Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы фотодинамической терапии злокачественных опухолей (обзор литературы)
1.1. Фотодинамическая терапия: понятие, терминология и показания к применению 13
1.2. История фотодинамической терапии 17
1.3. Фотодинамическая терапия - механизмы действия 21
1.4. Характеристика основных групп современных фотосенсибилизаторов 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Характеристика модели экспериментальной опухоли 43
2.1.1. Характеристика экспериментальных животных 43
2.1.2. Характеристика экспериментальной аденокарциномы Эрлиха и методики ее воспроизведения 44
2.2. Группы исследования и их обоснование 55
2.2.1. Клинический этап 56
2.2.2. Морфологический этап 57
2.3. Фотосенсибилизатор «Радахлорин» 58
2.3.1. Расчет дозы фотосенсибилизатора 60
2.4. Расчет световой дозы и методика облучения 62
2.5. Методики морфологического исследования 65
2.6 Статистическая обработка полученных данных 66
ГЛАВА 3. Клиническая оценка эффективности ФДТ экспериментальной опухоли Эрлиха у мышей
3.1. Воспроизведение экспериментальной опухоли Эрлиха у мышей 67
3.2. Клиническая оценка эффективности фотодинамической терапии 71
ГЛАВА 4. Результаты морфологической части эксперимента
4.1. Динамика морфо-функциональных изменений в опухоли при фотодинамической терапии 83
4.2. Сравнительная морфологическая характеристика экспериментальной опухоли при ФДТ, при введении фотосенсибилизатора без лазерного облучения и при лазерном облучении без введения фотосенсибилизатора 99
ГЛАВА 5. Обсуждение собственных результатов 105
Выводы 115
Практические рекомендации 115
Библиографический список 117
- Фотодинамическая терапия - механизмы действия
- Расчет дозы фотосенсибилизатора
- Клиническая оценка эффективности фотодинамической терапии
- Сравнительная морфологическая характеристика экспериментальной опухоли при ФДТ, при введении фотосенсибилизатора без лазерного облучения и при лазерном облучении без введения фотосенсибилизатора
Введение к работе
Актуальность темы
Злокачественные новообразования являются одной из наиболее сложных медико-социальных проблем современного общества. По данным международного агентства по изучению рака (МАИР), в мире прогнозируется увеличение заболеваемости злокачественными новообразованиями с 10 млн в год, регистрируемых в настоящее время, до 15 млн к 2020-му году. Одновременно смертность может возрасти с 6 до 9 млн случаев в год.
Неблагоприятные демографические тенденции и сложная экологическая обстановка сопровождаются неуклонным ростом числа онкологических заболеваний, в тоже время раннее лечение злокачественных новообразований дает гораздо лучший прогноз.
В последние годы генеральной концепцией клинической онкологии является органосохраняющее лечение опухолей [Чиссов В.И., 2002]. Арсенал методов, позволяющих проводить органосохраняющее лечение, расширился, благодаря принципиально новому методу лечения – фотодинамической терапии. Фотодинамическая терапия [ФДТ] основана на деструкции злокачественных новообразований в результате возникновения ряда фотохимических реакций при взаимодействии различных видов светового излучения определенных длин волн и лекарственного препарата –
фотосенсибилизатора, избирательно накапливающегося в опухолевой ткани [Вакуловская Е.Г. и др., 2004; Тиглиев Г.С. и др., 2004].
В своем современном виде фотодинамическая терапия злокачественных новообразований применяется в клинической практике около 25 лет [Странадко Е.Ф. и др., 1998]. Известные ранее фотосенсибилизаторы 1-го поколения «Фотогем», «Фотофрин» – производные гематопорфирина и 2-го поколения «Фотосенс», «Фталосенс» – производные фталоцианинов имеют ряд существенных недостатков: медленное накопление в опухолевой ткани, недостаточно высокую селективность, сравнительно невысокую терапевтическую эффективность, длительный (не менее 3-х месяцев) период полувыведения из организма, что повышает риск развития тяжелых форм кожной светочувствительности и связанных с ней осложнений [Вакуловская Е.Г. и др., 2002]. Этого недостатка лишен новый фотосенсибилизатор оригинальный отечественный препарат производное тетрапиррольных макроциклов хлоринового ряда «Радахлорин», который выводится из организма на 94 % уже через сутки [Решетников А.В. и др., 2001]. Поэтому для дальнейшего развития фотодинамической терапии опухолей перспективным является изучение фотосенсибилизаторов второго поколения, производных хлоринового ряда.
Результаты доклинических пилотных исследований и первой фазы клинических испытаний «Радахлорина» свидетельствуют о хороших фотофизических свойствах, высокой фотодинамической активности и практическом отсутствии побочных эффектов данного препарата при лечении экспериментальных опухолей [Решетников А.В. и др., 2002]. Препарат изучен в эксперименте и показал высокую эффективность, хорошие спектральные, физико-химические и энергетические характеристики. Выявленные характеристики, выгодно отличают его от используемых в клинике препаратов отечественного и импортного производства. Однако до сих пор мало изученными остаются механизмы противоопухолевого действия ФДТ, имеющиеся данные позволяют рассуждать о многих аспектах ФДТ только на уровне теорий и носят поисковый характер. Отсутствие однозначного мнения по указанной проблеме делает выполнение данной работы актуальным. Исследование механизмов фотодинамического повреждения с фотосенсибилизатором второго поколения хлоринового ряда ранее проводили только лишь на культурах клеток in vitro, а на тканевом уровне – на ткани «здоровой» печени крыс [Кац В.А. и др., 1996; Каплан М.А., 2004].
Цель исследования
Определить механизмы формирования некроза опухоли, лежащие в основе фотодинамического повреждения при использовании Радахлорина в эксперименте на лабораторных животных с перевитой опухолью.
Задачи исследования
-
Оценить возможность использования аденокарциномы Эрлиха перевитой мышам линии Balb/c, в качестве модели экспериментальной опухоли для изучения фотодинамических эффектов нового фотосенсибилизатора Радахлорин.
-
На основе динамического клинико-морфологического исследования экспериментальной аденокарциномы Эрлиха определить особенности формирования и развития некроза опухоли в результате фотодинамической терапии с препаратом Радахлорин.
-
На основании полученных данных определить некоторые механизмы некробиоза опухоли после фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Радахлорин».
Научная новизна
Впервые в эксперименте на перевиваемых опухолях у мышей проведена клинико-морфологическая оценка эффективности фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором второго поколения Радахлорин. На модели экспериментальной аденокарциномы Эрлиха подробно описаны клинические изменения в опухоли после фотодинамической терапии с момента облучения до отторжения некротизированной опухоли и формирования рубца. Впервые описаны морфологические проявления эффектов фотодинамической терапии на опухоль в динамике с момента облучения лазером опухоли до ее некроза и отторжения. Определены механизмы и стадии некробиоза опухоли в результате фотодинамической терапии. В генезе фотодинамического повреждения опухоли первостепенное значение имеют расстройства гемодинамики, протекающие стадийно и определяющие развитие некроза.
Разработана классификация этапов некробиоза опухоли после фотодинамической терапии на основе сопоставления клинических наблюдений и морфологических изменений в опухоли после фотодинамической терапии.
Данная работа на экспериментальной модели опухоли in vivo выполнена впервые.
Практическая значимость
Полученные сведения могут служить основой новых исследований по изучению фотосенсибилизаторов хлоринового ряда и фотодинамической терапии с их использованием. Выявленный сосудистый механизм повреждения опухоли обосновывает возможность проведения фотодинамической терапии в качестве предварительного этапа комбинированного лечения, когда высок риск гематогенного метастазирования, а также для повышения абластики и антибластики во время операции и после нее на «ложе» опухоли. Кроме того, фотодинамическую терапию с сенсибилизаторами хлоринового ряда можно рекомендовать для клинических испытаний в лечении сосудистых новообразований.
Представленные результаты исследования обосновывают перспективность и целесообразность клинического применения с сенсибилизаторами группы хлоринов фотодинамической терапии злокачественных опухолей.
Внедрение результатов исследования в практику
Полученные результаты изучения механизмов формирования некрозов опухоли при фотодинамической терапии с Радахлорином внедрены в учебный процесс кафедр общей хирургии и патологической анатомии Челябинской государственной медицинской академии.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на заседании Челябинского областного общества хирургов (Челябинск, 2009), на научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2009).
Публикации
По результатам исследования опубликованы 4 научные работы, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.12 – «Онкология» (медицинские науки). Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данной специальности, конкретно пунктам 2, 6 паспорта научной специальности.
Научные положения диссертации также соответствуют формуле специальности 14.03.02 – «Патологическая анатомия» (медицинские науки). Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данной специальности, конкретно пункту 1 паспорта научной специальности.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Экспериментальная аденокарцинома Эрлиха является адекватной моделью злокачественной опухоли для оценки фотодинамических эффектов с фотосенсибилизатором Радахлорин.
-
В эксперименте на перевиваемых опухолях мышей установлены закономерности клинико-морфологических проявлений повреждающего некробиотического действия фотодинамической терапии на злокачественную опухоль, в основе которых лежит гипоксическое повреждение опухоли, опосредованное расстройствами микроциркуляторного русла.
-
Морфологические и морфометрические исследования позволяют в динамике оценить патогенетические механизмы некробиоза опухоли при фотодинамической терапии.
Объем и структура работы
Работа представлена на 145 страницах, содержит 8 таблиц и 40 рисунков. Список литературы содержит 299 источников, в том числе 152 отечественных и 147 зарубежных. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (одна глава), собственных исследований (четыре главы), выводов и практических рекомендаций.
Личный вклад автора
Все исследования, указанные автором в диссертации, обработка, анализ и оценка результатов выполнены лично автором.
Фотодинамическая терапия - механизмы действия
Многие ученые считают, что фотодинамическая терапия основана на фотохимических реакциях хромофоров экзогенного и эндогенного происхождения, которые накапливаются преимущественно опухолевыми клетками. Активация хромофоров с последующей гиперпродукцией активных форм кислорода индуцирует гибель опухолевых клеток путём апоптоза или некроза [Залевский В.Н. и др., 2004].
Вопрос о том, какие механизмы отвечают за селективное накопление фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани, также окончательно не решен. Накоплению ФС в опухоли могут способствовать специфические механизмы захвата препаратов клетками новообразования [Кирвялене В.А и др., 1989; Коган Е.А. и др., 1993; Dubbelman Т.М. et al, 1982; Kessel D., 1986]. Так, в крови пациентов с опухолями производное гематопорфирина соединяется с различными сывороточными белками, включающими липопротеины, глобулины и альбумины. Наиболее продолжительное связывание (более 48ч) отмечается с липопротеинами [Jori G. et al., 1984]. Возможно, именно это соединение приводит в итоге к селективному накоплению фотосенсибилизатора в опухолевых клетках, которые являются ловушкой для многих веществ и, по некоторым данным, содержат большое количество липопротеиновых рецепторов [Norata G. et al., 1985].
Установленная избирательность накопления фотосенсибилизаторов в опухоли, по-видимому, связана также с морфофизиологическими особенностями самой опухолевой ткани. Известно, что злокачественные опухоли имеют сосуды капиллярного типа, часто с несовершенной базальной мембраной, измененным эндотелием и повышенной проницаемостью [Bernard Е., 1988; Steinberg F. et al., 1990]. Скорость кровотока в них значительно ниже, чем в нормальных капиллярах. Все эти особенности сосудов опухоли, а также отсутствие адекватного лимфатического оттока [Bugelski P.G. et al.} 1981; Dougherty T.J., 1989] могут способствовать более длительному контакту фотосенсибилизаторов с сосудами стромы новообразования, большей возможности задержки их в стенках сосудов и в периваскулярнои зоне, а также проникновению молекул фотосенсибилизаторов и их комплексов в более глубокие по отношению к сосудам участки опухолевой ткани [Коган Е.А. и др., 1993]. C.J. Gomer (1989) предполагает, что избирательное накопление фотосенсибилизатора в опухоли и повышенная чувствительность опухолевой ткани к фотодинамической терапии могут быть связаны и с другими факторами. Флуоресцентными и радиоизотопными методами показано, что фотосенсибилизатор накапливается преимущественно в сосудах опухоли и периваскулярнои ткани [Berg L.F. et al., 1986; Bugelski P.G. et al., 1981].
Микроскопические исследования, проводимые в первые минуты облучения фотосенсибилизированных тканей, всегда выявляют нарушение микроциркуляции и сосудистые повреждения. Используя метод телевизионной микроскопии in vitro, М. W. Reed и др. (1989) наблюдал стаз кровотока в 90% артериол и 70 - 75 % венул. Вазоконстрикция артериол и тромбоз венул стали первым ответом тканей на фотодинамическую терапию. Нарушения микроциркуляции и немногочисленные геморрагии возникали немедленно после фотодинамической терапии опухолей, сенсибилизированных производными гематопорфирина. Через 4 часа кровоизлияния наблюдались во всей опухоли, а спустя сутки наступил некроз большей части опухолевой ткани. Похожие изменения под действием фотодинамической терапии возникают и в очаге демаркационного воспаления, где, как известно, так же как и в опухоли, преобладают сосуды капиллярного типа. Следовательно, можно предположить, что наиболее чувствительными к фотодинамической терапии являются ткани, где есть новообразованные сосуды капиллярного типа [Коган Е.А. и др., 1993]. Пусковым моментом в развитии сосудистых изменений при фотодинамической терапии является повреждение эндотелия. Выявляется округление обычно вытянутых и плоских эндотелиальных клеток, что ведет к разрыву тесных связей между ними, потере межклеточных коммуникаций и обнажению экстрацеллюлярного матрикса и базальной мембраны. Такие значительные изменения эндотелиальных клеток после фотодинамической терапии ведут к активации циркулирующих тромбоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов и, как следствие, к тромбогенному эффекту и нарушению микроциркуляции. Изменения метаболизма и последующий некроз эндотелиальных клеток, приводит к их сепарации, активации тромбоза, повышению проницаемости сосудистой стенки, что является наиболее частыми морфологическими находками после фотодинамической терапии [Каплан М.А., 2004].
Повреждению эндотелиальных и других клеток сосудистой стенки при фотодинамической терапии способствуют: во-первых, высокая насыщенность клеток сосудистой стенки молекулярным кислородом, поступающим из циркулирующей крови, во-вторых, накопление в них фотосенсибилизатора в больших концентрациях, что подтверждается данными люминесцентной микроскопии [Berg L.F. et al., 1986], в-третьих, доказана экспериментально большая чувствительность эндотелиальных клеток к фотодинамической терапии [Gomer C.J. et al., 1988].
Наиболее чувствительным участком микроциркуляции к фотодинамическому воздействию являются венулы [Berembaum М.С. et al., 1986]. Этот эффект может быть связан с тем, что в венозном русле больше чем в артериальном концентрация Н2-рецепторов, а также высокий уровень образования гистамина при фотодинамическом воздействии. Возможно, что различия в чувствительности к фотодинамической терапии зависят и от особенностей обезвреживания активных форм кислорода, а в эндотелии вен концентрация супероксиддисмутазы достоверно ниже, чем в эндотелии артерий [Коган Е.А., 1979]. Это создает условия для генерации более высоких концентраций супероксид-аниона и приводит к более выраженному повреждению эндотелия венул [Коган Е.А. и др., 1993]. Таким образом, на примере производных гематопрфирина было доказано, что повреждение сосудов, выраженное в той или иной степени, всегда имеет место при фотодинамической терапии. Нарушения перфузии и ишемия опухолевой ткани с одной стороны, уменьшают насыщаемость ткани молекулярным кислородом и, следовательно, генерацию синглетного кислорода в фотохимических реакциях типа 2, но, в то же время, сама ишемия вызывает гибель опухолевых клеток [Коган Е.А. и др., 1993].
Существуют две основные теории, объясняющие механизм противоопухолевого действия фотодинамической терапии. Различают прямое фотодинамическое повреждение опухолевых клеток и непрямое (опосредованное) [Странадко Е.Ф., 2000; Каплан М.А., 2004]. Механизмы прямого фотодинамического повреждения опухолевых клеток изучались в нескольких аспектах разными группами ученых, в том числе и отечественными исследователями.
При первом типе реакций молекулы фотосенсибилизатора, поглощая излучение с заданной длиной волны, переходят в возбужденное триплетное состояние, в этом состоянии они взаимодействуют с биомолекулами путем передачи электронов или гидроксильных атомов. Образующиеся в результате этого взаимодействия радикалы субстрата и (или) фотосенсибилизатора, могут вступать во взаимодействие с молекулярным кислородом, приводя к образованию свободных радикалов: пероксидов, супероксид-анионов, гидроксильных радикалов и (или) гидроксид-аниона [Странадко Е.Ф., 2000].
В реакциях второго типа энергия молекулы возбужденного фотосенсибилизатора сразу передается молекуле кислорода, в результате чего образуется синглетный кислород, который для живых клеток является цитотоксичным благодаря своему свойству сильного окислителя биомолекул [Странадко Е.Ф., 2000].
Расчет дозы фотосенсибилизатора
Препарат «Радахлорин, 0,35 %-ный раствор для внутривенного введения» вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг. Дозу препарата определяли по общепринятой формуле пересчета дозы, принятой для пересчета на мышей с дозы на человека DM=D4 40, где D4 - доза для человека (мг/кг), DM доза для мыши (мг/кг), 40 - общепринятый в экспериментах на мышах коэффициент пересчета. По этой формуле получаем: DM=40 1=40 мг/кг. Расчет объема вводимого мышам Радахлорина проводили по следующей формуле: Х=К М С/3500, где К - кратность разведения ФС, М - масса мыши (масса мыши в граммах), С - концентрация Радахлорина (мг/кг), 3500 -коэффициент перерасчета массы в объем с учетом разницы единиц измерения и концентрации исходного раствора препарата.
С помощью программного измерительного комплекса, разработанного в межвузовском медико-физическом центре на основе спектрометра фирмы «Ocean» (США), в динамике проводилось прямое измерение накопления фотосенсибилизатора в опухоли и окружающих тканях (рисунок 2.12).
Через 2-3 часа после внутрибрюшинного введения Радахлорина у всех особей отмечен максимальный пик накопления препарата в тканях опухоли и максимальная контрастность по отношению к здоровой коже (рисунок 2.13), которая сохранялась не менее чем 5-6 часов.
Именно в этот промежуток времени проводилось лазерное облучение опухоли в основной группе исследования.
2.4. Расчет световой дозы и методика облучения
В качестве источника света для ФДТ использовался лазерный диодный модуль «ML662-SP» (синонимы: Лахта, Милон 500-СП), производимый ЗАО «Милон Лазер» (Санкт-Петербург), на основе лазерного фотокоагулятора ФЛОД-1, имеющего сертификат Минздрава РФ с излучением на длине волны 662 нм (рисунок 2.14).
Рисунок 2.14 - Лазерный модуль
Для доставки света к опухоли использовались моноволоконные кварцевые световоды с микролинзой, которые дают круговую диаграмму рассеивания с четкой границей светового пятна (рисунок 2.15).
Облучение опухолей производилось лазером с длиной волны 662 нм. В эксперименте мы считали целесообразным использовать световую дозу 200 Дж/см2. При поверхностной методике облучения опухолей световая доза сильно зависит от координат (расстояния от излучателя до поверхности опухоли) и оптических свойств самой ткани. Аппарат для определения дозного поля в настоящее время существует только в экспериментальных работах. Поэтому при расчете световой дозы при дистанционной методике облучения мы исходили из следующего приближенного подхода. При поверхностном облучении создается объемная доза для достаточного эффекта вплоть до глубины 5 мм. Значит при толщине опухоли в 5 мм, поверхностной дозе 200 Дж/см и диаметре светового пятна 1 см, средняя объемная доза в зоне опухоли будет составлять 400 Дж/см . Длительность облучения при фотодинамической терапии рассчитывали, исходя из заданной эмпирически подобранной эффективной плотности энергии подведенного излучения Е (эффективной световой дозой мы считали плотность лазерного излучения 200 Дж/см ).
Для расчета времени экспозиции применялась следующая формула: T = E S/P где Т (сек.) - время экспозиции света, Е (Дж = Вт сек.) - эффективная плотность энергии подведенного излучения, S (см2) - площадь опухоли, Р (Вт) - выходная мощность на торце световода. Таким образом, при площади опухоли 1 - 1,5 см и мощности лазерного облучения 1,5 Вт, время экспозиции света в эксперименте составило 133-200 секунд. Проведение ФДТ не требовало наркотизации животного ввиду кратковременности облучения. Рисунок 2.16-Дистанционное облучение опухоли В эксперименте использована методика поверхностного (дистанционного) лазерного облучения. Световод устанавливался на таком расстоянии от поверхности опухоли, чтобы световое пятно захватывало всю опухоль и часть окружающей кожи с отступлением от видимых границ опухоли не менее 0,5 см (рисунок 2.16). 65 Воздействие лазерным излучением производится методом кругового поля. Световая энергия подводится строго перпендикулярно поверхности опухоли.
Клиническая оценка эффективности фотодинамической терапии
Препарат «Радахлорин, 0,35 %-ный раствор для внутривенного введения» вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг. Дозу препарата определяли по общепринятой формуле пересчета дозы, принятой для пересчета на мышей с дозы на человека DM=D4 40, где D4 - доза для человека (мг/кг), DM доза для мыши (мг/кг), 40 - общепринятый в экспериментах на мышах коэффициент пересчета. По этой формуле получаем: DM=40 1=40 мг/кг. Расчет объема вводимого мышам Радахлорина проводили по следующей формуле: Х=К М С/3500, где К - кратность разведения ФС, М - масса мыши (масса мыши в граммах), С - концентрация Радахлорина (мг/кг), 3500 -коэффициент перерасчета массы в объем с учетом разницы единиц измерения и концентрации исходного раствора препарата.
С помощью программного измерительного комплекса, разработанного в межвузовском медико-физическом центре на основе спектрометра фирмы «Ocean» (США), в динамике проводилось прямое измерение накопления фотосенсибилизатора в опухоли и окружающих тканях (рисунок 2.12).
Через 2-3 часа после внутрибрюшинного введения Радахлорина у всех особей отмечен максимальный пик накопления препарата в тканях опухоли и максимальная контрастность по отношению к здоровой коже (рисунок 2.13), которая сохранялась не менее чем 5-6 часов.
Именно в этот промежуток времени проводилось лазерное облучение опухоли в основной группе исследования.
В качестве источника света для ФДТ использовался лазерный диодный модуль «ML662-SP» (синонимы: Лахта, Милон 500-СП), производимый ЗАО «Милон Лазер» (Санкт-Петербург), на основе лазерного фотокоагулятора ФЛОД-1, имеющего сертификат Минздрава РФ с излучением на длине волны 662 нм (рисунок 2.14).
Для доставки света к опухоли использовались моноволоконные кварцевые световоды с микролинзой, которые дают круговую диаграмму рассеивания с четкой границей светового пятна (рисунок 2.15).
Облучение опухолей производилось лазером с длиной волны 662 нм. В эксперименте мы считали целесообразным использовать световую дозу 200 Дж/см2. При поверхностной методике облучения опухолей световая доза сильно зависит от координат (расстояния от излучателя до поверхности опухоли) и оптических свойств самой ткани. Аппарат для определения дозного поля в настоящее время существует только в экспериментальных работах. Поэтому при расчете световой дозы при дистанционной методике облучения мы исходили из следующего приближенного подхода. При поверхностном облучении создается объемная доза для достаточного эффекта вплоть до глубины 5 мм. Значит при толщине опухоли в 5 мм, поверхностной дозе 200 Дж/см и диаметре светового пятна 1 см, средняя объемная доза в зоне опухоли будет составлять 400 Дж/см . Длительность облучения при фотодинамической терапии рассчитывали, исходя из заданной эмпирически подобранной эффективной плотности энергии подведенного излучения Е (эффективной световой дозой мы считали плотность лазерного излучения 200 Дж/см ).
Для расчета времени экспозиции применялась следующая формула: T = E S/P где Т (сек.) - время экспозиции света, Е (Дж = Вт сек.) - эффективная плотность энергии подведенного излучения, S (см2) - площадь опухоли, Р (Вт) - выходная мощность на торце световода. Таким образом, при площади опухоли 1 - 1,5 см и мощности лазерного облучения 1,5 Вт, время экспозиции света в эксперименте составило 133-200 секунд. Проведение ФДТ не требовало наркотизации животного ввиду кратковременности облучения. Рисунок 2.16-Дистанционное облучение опухоли В эксперименте использована методика поверхностного (дистанционного) лазерного облучения. Световод устанавливался на таком расстоянии от поверхности опухоли, чтобы световое пятно захватывало всю опухоль и часть окружающей кожи с отступлением от видимых границ опухоли не менее 0,5 см (рисунок 2.16). 65 Воздействие лазерным излучением производится методом кругового поля. Световая энергия подводится строго перпендикулярно поверхности опухоли.
Сравнительная морфологическая характеристика экспериментальной опухоли при ФДТ, при введении фотосенсибилизатора без лазерного облучения и при лазерном облучении без введения фотосенсибилизатора
Для выявления возможных различий морфологических изменений в опухоли нами проведен сравнительный анализ морфометрических показателей в группах контроля, у интактных животных и в основной группе.
После ФДТ объемная плотность сосудистого русла достоверно снижалась уже через 5 минут по сравнению со второй контрольной группой (рисунок 4.8). Статистически значимая тенденция к уменьшению объемной доли сосудов опухоли в основной группе по сравнению с первой и второй контрольными группами сохранялась до 7-х суток.
Средний диаметр сосудов опухоли в основной группе был статистически достоверно меньшим, чем у контрольных животных на сроках 5, 30 минут и 1 час.
Как следует из данных рисунка 4.9 статистически значимые различия между группами, связанные с увеличением диаметра сосудов опухоли после ФДТ выявлялись через 3, 6, 12, 24 часа и 3 суток. На 7-е сутки достоверных отличий в среднем диаметре сосудов между контрольными и основной группами не установлено, что, возможно, обусловлено, опухолевым ангиогенезом.
Основные различия в объемной плотности эпителия опухоли между группами обнаруживались через 3 часа (рисунок 4.10). В этот период отмечено значительное снижение объемной доли эпителиоцитов в основной группе, а у контрольных животных объем эпителия сохранялся на прежнем уровне. Через 6 часов объемная плотность эпителия в группе, подвергшейся ФДТ уменьшалась в 4 раза по сравнению с первой и второй контрольными
101 группами (р=0,000), т.е. у мышей основной группы в отличие от контрольных животных установлено достоверное снижение объема паренхимы опухолевой ткани.
В тоже время в отношении объема некрозов опухоли отмечалась обратная зависимость: после ФДТ их объемы значительно возрастали. Так, к 3-м часам в основной группе доля некрозов возрастала почти в 2 раза до 20,7±2,1 % (р=0,000 против 12,1 ±3,7 % в первой контрольной группе и 12,0±3,3 % во второй контрольной группе). Достоверное увеличение объемной плотности некрозов обнаружено в основной группе через 6, 12 часов, в 1-е и 3-й сутки по сравнению с контрольными группами (р=0,005). Таким образом, объем некрозов в основной группе статистически значимо отличался от такового в контрольных группах в промежутке с 3-х часов и до 3 суток с пиком увеличения на 12 часов. Через 7 суток доля некрозов составляла 11,8±2,6 % в основной группе, 13,6+4,1 % в первой группе, 10,7±3,9 % во второй группе
Объемное содержание стромы в опухоли основной группы превышало аналогичные показатели во второй контрольной группе через 1 час (р=0,006), через 3 часа статистически значимые различия установлены между основной группой и двумя группами контроля. Тенденция к увеличению объема стромы после ФДТ в отличие от контрольных животных регистрировалась на всех сроках эксперимента (рисунок 4.12).
Выявленная тенденция на ранних сроках эксперимента (в 1, 3, 6, 12 часов, 1-е сутки) была обусловлена нарастанием дистрофических процессов в строме: плазморрагии, отек периваскулярных и межклеточных пространств, мукоидное набухание коллагеновых волокон. Через 3 суток в опухоли животных, подвергавшихся ФДТ, наблюдалось врастание грануляционной ткани в некротические массы, что не обнаруживалось у мышей контрольных групп. К 7-м суткам обширные поля грануляций имелись у всех животных основной группы (рисунок 4.13а), которые к 28-м суткам созревали в негрубую волокнистую соединительную ткань, замещающую дефект дермы (рисунок 4.136).
Полученные нами результаты исследования позволяют раскрыть некоторые механизмы фотодинамической реакции при ФДТ с фотосенсибилизатором нового поколения Радахлорин и определить закономерности и стадийность процессов гибели опухоли в результате ФДТ. Впервые на основе сопоставления клинических проявлений ФДТ экспериментальной опухоли и морфологических изменений в опухолевой и окружающих тканях получено представление о характере повреждающего действия ФДТ с Радахлорином на опухолевую ткань.
Учитывая клинические наблюдения и опыт нашей клиники, а также литературные данные по проблеме фотодинамической терапии, наиболее яркие и значимые изменения в опухоли в результате ФДТ происходят уже в первые минуты и часы после облучения лазером, а в последующие дни они носят неспецифический характер и представляют интерес с точки зрения интенсивности развития и нарастания некрозов опухоли. Кроме того, на клиническом этапе эксперимента мы также пришли к выводу, что забор материала для морфологического исследования с выведением животных из опыта необходимо проводить сразу же после облучения в течение первых суток. Именно в этот период в тканях происходят наиболее яркие изменения, обусловливающие в последующем гибель опухоли при фотодинамической терапии.
Анализ полученных результатов клинического и морфологического исследований в динамике в определенные периоды времени позволил выстроить экспериментально обоснованную хронологическую картину фото динамического повреждения опухоли. В патогенезе гибели опухоли после ФДТ нами выделено условно несколько периодов: период функциональных микроциркуляторных нарушений, переходный период, период необратимых изменений и формирования некроза, период отторжения опухолевого некроза и формирования рубца.
Итак, первый период, характеризуемый как период функциональных микроциркуляторных нарушений, длится около 1 часа с момента ФДТ. Первичный ответ на фотохимическое повреждение опухоли в результате ФДТ можно охарактеризовать как спазм сосудов микроциркуляторного русла. Так, уже в конце сеанса ФДТ в основной группе животных-опухоленосителей поверхность опухоли, как правило, становилась бледной (ишемичной), что свидетельствует о нарушении кровообращения. Кожа над опухолью имела «стекловидно» белый цвет с четкими контурами и еле выраженным валиком гиперемии на границе со здоровой тканью. Такой вид опухоли сохранялся в течение часа с момента облучения (рисунок 5.1а).
