препарата не только для стимуляции иммунной системы, но и для активации эндогенной антиоксидантной системы организма, то есть в качестве детоксицирующего средства.
За исследования по теме «Разработка пептидного препарата «Имунофан» и его практическое применение в патогенетической терапии» в соавторстве с другими исследователями была присуждена Премия Правительства РФ 1999г. в области науки и техники (Диплом № 2817).
Оценена эффективность применения антиоксидантных витаминных комплексов в качестве средств для поддерживающей терапии больных с местнораспространенным опухолевым процессом, что позволило дать рекомендации к их использованию с целью детоксикации у этого контингента больных.
Разработаны методологические подходы к изучению БАД, пригодных для применения в онкологической клинике.
Разработана и зарегистрирована (регистрационное
удостоверение № 002313.643.12.2000, ТУ 9373-001-05784466-00) оригинальная биологически активная добавка «Антиоксифит» на основе лекарственного растительного сырья, с антиоксидантной активностью, превышающей официнальные антиоксидантные средства - витаминные комплексы и БАД. Изучение ее физиологического действия и безвредности показало возможность ее применения у больных со злокачественными новообразованиями. Апробация этой БАД в клинике позволила дать рекомендации по ее использованию у различных групп больных со1 злокачественными новообразованиями с целью профилактики и купирования токсических состояний.
Практические рекомендации для внедрения полученных результатов в широкую клиническую практику нашли свое отражение в Пособиях для врачей, утвержденных Министерством здравоохранения РФ:
Соколов В.В., Якубовская Р.И., Немцова Е.Р. и др. Особенности состояния системы естественной резистентности у онкологических больных при фотодинамической терапии. //Пособие для врачей, Москва, 1996г.
Бойко А.В., Якубовская Р.И., Немцова Е.Р. и др. Применение имунофана в качестве протектора и детоксицирующего агента при лучевом и химиолучевом лечении. // Пособие для врачей, Москва, 1998г.
Якубовская Р.И., Сергеева Т.В., Немцова Е.Р. и др. Антиоксидантная и иммунотерапия больных со злокачественными новообразованиями. //Пособие для врачей, Москва, 2001г.
Эделева Н.В., Немцова Е.Р., Р.И.Якубовская, и др. Коррекция клеточного метаболизма у онкологических больных в послеоперационном периоде препаратами антиоксидантного действия. //Пособие для врачей, Москва, 2003г.
Осипова Н.А., Решетов И.В., Ветшева М.С., и др.Анестезиологическое пособие и интенсивная терапия при операциях с микрохирургической аутопластикой в онкологии. // Медицинская технология. М.-.ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава.-2005.-28с.
6. Положения, выносимые на защиту
Гомеостаз животных и больных со злокачественными новообразованиями характеризуется сдвигом окислительно-антиокислительного баланса в сторону окисления и супрессивными нарушениями в иммунной системе, которые увеличиваются по мере увеличения распространенности опухолевого процесса; все виды противоопухолевого лечения способствуют усилению нарушений в окислительно-антиокислительной и иммунной системах.
Коррекция токсикоза организма-опухоленосителя антиоксидантными средствами до начала противоопухолевого лечения способствует уменьшению количества и степени выраженности токсических реакций лечения, а применение антиоксидантов после специфической терапии ускоряет процесс реабилитации.
Эффективность средств в восстановлении нарушенного окислительно-антиокислительного баланса и в детоксикации организма прямо коррелирует с их антиоксидантной активностью.
Разработанные оригинальные антиоксидантные средства: препарат «Лапрот» на основе лактоферрина женского молока и БАД «Антиоксифит», а также официнальный препарат «Имунофан» могут быть рекомендованы к применению в качестве детоксицирующих средств на различных этапах противоопухолевого лечения больных со злокачественными новообразованиями.
7. Апробация научных положений
Основные результаты исследований доложены на: 5-ом Всероссийском
Съезде анестезиологов и реаниматологов (Москва, 1996), 7th International
Congress on Anti-Cancer Treatment (Paris, 1997), 10th International Congress on
Oncogynecology (Portugal, 1997), Симпозиуме "Онкология на рубеже XXI
века. Возможности и перспективы" (Москва, 1999), Всероссийской
конференции "Сорбционные, электрохимические и гравитационные методы в
современной медицине" (Москва, 1999), International Congress "Modern
Methods of Diagnostics and Treatment of Allergy, Asthma and
Immunodeficiency", Tbilisi, Georgia, September, 1999, IV Международном
симпозиуме "Биологически активные добавки к пище: XXI век" (С-
Петербург, 2000), II съезде онкологов стран СНГ (Киев, 2000), V
Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище и
проблемы здоровья семьи» (Красноярск, 2001), VIII Всероссийском съезде
анестезиологов и реаниматологов (Омск, 2002), 3-ей национальной научно-
практической конференции с международным участием "Активные формы
кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск,
2003), Медико-фармацевтическом форуме (Москва, 2003), Научно-
практической конференции «Критические технологии в реаниматологии»
(Москва, 2003), Научно-практической конференции «Проблемы
онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2003), X
Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), XI Конгрессе «Человек и
лекарство» (Москва, 2004), Научно-практической конференции,
посвященной 30-летию кафедры анестезиологии и реаниматологии МГМСУ «Актуальные вопросы анестезиологии и реаниматологии» (Москва, 2005), 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2005), Научно-практической конференции «Наука Москвы - городу» (Москва-Ярославль, 2005).
8. Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 87 печатных работ. Эти
публикации включают: 30 статей в рецензируемых журналах, 9 статей в сборниках научных трудов, 32 тезисов в материалах научных форумов, 5 пособий для врачей, 1 ФСП на препарат «Лапрот», 10 патентов, из них 8 патентов Российской Федерации, 2 зарубежных патента.
9. Структура диссертации
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы (Глава I),
описания материалов и методов (Глава II), 6-й глав, содержащих собственные результаты (Главы III - VIII), Практических рекомендаций и Выводов.
Во Введении обоснована актуальность исследования, его научная новизна и практическая значимость, приведены положения, выдвигаемые на защиту, указаны научные форумы, на которых доложены результаты исследований, основные научные публикации автора и структура диссертации.
В Главе I «Применение антиоксидантных средств в онкологии. Обзор литературы» проанализированы данные мировой литературы, касающиеся роли оксидантов и антиоксидантов в патогенезе различных патологических состояний, в частности, в канцерогенезе, и применения антиоксидантов в схемах поддерживающей терапии больных со злокачественными новообразованиями.
В Главе II «Материалы и методы» описаны объекты исследования и методы, использованные в настоящей работе.
В Главе III «Состояние антиоксидантной и иммунной систем организма с токсикозом, индуцированным злокачественным процессом и противоопухолевым лечением» оценено влияние распространенности злокачественного процесса и противоопухолевого лечения на показатели окислительно-антиокислительного и иммунного звеньев гомеостаза у экспериментальных животных с опухолями различного гистогенеза и у больных со злокачественными новообразованиями различной локализации.
В Главе IV «Препарат «Лапрот» на основе белкового антиоксиданта - разработка и экспериментальное изучение» описана разработка оригинального антиоксидантного препарата «Лапрот» на основе лактоферрина женского молока и его доклиническое изучение в эксперименте.
В Главе V «Антиоксидантные витаминные комплексы -
доклиническое изучение» приведены результаты экспериментального изучения антиоксидантной активности индивидуальных витаминов и поливитаминных комплексов, их детоксицирующего действия и безопасности применения при наличии в организме злокачественной опухоли.
В Главе VI «БАД «Антиоксифит» на основе лекарственных растений - разработка и экспериментальное изучение» приведена оптимальная схема доклинического изучения БАД, предназначенных для применения у больных со злокачественными новообразованиями, результаты разработки БАД с высокой антиоксидантной активностью на основе экстрактов лекарственных растений и ее доклинического изучения по разработанной схеме.
В Главе VII «Оценка эффективности применения антиоксидантных
средств различных классов в схемах поддерживающей терапии
онкологических больных» приведены результаты апробации в клинике
МНИОИ им. П.А.Герцена разработанных и изученных в эксперименте
антиоксидантных средств различных классов и оценена эффективность их
применения для детоксикации, улучшения переносимости
противоопухолевого лечения и качества жизни больных.
В Главе VIII «Препарат Имунофан на основе синтетического модифицированного тимического гормона - оценка эффективности применения в схеме поддерживающей терапии онкологических больных» приведены результаты апробации препарата «Имунофан» в онкологической клинике в качестве иммуномодулирующего средства для
подготовки больных к химиолучевому лечению и ускорения реабилитации после него.
Диссертация изложена на 380стр., содержит 109 таблиц и 74 рисунка. Библиографический указатель включает 621 источник (118 отечественных и 503 зарубежных).
Активированные кислородные метаболиты
Человек обитает в аэробной среде, имея с ней многообразные связи. В организме постоянно протекают реакции с участием кислорода с образованием его активированных форм, многие из которых являются свободными радикалами [Fang Y-Z, et al, 2002]. Свободными радикалами называются молекулы с неспаренным электроном на внешней орбитали, которые характеризуются нестабильностью и высокой реакционной способностью [Gilbert DL, 2000]. В биологических системах понятия «свободные радикалы» и «активированные кислородные метаболиты» не совпадают, поскольку, с одной стороны, неспаренный электрон может быть локализован также на атомах других элементов: азота, углерода, серы, а с другой стороны, такие активные кислородсодержащие молекулы как перекись водорода (Н202), синглетный кислород ( 02), гипогалогениты не являются свободными радикалами, хотя активно участвуют в окислительных реакциях. Поэтому нельзя не согласиться с Е.Б.Меныциковой с соавторами [Меньшикова Е.Б. и др., 2006], которые считают, что наиболее полно понятие «окислители» в организме человека охватывается термином «активированные кислородные метаболиты» (АКМ) (рис. 1.1.), который и будет в дальнейшем применяться в настоящей работе. Свободные радикалы Кислородные радикалы Гипогалогениты GS\ R\ Np\ RO\ R02\ О/ , H02\ HO , H202, 02, НОСІ, HOBr, HO Активные формы кислорода Активированные кислородные метаболиты Рисунок 1.1. Активированные кислородные метаболиты, активные формы кислорода и свободные радикалы [Меньшикова Е.Б., 2006]. На рисунке 1.2 представлена схема образования АКМ в клетках организма человека и других млекопитающих [Fang Y-Z, et al, 2002]. Этот процесс происходит постоянно во всех клетках организма при физиологических и патологических условиях. В физиологических условиях одним из основных источников образования АКМ в клетках является электроно-транспортная цепь митохондрий, участвующая в синтезе аденозин трифосфата [Fridovich I., 1999, Floyd RA, et al, 2001]. Поскольку NADH, NADPH и FADH2 синтезируются в организме исключительно путем аэробного метаболизма белков, липидов и глюкозы, поступление в организм этих энергетических источников приводит к усилению продукции свободных радикалов митохондриями [Sohal RS, et al, 1996]. В физиологических условиях в митохондриях 0{ и Н202 метаболизируются марганецсодержащей супероксиддисмутазой (Mn-SOD) и глутатионпероксидазой, которые поддерживают их концентрации на низком уровне. Однако при патофизиологических условиях - при нарушении переноса электронов под действием различных факторов (химических агентов, ишемии/реперфузии, старении организма и др.) генерация АКМ в митохондриях может существенно возрастать [Floyd RA, et al, 2001 ].
Важным источником АКМ при физиологических, и, особенно, при патофизиологических условиях, является микросомальная монооксигеназная система - 1-ое звено системы детоксикации - играющая основную роль в I фазе метаболизма ксенобиотиков - окислительной [Кукес В.Г. и др., 2003]. Микросомальная монооксигеназная система представляет собой мультиферментный комплекс, локализующийся на мембранах гладкого эндоплазматического ретикулума различных клеток. Наиболее развитая микросомальная монооксигеназная система обнаружена в клетках печени, что обусловливает ее функции в организме как основного органа детоксикации. Важную роль она играет также в реакциях метаболизма в стенке кишечника и в легочной ткани [Pacifici GM, 1988]. LOO Рис.1.2. Образование свободных радикалов кислорода, азота и других реакционных соединений в клетках млекопитающих [Fang Y-Z, et al, 2002]. Acetyl CoA - ацетил коэнзим A, Arg - L -аргинин; BH4 - (6ІІ)-5,6,7,8-тетрагидро-Ь-биоптерин; СН20 - формальдегид; Cit - L-цитруллин; FAD - флавин аденин динуклеотид (окисленный); FADH2 - флавин аденин динуклеотид (восстановленный); Gly - глицин; Н2О2 - пероксид водорода; НОСІ - гипохлорная кислота; HLOH -гидроксильный липидный радикал; IR - ионизирующее излучение; L - липидный радикал; LH - липид (ненасыщенная жирная кислота); 1Х - алкоксильный липидный радикал; LOO- -пероксильный липидный радикал; LOOH - гидроперекись липида; МРО -миелопероксидаза; NAD+ - никотинамид аденин динуклеотид (окисленный); NADH -никотинамид аденин динуклеотид (восстановленный); NADP+ - никотинамид аденин динуклеотид фосфат (окисленный); NADPH - никотинамид аденин динуклеотид фосфат (восстановленный); -NO - оксид азота; 0{ - супероксиданион радикал; -ОН - гидроксил радикал; ONOO - пероксинитрит; Р450 - цитохром Р-450; PDG - фосфат-зависимая глутаминаза; Sarcosine - саркозин; Sar Oxidase - саркозин оксидаза; SOD - супероксид дисмутаза; ETS - электронтранспортные системы Микросомальная монооксигеназная система представлена двумя взаимосвязанными электроно-транспортными цепями (рис.1.3): 1) цитохром Р450 и NADPH-цитохром Р450 редуктазой, 2) цитохром Ь5 и NADH-цитохром Ь5 редуктазой. Общим принципом действия микросомальной монооксигеназнои системы является последовательный перенос 2-х электронов от пиридиндинуклеотидов (NADPH и NADH) каталитического фрагмента цитохром-редуктаз к цитохрому Р450 [Babior ВМ, 2000, ZangarRC, et al, 2004]. Основной функцией этой системы является детоксикация ксенобиотиков посредством гидроксилирования в реакции: RH + 02 +АН2 - ROH + Н20 + А, где RH - ксенобиотик, А - NADP+, NAD+ (рис.1.3).
Оценка активности окислительно-антиокислительных процессов у животных с токсикозами различной природы
Анализ мировой литературы, приведенный в Главе I «Обзор литературы» настоящей работы, показал, что, по современным представлениям, состояние окислительно - антиокислительного баланса организма играет важную роль в развитии опухолевого процесса, а прогрессирование заболевания сопровождается значительным увеличением в плазме крови продуктов пероксидации липидов и изменением активности компонентов антиоксидантной защиты [Dreher D, et al, 1996, Oberley TD, et al, 2002]. Однако, несмотря на то, что многие исследователи считают важным определение показателей антиоксидантного статуса, остается неясным, каковы же оптимальные параметры оценки окислительно-антиокислительных процессов в организме больных со злокачественными новообразованиями, как влияют методы специфического противоопухолевого лечения на состояние антиоксидантного и иммунного статусов организма и какие отклонения от средне статистически нормальных значений требуют коррекции.
. Оценка активности окислительно-антиокислительных процессов у животных с токсикозами различной природы К настоящему моменту имеется довольно большое количество исследований у больных с различными формами онкологических заболеваний, однако практически отсутствуют данные о влиянии опухолевого процесса и методов лечения на животных. В то же время именно использование линейных лабораторных животных позволяет получить статистически достоверные результаты, касающиеся различных воздействий. Это, в свою очередь, дает возможность прогнозировать эффект аналогичных воздействий на человека. Целью экспериментальных исследований явилась оценка влияния развития и прогрессирования опухолевого процесса и воздействия цитостатических препаратов на состояние окислительно-антиокислительной системы организма животных.
У животных с перевиваемыми опухолями: аденокарциномой легких Льюис (LLC) и лимфоидной лейкемией Р388, определяли концентрацию МДА как интегрального показателя, характеризующего интенсивность окислительных процессов, и активность ЦП, как ключевого фермента, диспропорционирующего супероксиданион радикал, который является родоначальником свободных радикалов в организме (табл. III. 1).достоверное отличие от показателя у интактных животных (р 0,05)
Как видно из представленных в таблице ПІЛ данных, интенсивность окислительных процессов прямо коррелировала с распространенностью опухолевого процесса. Так, у животных с подкожно перевитой, то есть солидной, опухолью Р388 концентрация МДА на 7-е сутки роста опухоли не отличалась достоверно от таковой у интактных животных, тогда как при асцитном варианте роста опухоли, который характеризуется более агрессивным течением, уже на 3-й сутки роста опухоли интенсивность окислительных процессов в 2 раза превышала таковую у интактных животных. Так же у животных с перевивной аденокарциномой легкого Льюис по мере прогрессирования процесса концентрация МДА резко возрастала: если на 7-е сутки роста опухоли, когда метастазы в легкие еще клинически не манифестируют, концентрация МДА в 2,5 раза превышала таковую у интактных животных, то на 20-е сутки роста опухоли, когда процессы метастазирования бурно развиваются, эта разница достигла более чем 4-х кратной величины. По-видимому, компенсаторно, в ответ на резкую интенсификацию окислительных процессов, во всех опухолевых моделях возрастала активность ЦП. При этом активизация эндогенного антиоксиданта прямо коррелировала с интенсификацией окислительных реакций. Однако, несмотря на 2-х - 5-й кратное увеличение активности ЦП - одного из наиболее мощных антиоксидантов в организме млекопитающих, этого было недостаточно для сдерживания пероксидации липидов при прогрессировании злокачественного процесса.
Таким образом, результаты экспериментов на животных показали, что развитие и генерализация опухолевого процесса приводят к усилению окислительных реакций в организме, которые обусловливают состояние ракового токсикоза.
Оценка этих же параметров окислительно-антиокислительной системы гомеостаза у интактных животных с токсикозом, индуцированным введением цитостатиков: ДЦП (12мг/кг), 5-ФУ (280мг/кг), ЦФ (450мг/кг) и ДР (12мг/кг), показала, что цитостатики оказывают активирующее действие в отношении окислительного звена гомеостаза (табл.III. 2, рис. III. 1).
Получение высокоочищенных субстанций ЛФ женского молока и нейтрофилов
Предпосылкой разработки препарата на основе лактоферрина женского молока послужили результаты изучения механизмов действия гемосорбции, полученные в 1986г. в МНИОИ им. П.А.Герцена. Было показано, что в результате дегрануляции нейтрофилов на угольных сорбентах в сыворотке крови резко (в 100-200 раз) увеличивается концентрация ЛФ [Якубовская Р.И., 1990]. Корреляция между высоким уровнем ЛФ, его физиологическими свойствами и клиническим эффектом гемосорбции указывала на возможность успешного использования экзогенного введения ЛФ для моделирования многочисленных эффектов гемосорбции.
Поскольку получение ЛФ из нейтрофилов в значительных количествах, пригодных для дальнейшей разработки препарата на его основе, представляет определенные трудности, целесообразно получать ЛФ из женского молока, куда он секретируется эпителиальными клетками. Концентрация ЛФ в молозиве и молоке ранних сроков лактации достигает 5-10мг/мл [Николаев А.А., 1985]. Однако для возможности адекватной замены ЛФ нейтрофилов на ЛФ женского молока необходимо было доказать идентичность ЛФ молока и ЛФ нейтрофилов физико-химическими и иммунохимическими методами. Это потребовало разработки метода выделения высокоочищенного лактоферрина из женского молока и нейтрофилов (ЛФм и ЛФн, соответственно).
Получение высокоочищенпых субстанций ЛФ женского молока и нейтрофилов Выделение и очистка ЛФ из женского молока и нейтрофилов были проведены нами методами классической хроматографии [Якубовская Р.И., 1986]. Метод получения ЛФм состоял из трех основных этапов: высаливания белков из молока, разделения их ионообменной хроматографией на КМ сефадексе С-50 и получения высокоочищенного ЛФ бионеспецифической хроматографией на сывороточном альбумине человека, полимеризованном глутаровым альдегидом (ЧСА-ГА). При выделении ЛФн ограничились двумя первыми этапами [Немцова Е.Р., 1988].
Для выделения ЛФм сырьем служила молочная плазма, которую получали, разделяя молоко на жировые глобулы и плазму центрифугированием при 6000об/мин при 4С. Для выделения ЛФн сырьем служил элюат с гемосорбентаСКН-1 10% раствором Na2HP04. На первом этапе сырье (молочную плазму или элюат с гемосорбента) обогащали ЛФ. Для этого молочную плазму подкислением разделяли на грубый препарат казеина, содержащий а-лактальбумин, и молочную сыворотку (надосадочная жидкость). Из молочной сыворотки после подщелачивания осаждали сульфатом аммония фракцию белков, содержащую ЛФ. Так же сульфатом аммония осаждали из элюата фракцию белков, содержащую ЛФ нейтрофилов. Осадки отделяли центрифугированием, растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и диализовали сначала против воды в течение 20 часов, а затем против натрий-фосфатного буфера (буферА) в течение 20 часов. Второй этап очистки ЛФ заключался в бесколоночной ионообменной хроматографии ЛФ. Сорбцию белков осуществляли, инкубируя растворы с сорбентом при перемешивании. Надосадочные жидкости отделяли и отбрасывали, а ЛФ элюировали ступенчато.
В качестве заключительного этапа очистки ЛФм использовали хроматографию на ЧСА-ГА, что позволило освободить субстанцию от примеси неспецифического компонента иммуноглобулина А (НСК IgA), присутствующего в молоке и очень близкого по своим физико-химическим свойствам ЛФ. В основу метода был положен способ, предложенный Van Munster с соавторами [Van Munster Н., 1971] для отделения примеси ЛФ при выделении НСК. Известно, что ЛФ, в отличие от ИСК, образует с ЧСА прочный KOMmieKc[Vesterberg О., 1966], который удается разобщить только при низком значении рН и высокой ионной силе. В результате бионеспецифической хроматографии на ЧСА-ГА был получен высооочищенный ЛФм. Степень гомогенности полученных субстанций оценивали методами Электрофореграммы ЛФ нейтрофилов (1) и ЛФ молока (2): А.-электорфорез в ПААГ в денатурирующих условиях; Б. - электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях. Как видно из рис. IV. 1, ЛФм (А2) образует одну узкую, хорошо очерченную полосу, что свидетельствует о высокой степени его гомогенности. Молекулярная масса ЛФм, определенная этим методом, равна 75 500+500Д. ЛФн при исследовании методом э/ф в денатурирующих условиях (рис. IV.1.A1) образует одну мажорную и две минорные полосы. Мажорная полоса соответствует компоненту с молекулярной массой 75500±500 Д, которая полностью совпадает со значением молекулярной массы ЛФм. При э/ф исследовании субстанций ЛФм и ЛФн в неденатурирующих условиях выявлено, что они образуют по одной широкой диффузной полосе, которые идентичны между собой по характеру и электорофоретической подвижности (рис.ІУЛ.БІ, Б2). Иммунодиффузионный анализ ЛФ молока и ЛФ нейтрофилов. В лунках: 1, 4 - ЛФ станд, 2, 5 - ЛФ молока, 3, 6 - ЛФ нейтрофилов, 7 -антисыворотка к белкам женского молока. Иммунодиффузионный анализ ЛФ молока и ЛФ нейтрофилов со стандартной тест-системой, содержащей антисыворотку к белкам молока и ЛФ станд., выявил, что ЛФ молока и ЛФ нейтрофилов являются гомогенными по антигенному составу и содержат только ЛФ человека (рис. IV.2.). Таким образом, было показано тождество некоторых физико-химических свойств ЛФм и ЛФн, что коррелировало с данными Mogilevsky N.. et al [Mogilevsky N., 1985].
Антиоксидантная активность индивидуальных витаминов и поливитаминных комплексов
Как показал анализ литературы (см. Главу I «Обзор литературы»), изучению в различных аспектах антиоксидантных витаминов: токоферолов, каротиноидов, ретиноидов и аскорбиновой кислоты уделяется большое внимание. Этот интерес обусловлен многообразием их физиологических функций, в основе которых лежит способность захватывать и инактивировать свободные радикалы. Эти соединения являются в организме человека вторичными антиоксидантами и дополняют первичные - белковые антиоксиданты (ЦП, СОД, ЛФ, Кат) в системе детоксикации.
Многие исследователи отмечают синергизм антиоксидантного действия витаминов А, Е, С и (3-каротина [Vile G.F., et al, 1988, Niki E., et al, 1995, Palozza P., et al 1991], причем р-каротин во многих процессах играет ведущую роль. Это обусловливает целесообразность создания поливитаминных комплексов на основе Р-каротина.
Широкое изучение и клиническое использование Р-каротина стало возможным благодаря созданию его синтетической формы [Devasagayam Т.Р.А., et al, 1992]. В нашей стране одним из создателей синтетического Р-каротина и поливитаминных комплексов (ПВК) на его основе является лаборатория нетоксичных иммуномодуляторов РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина под руководством проф. А.В.Сергеева [Шашкина М.Я. и др., 1999]. Эти ПВК стали объектом доклинического изучения в настоящем исследовании.
Целью настоящего раздела исследований, посвященного изучению индивидуальных и комплексных витаминов - антиоксидантов, явилась оценка возможности их использования в качестве детоксицирующих средств в поддерживающей терапии онкологических больных. В рамках этой цели решали следующие задачи: 1. оценили антиоксидантную активность индивидуальных витаминов и ПВК; 2. изучили их влияние на рост экспериментальных опухолей различного гистогенеза; 3. оценили их детоксицирующее действие на экспериментальных моделях токсикоза, индуцированного цитостатическими препаратами. V.I. Антиоксидантная активность индивидуальных витаминов и поливитаминных комплексов Антиокислительные свойства различных препаратов витаминов оценили в биологической тест-системе, основанной на ингибировании перекисного окисления липидов в гомогенате печени мышей [Сергеева Т.В., 1999]. Исследовали водорастворимые и жирорастворимые витамины, среди которых были препараты индивидуальных витаминов, официнальные поливитаминные комплексы, ряд новых витаминных антиоксидантных комплексов (ПВК1, ПВК2, ПВКЗ, ПВК4), разработанных в РОНЦ им. Н.Н.Блохина, и комплекс ПВК, составленный в МНИОИ им. П.А.Герцена из отечественных индивидуальных витаминов, а также каротиноиды - аналоги Р-каротина, не обладающие витаминной активностью (лютеин, ликопин и зеаксантин). Антиоксидантная активность индивидуальных соединений и ПВК представлена в таблицах V. 1 и V.2, соответственно.
Проведенные исследования показали, что изученные витаминные комплексы значительно различаются по своим антиоксидантным свойствам. Так, например, удельная антиоксидантная активность витаминных комплексов, содержащих в своем составе (3- каротин, витамины А, Е, С в различных количественных соотношениях (ПВК, Центрум, Декамевит, Ревиталайз М), колебалась от 4 до 50 ед. акт. (табл. V.2).
При анализе полученных данных и сопоставлении составов новых ПВК выявлено, что в условиях использованной нами тест-системы большую удельную антиоксидантную активность проявляют наиболее богатые по составу витаминные комплексы. Так, наибольшей активностью обладает ПВКЗ, содержащий в своем составе 0- каротин, витамины С, Е, рутин, а наименьшей - двухкомпонентный комплекс - ПВК1 ф- каротин, витамин С).
Однако помимо удельной антиоксидантнои активности при оценке эффективности использования того или иного поливитаминного комплекса немаловажным является определение антиоксидантнои активности препарата в целом. Анализ составов поливитаминных комплексов показал, что в различных препаратах доля антиоксидантных компонентов в составе лекарственной формы (капсулы, таблетки, драже) колеблется от 3 до 40%.
