Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Клинико-морфологические особенности стромальных опухолей ЖКТ 9
1.1.1. Клиническая характеристика стромальных опухолей ЖКТ 10
1.1.2. Морфологическая характеристика стромальных опухолей ЖКТ 14
1.1.3. Иммуногистохимическаяхарактеристиха стромальных опухолей ЖКТ 18
1.1.4. Оценка риска злокачественности и прогностические факторы стромальных опухолей ЖКТ 24
1.2. Молекулярный патогенез стромальных опухолей ЖКТ 28
1.2.1. Общая характеристика мутаций генов c-Kit и PDGFRA 33
1.2.2. Первичные мутации гена c-Kit в стромальных опухолях ЖКТ 36
1.2.3. Первичные мутации гена PDGFRA в стромальных опухолях ЖКТ 41
1.3. Мутации и клинико-морфологические характеристики стромальных опухолей ЖКТ 44
1.4. Лечение стромальных опухолей ЖКТ 45
2. Материалы и методы 47
2.1. Общая характеристика материала 47
2.2. Методы исследования 49
2.2.1. Иммуногистохимическое исследование 49
2.2.2. Микродиссекция парафиновых срезов стромальных опухолей ЖКТ и выделение ДНК 52
2.2.3. Выделение геномной ДНК из операционных опухолевой ткани 53
2.2.4. Анализ мутаций в генах c-Kit и PDGFRA в стромальных опухолях ЖКТ 53
2.2.5. Разделение ПЦР-продуктов методом электрофореза в агарозном геле 56
2.2.6. Очистка ПЦР-продуктов для секвенирования 56
2.2.7. Анализ результатов прямого секвенирования 57
2.2.8. Статистическая обработка данных 57
2.2.9. Список используемых растворов 58
3. Результаты собственных исследований 59
3.1. Клинико-морфологическая характеристика GIST 59
3.2. Иммуногистохимическая характеристика стромальных опухолей ЖКТ74
3.3. Мутационный статус стромальных опухолей ЖКТ 80
3.3.1. Мутации гена c-Kit 80
3.3.2. Мутации гена PDGFRA 99
3.3.3. Стромальные опухоли ЖКТ дикого типа 101
4. Сопоставление молекулярно-генетических и клинико-морфологических параметров GIST 101
5. Обсуждение полученных результатов 116
Выводы 119
Список используемой литературы 121
- Морфологическая характеристика стромальных опухолей ЖКТ
- Молекулярный патогенез стромальных опухолей ЖКТ
- Микродиссекция парафиновых срезов стромальных опухолей ЖКТ и выделение ДНК
- Мутационный статус стромальных опухолей ЖКТ
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Опухоли характеризуются большим спектром генетических нарушений. Среди генетических событий, приводящих к злокачественным новообразованиям, наиболее частыми и удобными для диагностики являются соматические мутации. Примером того, что мутационный анализ важен для диагностики, прогноза и терапии опухолей являются стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта или GIST (gastrointestinal stromal tumors). Почти одновременное открытие мутаций в онкогенах, кодирующих тирозинкиназные рецепторы KIT и PDGFRa, и создание ингибиторов тирозинкиназ привели к значительным успехам в понимании биологии этих опухолей и разработке терапии на основе новых молекулярно-направленных препаратов.
Гастроинтестинальные стромальные опухоли – наиболее распространенная группа мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта (15-20 случаев на миллион жителей). Они выделены в отдельную нозологию в 2000г. на основании молекулярно-генетической особенности – активации экспрессии гена c-Kit за счет мутации. Иммуногистохимически стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) отличаются от других сарком ЖКТ высокой экспрессией маркера CD117, который представляет собой рецептор фактора роста стволовых клеток - тирозинкиназу KIT. GIST возникают в разных отделах желудочно-кишечного тракта из предшественников интерстициальных клеток Кахаля, регулирующих перистальтику.
Стромальные опухоли ЖКТ чрезвычайно гетерогенны по клинико-морфологическим характеристикам: локализации, размеру, гистологическому типу клеток, пролиферативной активности и уровню злокачественности. Они также различаются по типу и локализации мутации: до 80% стромальных опухолей ЖКТ имеют активирующую мутацию в одном из экзонов гена c-Kit (экзоны 9, 11, 13 и 17), 5-7% – в близкородственном гене PDGFRA (экзоны 12, 14 и 18), кодирующем -рецептор тромбоцитарного фактора роста и 10-15% GIST содержат c-Kit и PDGFRA дикого типа. Большой интерес вызывает сравнение типа и положения мутации с локализацией, морфологическим типом клеток и степенью злокачественности GIST. Важно отметить, что определение мутации может иметь диагностическое значение, так как некоторые опухоли экспрессируют CD117, но не являются GIST, тогда как есть стромальные опухоли ЖКТ, экспрессирующие CD117, но не содержащие мутации c-Kit.
Основным видом лечения GIST является хирургическое удаление опухоли, однако у половины больных в течение 5 лет появляются рецидивы или метастазы. Интерес к стромальным опухолям ЖКТ возрос после того, как появились успехи в лечении их ингибиторами тирозинкиназ. Ответ GIST на молекулярно-направленную (таргетную) терапию зависит от типа мутации. Иматиниб мезилат (гливек, Novartis) - препарат первой линии лечения неоперабельных и метастатических GIST, с 2009г. рекомендован для адьювантной терапии. Наиболее чувствительны к нему опухоли с мутациями в 11 экзоне гена с-Kit, для лечения стромальных опухолей тонкой кишки с мутацией 9 экзона требуется двойная доза иматиниба, а GIST с мутацией рецептора PDGFRa (D842V) – нечувствительны к иматинибу. В случаях, когда иматиниб не эффективен, целесообразно назначение сунитиниб малата (сутент, Sugen) для больных с мутацией в 9 или 13 экзоне с-Kit либо с-Kit дикого типа, или нилотиниба (тасигна, Novartis) для GIST с мутацией в 13 или 17 экзоне с-Kit.
Таким образом, определение мутации в генах c-Kit и PDGFRA необходимо для определения индивидуальной чувствительности пациента к терапии таргетными препаратами. Особый интерес представляет сопоставление данных молекулярно-генетического анализа с клинико-морфологическими характеристиками GIST для определения прогностической значимости мутаций рецепторов. В России подобные исследования не проводились.
Цели и задачи исследования.
Целью работы является анализ мутаций генов c-Kit и PDGFRA в стромальных опухолях желудочно-кишечного тракта и сопоставление генетических и клинико-морфологических данных для оптимизации условий выбора препарата таргетной терапии и определения прогностической значимости мутаций.
В соответствии с целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Создать банк образцов стромальных опухолей ЖКТ (парафиновые блоки, свежезамороженные операционные биопсии).
-
Исследовать клинико-морфологические и иммуногистохимические характеристики стромальных опухолей ЖКТ.
-
Провести анализ мутаций 9, 11, 13 и 17 экзонов гена c-Kit.
-
Провести анализ мутаций 12, 14 и 18 экзонов гена PDGFRA.
-
Сопоставить молекулярно-генетические данные (тип и частота мутаций c-Kit и PDGFRA) с клинико-морфологическими характеристиками стромальных опухолей ЖКТ для определения индивидуальной чувствительности к таргетной терапии.
-
На основании анализа молекулярно-генетических данных и клинико-морфологических характеристик оценить диагностическую и прогностическую значимость мутаций c-Kit и PDGFRA в стромальных опухолях ЖКТ.
Научная новизна.
Выявлены клинико-морфологические особенности стромальных опухолей ЖКТ в России: преобладание стромальных опухолей у женщин, высокая частота опухолей с эпителиоидным и смешанным типом клеточного строения.
Впервые получены данные о частоте мутаций генов с-Kit и PDGFRA у российских больных стромальными опухолями ЖКТ. Обнаружена высокая частота стромальных опухолей ЖКТ имеющих мутации PDGFRA, при том, что редки мутации D842V в 18 экзоне PDGFRA, низкая частота стромальных опухолей ЖКТ с точечными заменами в 11 экзоне с-Kit. Выявлены новые (в 11 и 13 экзонах с-Kit) и редкие мутации (в 10 интроне – 11 экзоне c-Kit, в 17 экзоне c-Kit). При сопоставлении результатов молекулярно-генетического анализа с клинико-морфологическими данными показано, что существует корреляция в типе и частоте мутации с особенностями морфологии опухоли и клиническим течением заболевания.
Впервые в России проведена оценка выживаемости больных GIST в зависимости от степени злокачественности опухоли, от локализации опухоли и типа мутации до применения таргетной терапии иматинибом. Впервые проведен анализ вторичных мутаций, вызванных терапией иматинибом. Получены убедительные данные, что тип и локализация мутации могут быть важным параметром для определения индивидуальной чувствительности к таргетной терапии, а также для прогноза стромальных опухолей ЖКТ.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты анализа мутаций генов с-Kit и PDGFRА были использованы при дифференциальной диагностике мезенхимальных опухолей ЖКТ и при назначении больным стромальными опухолями ЖКТ препаратов молекулярно-направленной терапии (иматиниб, сунитиниб) в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и других клиниках.
Оценена прогностическая значимость различных клинико-морфологических и иммуногистохимических параметров GIST. Впервые в России на основе молекулярно-генетического анализа мутаций и сопоставления их с клинико-морфологическими данными показана связь клинических и генетических параметров с прогнозом заболевания GIST. Изучена прогностическая значимость мутаций до применения тирозинкиназных ингибиторов, что может быть важно при назначении адьювантной терапии.
Апробация работы.
Диссертационная работа была апробирована 17 сентября 2009 года на совместной научной конференции лабораторий онкогеномики, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях и доложены на заседании Общества патологоанатомов г. Москвы (18 ноября 2010), на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 16 апреля 2010г), на Международном конгрессе «Диагностика и лечение онкологических заболеваний пищеварительной системы» (Казань, 24-26 июня 2010г). По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, включая 28 таблиц, 52 рисунка и список литературы (164 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов).
Морфологическая характеристика стромальных опухолей ЖКТ
Большинство гастроинтестинальных стромальных опухолей отличаются мономорфным строением, гистологически напоминают гладкомышечные опухоли и соответствуют веретеноклеточному (70% опухолей), эпителиоидно-клеточному (20%) или смешанному (10%) гистологическим типам [Г, 4,7, 46, 104, 105, 107, 162]. В России опухоли с веретеноклеточным вариантом строения описаны в 51,7% случаев, эпитёлиоидно-клеточным — 10% случаев. Особо хочется подчеркнуть, что смешанный (веретеноклеточный и эпителиоидно-клеточный) тип опухолей встречается в 38,3%-опухолей [3]. В1 некоторых случаях (в основном при локализации в стенке тонкой кишки),гистологически опухоли напоминают параганглиому или карциноид [104]. ; Помимо трех основных типов стромальных опухолей ЖКТ, М: Miettinen и соавт. выделяют несколько их подтипов [104]: 1) склерозирующий веретеноклеточный - тонкие веретенообразные клетки; расположенные плотно или рыхло среди обширных зон коллагеноза, с низкой клеточностью и с низкой- митотической, активностью; 2) вакуолизированный веретеноклеточный с образованием палисадообразных структур - веретенообразные клетки со слабой атипией ядер, формирующие палисадные структуры и содержащие перинуклеарные вакуоли; 3) клеточный веретеноклеточный - плотно расположенные веретенообразные клетки, образующие хаотичные переплетающиеся пучки и палисадные структуры; умеренная атипия ядер; наличие перинуклеарных вакуолей; митотическая активность невысокая; 4) саркоматоидный веретеноклеточный - характеризующиеся веретенообразными или овальными клетками, с высокой клеточностью и выраженной атипией ядер, располагающиеся беспорядочно или образующие переплетающиеся пучки, с зонами миксоматоза; с высокой митотической активностью; 5) склерозирующий эпителиоидно-клеточный с синцитиоподобными структурами - однотипные клетки небольших размеров расположенные в коллагеновом матриксе, округлой или полигональной формы, без выраженной цитоплазмотической мембраны; с единичными многоядерными гигантскими клеточными формами; с низкой митотической активностью; 6) эпителиоидно-клеточный без синцитиоподобных структур -большие полигональные клетки с обильной цитоплазмой и с четкими цитоплазматическими мембранами; расположенные в скудном интерстициальном матриксе; встречаются1 гигантские клетки; низкая митотическая активность; 7) клеточный эпителиоидно-клеточный - крупные полигональные эпителиоидные клетки с умеренно-выраженной атипией; строго очерченные границы клеток; ядерная атипия; ядерно-цитоплазматический уровень выше, чем в эпителиоидных опухолях с гнездной структурой; 8) саркоматоидный эпителиоидно-клеточный - клетки от эпителиоидных до округлых; четкие клеточные границы; высокий ядерно-цитоплазматический уровень; однообразные4 ядра, часто очень заметные (выпуклые); высокая митотическая активность. По данным И.А. Казанцевой [4], для стромальных опухолей ЖКТ типичны следующие гистологические структуры:- пучковые, палисадообразные, органоидные (клеточные- гнезда), альвеолярные, диффузные, миксоидные и воспалительные.
Основные типы опухолевых клеток: веретенообразные, эпителиоидные, плазмоцитоидные, миксоидные, перстневидные, зернистые и многоядерные. Гастроинтестинальные стромальные опухоли веретеноклеточного. типа обычно представлены мономорфными, вытянутой формы, клетками, собранными в короткие пучки или закрученные в. петли (whorls). Палисадообразные структуры чаще встречаются, при веретеноклеточных, реже при эпителиоидно-клеточных типах GIST. Опухолевые клетки имеют эозинофильную цитоплазму, причем окрашенную бледнее, чем у клеток гладкомышечных опухолей. -Ядра опухолевых клеток чаще мономорфны и более овоидные или короткие по сравнению с ядрами гладкомышечных клеток, нередко с вакуолизированным хроматином. Перинуклеарные цитоплазматические вакуоли встречаются, по данным разных авторов, в 5-50% случаев, в основном в GIST желудка, что может имитировать гладкомышечную дифференцировку опухоли. В некоторых случаях вакуолизация цитоплазмы опухолевых клеток ведет к необходимости проведения дифференциальной диагностики с липосаркомой [2, 4, 46, 104, 162]. Стромальные опухоли ЖКТ эпителиоидно-клеточного типа построены из округлых клеток с эозинофильной или прозрачной цитоплазмой. В клетках опухолей со слабоэозинофильной, прозрачной цитоплазмой, часто видны цитоплазматические включения, которые могут располагаться вокруг ядра или рядом с ним. Ядра клеток обычно мономорфны, округлой или овальной формы, с везикулярным хроматином. Эпителиоидно-клеточные опухоли чаще характеризуются гнездной архитектоникой, что отличает их от веретеноклеточных стромальных опухолей ЖКТ и иногда делает гистологически сходными с эпителиальными меланоцитарными новообразованиями [4, 46, 104, ПО, 162]. В. стромальных опухолях ЖКТ смешанного типа обычно наблюдается четкий переход между участками эпителиоидно-клеточного и веретеноклеточного строения, однако в некоторых случаях опухоли представлены клетками, имеющими» черты как эпителиоидных, так и веретеновидных [4, 46, 104,Л10, Г62}. Для гастроинтестинальных1 стромальньгх опухолей- типичны множественные тонкостенные сосуды, и часто обнаруживаются кровоизлияния.
Примерно 5% опухолей имеют разной степени выраженности миксоидную- строму. Лимфоидная инфильтрация стромы может быть выраженной, особенно вокруг очагов некроза, миксоидных изменений. Примерно в 10-20% случаев в строме веретеноклеточных и эпителиоидно-клеточных стромальных опухолей ЖКТ, особенно тонкой кишки, выявляются так называемые скеноидные волокна», (skeinoid fibers). Это гиалиноподобные и фибриллярные, слабоэозинофильныё структуры из переплетенных в виде узелков .и глобул коллагеновых волокон [4\ 46, 104, 110,-162]. По данным М. Miettinen- и соавт. [104], клеточная атипия определяется в отдельных участках опухоли в, большинстве GIST и особенно выражена при их эпителиоидно-клеточных вариантах. Многоядерные клетки также характерны для эпителиоидно-клеточных стромальных новообразований ЖКТ. Митозы обычно типичные, атипичные митозы встречаются преимущественно в митотически активных опухолях. Очаги коагуляционного, (сухого) некроза выявляются примерно в 1/5 стромальных опухолей ЖКТ, при- этом половина опухолей с такими очагами диагностируются как саркоматоидные подтипы. Наблюдаются также очаги колликвационного (влажного или истинного) некроза, кисты, содержащие жидкость, элементы крови или рыхлый гиалиновый материал. Очаги кальциноза встречаются в 6% GIST, причем больше половины из них принадлежат склерозирующему веретеноклеточному и вакуолизированному веретеноклеточному подтипам с образованием палисадных структур. Органоидное строение встречается нечасто и характерно для эпителиоидно-клеточного варианта стромальных опухолей ЖКТ, причем не имеет прогностического значения [4, 46, 104, 110, 162]: Изъязвление слизистой оболочки желудка или кишечника наблюдается при всех подтипах гастроинтестинальных стромальных опухолей. Возможно изъязвление самой опухоли или слизистой оболочки над ней. Инвазия слизистой оболочки наблюдается достаточно редко и характерна для саркоматоидных стромальных новообразований с плохим прогнозом. Инвазия в мышечную пластинку слизистой оболочки более типична и не имеет прогностического значения [4, 46, 104, 110, 162].
Молекулярный патогенез стромальных опухолей ЖКТ
В начале: 1998г: S.Hirota; и соавторы опубликовали данные об экспрессии, антигена CD И 7 в 46 из 49 стромальных опухолей, и в, пяти из шести» опухолей они нашли мутации гена c-Kit, кодирующего рецепторную тирозинкиназу [60]. Это= явилось важным открытием для дальнейшего изучения; и определения патогенеза этих новообразований и послужило основой выделения их в отдельную нозологическую группу. Исследования других лабораторий мира подтвердили, что 60-80% GIST содержат мутации гена c-Kit, эти мутации приводят к конститутивной активации киназы. и мутантная КГТ-тирозинкиназа является отличной терапевтической мишенью в стромальных новообразованиях желудочно-кишечного тракта для таргетных препаратов [26]. Белок ЮТ (молекулярная масса 145 kDa) является рецепторной тирозинкиназой III класса, в который включены PDGFRa и PDGFRP (рецепторы тромбоцитарного фактора роста а и Р), а также M-CSF1R (рецептор колониестимулирующего фактора 1 макрофагов) и FLT3 (F1 cytokine receptor) [26]. Геньъ c-Kit и PDGFRA картированы на хромосоме 4ql2 [131, 145]. Ген c-Kit человека имеет размер 89т.п.н. и состоит из 21 экзона [48, 153]. Гены c-Kit и PDGFRA кодируют высоко гомологичные трансмембранные гликопротеины.
Это семейство белков характеризуется специфической молекулярной структурой, содержащей внеклеточный домен (ЕС, extracellular domain) с пятью иммуноглобулиноподобными петлями, трансмембранный, участок, цитоплазматический домен с регуляторным подмембранным доменом (JM, juxtamembrane domain) и обширный тирозинкиназный домен (ТК). Последний разделяется на тирозинкиназный домен 1 (ТК1), содержащий аденозинтрифосфат-(АТР) - связывающий участок и тирозинкиназный домен 2 (ТК2) с фосфотрансферазным районом, которые разделены гидрофильной киназной вставкой KI (в случае КІТ, киназная вставка составляет 804аминокислот) [123]. В, результате альтернативного сплайсинга информационной РНК с-Kit человека образуются 4 изоформы, две из которых характеризуются наличием или отсутствием четырех аминокислотных остатков (Gly-Asn-Asn-Lys) во внеклеточной части мембранного домена [31, 130]. Кроме того, существуют варианты сплайсинга, которые отличаются наличием или отсутствием единичного остатка серина в. гидрофильной киназной вставке белка KIT человека [130]. В норме KIT и PDGFRa активируются- их лигандами: фактором роста стволовых клеток (stem cell factor, SCF) и факторами роста тромбоцитов (platelet-derived growth factor, PDGFs), соответственно. Лиганд SCF экспрессируется как гликозилированный трансмембраный белок. Альтернативный сплайсинг приводит к двум изоформам SCF, которые отличаются наличием или отсутствием особого протеолитического сайта расщепления. (31 и 18,5 kDa, соответственно) [66]. Изоформа; содержащая .сайт расщепления, подвергается протеолизу и становится, свободной-в растворимой; форме в плазматической", мембране, тогда как изоформа- с отсутствием сайта расщепления1 остается ассоциированной с клеткой.
Интересно; что две изоформы имеют различные способности к передаче- сигналов. Связывание белка- KIT с растворимой изоформой лиганда SCF приводит к быстрой и кратковременной активации, и аутофосфорилированию белка KIT и его быстрой деградации, тогда как. связывание KIT с изоформой SCF, ассоциированной с мембраной, приводит к более длительной активации тирозинкиназы KIT [111]. Связывание лиганда с рецепторным» внеклеточным доменом (ЕС) приводит к димеризации. рецепторов и фосфорилированику тирозинов в цитоплазматических доменах белков. Вследствие- этого происходит фосфорилирование каскада тирозиновых остатков-во многих низлежащих сигнальных молекулах и активации сигнальных путей, включая Ras/MAP-киназы, Ras/Rho-JNK, PI3K/AKT и SFK/STAT сигнальные пути [42] . Тирозинкиназная активность белка КІТ ингибируется подмембранным доменом (экзон 11) в отсутствии лиганда KIT [112]. Активация KIT регулирует важные клеточные функции, такие как пролиферация, апоптоз, хемотаксис и адгезия, и является критической для развития и сохранения различных клеточных типов, которые включают гематопоэтические клетки, тучные клетки, меланоциты, гематоциты и интерстициальные клетки Кахала (ICC), пейсмекерные клетки, включенные в перистальтику желудочно-кишечного тракта и регуляцию автономной передачи нервных импульсов [14, 18, 67, 92, 98, 160, 163, 164].
Главные сигнальные пути, активированные KIT Связывание фактора стволовых клеток приводит к димеризации белков КІТ на клеточной поверхности (рис.1), активации их цитоплазматических доменов и фосфорилированию тирозиновых остатков. Фосфотирозиновые остатки образуют сайты для заякоривания белковых комплексов (SHC, GRB2, SOS), которые необходимы для активации RAS. RAS активирует МАР-киназный каскад (RAF, МЕК, ERK), приводящий к изменениям экспрессии генов и продвижению через G1 фазу к S-фазе клеточного цикла. STAT3 фосфорилирование посредством KIT также способствует изменениям в транскрипции генов. Активация фосфатидилинозитол 3- киназы (PI3K) приводит к превращению фосфатидилинозитол бифосфата (PIP2) в трифосфат (PIP3) форму, которая приводит к заякориванию PDK и АКТ на мембране. Фосфорилирование АКТ приводит к изменениям в белковой трансляции, в метаболизме и апоптозе через медиаторы S6 киназы и рапамицин. PTEN (опухолевый супрессор) является фосфатазой, которая переводит PIP3 обратно в PIP2 [26].
Микродиссекция парафиновых срезов стромальных опухолей ЖКТ и выделение ДНК
В 92 случаях GIST ДНК была получена из опухолевых клеток, собранных со срезов (микродиссекция). Для проведения микродиссекции в отделении патологической, анатомии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН с каждого парафинового блока делали 2-3 серийных среза толщиной 5 мкм. Срезы помещали на предметные стёкла, подвергали депарафинизации и регидратации. Референсный срез, опухоли, окрашенный гематоксилин-эозином, был охарактеризован в.н.с. к.м.н. Ануровой 0.А.: проведена верификация и локализация опухолевых очагов и участков нормальной ткани, дана характеристика морфологического типа клеток и злокачественности опухоли (количество митозов в 50 полях зрения, наличие некроза, полиморфизм?и др.) Микродиссекцию срезов, подкрашенных гематоксилином, проводили в соответствии с референсным» препаратом. Дшгэтого с 5 мкм-срезов под микроскопом стерильным, скальпелем соскребали участок клеток опухоли, который помещали в буфер состава: 0,01М Tris-HCl, 0,5% Tween 20, протеиназа К (250мкг/мл) (18 Ед.ак./мг, Sigma), и инкубировали при 55С в течение ночи. Фермент инактивировали денатурацией, в твердотельном термостате «Термит» (ДНК-технология, Россия)-при 95С 10 мин. Концентрацию выделенной ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Германия). Данный, прибор предназначен» для определения концентрации ДНК в небольших объемах (1-5 мкл) препаратов ДНК с концентрацией не менее-1нг/мкл. В 28 случаях ДНК была получена из опухолевой ткани, хранившейся в азоте. Образец опухолевой ткани ( 300мг), гомогенизировали до порошкообразного состояния в керамической ступке с жидким азотом. Гомогенизированную опухолевую ткань ресуспендировали в буфере состава: 50мМ Tris НС1 рН 8.0, 50мМ EDTA, 0,25% лаурилсаркозила и 500мкг/мкл протеиназы К (Хеликон). Компоненты перемешивали и инкубировали в течение ночи при +37С. Очистку ДНК проводили путём фенол-хлороформной экстракции [99].
После обработки протеиназой К к образцу добавляли равный объем фенола и перемешивали. Центрифугировали 10 мин. при 10000g. К супернатанту добавляли 1 объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1 об./об.). Перемешивали покачиванием 10 мин. и центрифугировали 10 мин. при 10000g. Для осаждения ДНК к водной фазе добавляли 1/10 объёма ЗМ ацетата натрия (рН 5,2) и 2 объёма 96% этанола. Перемешивали покачиванием. После появления «медузы» центрифугировали 10 мин. при 12000g, отбирали спирт и выпаривали оставшийся спирт при 37С. Растворяли ДНК в 50-100 мкл ТЕ-буфера (рН 7,4) состава: ЮмМ Tris-HOl рН 7,4, 1мМ ЭДТА рН 8,0. Определение мутаций в генах c-Kit и PDGFRA проводили с помощью метода ПЦР. Праймеры подбирали с помощью нуклеотидной последовательности гена и мРНК генов c-Kit и PDGFRA, программы OLIGO 6.0. Основные характеристики праймеров приведены в табл. 7. Для анализа мутаций 11 экзона гена c-Kit в образцах ДНК, выделенных из операционных биопсий, использовали- праймеры, образующие ПЦР-продукт размером 295п.о. Анализ ДНК, полученной при микродиссекции парафиновых срезов- GIST, проводили с праймерами, образующими короткий ПНР - продукт размером до 200 п.о. Обработка тканей GIST органическими растворителями (формалин, ксилол) при фиксации и регидратации часто вызывает образование сшивок, фрагментацию ДНК, что делает затруднительным получение ПЦР-продукта, размером свыше 250п.о. Реакционная смесь для ПЦР содержала: бОмМ TrisHCl рН 8.8, 16мМ (N[4)2804, 0,1% Tween-20, 10% глицерина, 0,2мМ каждого нуклеозидтрифосфата, 0,6 мкМ каждого праймера, 2 ед.
Taq-полимеразы и ЮОнгДНК. Параметры температурного цикла ПЦР: начальная денатурация 4 мин. при 94С; 40 циклов - денатурация ПЦР продукта 30с. при 94С, отжиг праймеров в течение 30с. при температуре согласно Табл.3, элонгация 45с. при 72С; терминальная элонгация при 72С в течение 10 мин. Реакция проводилась в тонкостенных пробирках для ПЦР на амплификаторе «Терник 1» (НПФ ДНК-Технология, Россия) и MJ Mini (BioRad, США). Для отрицательного контроля использовали бидистиллированную воду; в качестве положительного контроля использовали препарат ДНК, выделенный ранее из замороженного в жидком азоте операционного образца GIST. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ІхТАЕ) в течение ЗОмин. с постоянной силой тока 3-5 V/см". Агарозный гель следующего состава готовили ex tempore: агароза (Хеликон), 10 мг/мл бромистого этидия [99], трис-ацетатный буфер (їх ТАЕ). Продукты амплификации ДНК сканировали при ультрафиолетовом освещении с использованием системы документирования гелей «Gel Imager» (Россия). Результаты электрофореза обрабатывали,в программе Adobe Photoshop 9.0. 2.2.6. Очистка ПЦР-продуктов для секвенирования Продукты ПЦР очищали методом переосаждения спиртом, согласно методике описанной ранее [99]. 20 мкл ПЦР инкубировали при комнатной температуре 20мин. в ЮОмкл буфера следующего состава: 0Д25М, ацетата аммония, ,70% этанол. Центрифугировали при 14000g в течение 20 мин. при комнатной температуре. Осадок промывали 250-500мкл охлаждённым до -20С 70% этанолом и высушили в термостате при 37С или вакуумной центрифуге SpeedVac (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Мутационный статус стромальных опухолей ЖКТ
В работе проведен анализ:мутаций в 9, 11,. 13 и 1-7 экзонах гена c-Kit в, ДНК из 120 стромальньїхі опухолей ЖКТ методом ПЦР: Поскольку в GIST наиболее распространены мутации в 11 экзоне гена- с-Кії, все препараты опухолевой ДНК сначала тестировали на эти мутации: В; случае отсутствия мутаций вії экзоне c-Kit опухоли тонкой кишки тестировали на мутации в 9 экзоне c-Kit, а опухоли желудка - на мутации в 18 экзоне PDGFRA, затем - на мутации в 17 и 13 экзонах c-Kit, а также в 14 и 12 экзонах PDGFRA. Для анализа мутаций в 11 экзоне гена c-Kit в ДНК из замороженных операционных биопсий использовали праймеры, образующие ПЦР-продукт размером 316 п.н. На рис. 27 представлено электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов 11 экзона гена c-Kit размером 316 п.н., полученных при амплификации ДНК, выделенной из свежезамороженных опухолевых биопсий GIST #105, 106. Обработка тканей стромальных опухолей ЖКТ органическими растворителями (формалин, ксилол) при фиксации и регидратации часто повреждает ДНК, что делает невозможным получение ПЦР-продукта, превышающего 250 п.н. Поэтому для анализа ДНК, полученной при микродиссекции парафиновых срезов, мы использовали праймеры, образующие короткий ПЦР-продукт размером 195 и/или 150 п.н. Исследование проводилось в два этапа с постановкой Nested -ПНР (см. главу 2). В случае отсутствия ПЦР-продукта после первого раунда ПЦР, проводилась постановка второго раунда ПЦР с внутренними праймерами, позволяющими получить более короткий продукт.
Так как праймеры располагались в зоне исследуемого экзона, то получали два коротких продукта, которые частично перекрывали друг друга. Таким образом, секвенирование проводилось двух ПЦР-продуктов к одному экзону в двух направлениях. На рис. 28 представлены результаты разделения ПЦР-продуктов 11 экзона гена c-Kit размером 190 п.н., полученных при амплификации опухолевой ДНК, выделенной при микродиссекции депарафинизированных срезов опухолевых биопсий GIST № 135, 141. Рисунок 29. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов 11 экзона гена c-Kit Обозначения: +К - положительный контроль;- К - отрицательный контроль; М - маркер; Е - пустой трек; 153, 196, 198 - ПЦР-продукты образцов ДНК #153, 196 и 198. Параметрический файл секвенирования преобразовывался в графическую форму с помощью программного обеспечения (Vector NTI). Вследствие делеции 6 нуклеотидов (GGAAGG) в одном аллеле происходит наложение последовательности мутантного аллеля на последовательность второго нормального аллеля и появление гетерогенного сигнала (участок Б). В результате делеции GGAAGG происходит делеция аминокислот на белковом уровне в положении W557 - К558 (Тгр 557- Lys 558) в экзоне 11 гена c-Kit. Среди образцов с мутациями гена c-Kit, нарушения в 11 экзоне обнаружены в 84,2% (101/120) стромальных опухолей ЖКТ. Мутации 9 экзона выявлены в 12,5% (15/120). Также обнаружены редкие первичные мутации в 13 и 17 экзонах гена c-Kit. Мутации представляли собой делеции, замены, дупликации и вставки. Делении в 11 экзоне гена c-Kit Делеции являются наиболее частыми мутациями 11 экзона в стромальных опухолях ЖКТ различной локализации.
В частности они обнаружены примерно в 60% опухолей желудка и толстой кишки ив 91% опухолей тонкой кишки. Дупликации 11 экзона гена c-Kit обнаружены преимущественно в опухолях желудка, что подтверждает данные литературы [78]. В нашем исследовании мутации 11 экзона гена c-Kit затрагивали кодоны с 550 по 586 (рис. 31) Как видно на рис. 31, мутации располагаются кластерами. Делеции 11 экзона гена c-Kit, кодирующего регуляторный домен белка, сосредоточены в основном в 5 -конце (группа А и группа Б) и в центральной части (группа В) экзона. Дупликации локализуются в 3 -конце 11 экзона (группа Г), что подтверждается данными литературы [28]. Миссенс-мутации расположены преимущественно в 5 -конце 11 экзона гена c-Kit. Наиболее часто делеции в 5 -конце 11 экзона затрагивали последовательность аминокислот 550-563, которая кодирует алифатическую а-спираль, подавляющую киназную активность рецептора КІТ в отсутствии лиганда. Чаще всего это короткие делеции без сдвига рамки считывания, а делеции со сдвигом рамки считывания сопровождались замещением аминокислоты. В эту область входят Val559 и Val560; которые стабилизируют гидрофобную часть белка KIT. АТуг553 проникает глубоко в поверхность и формирует водородные связи между гидроксогруппой?(-ОН) группой с его стороны цепи и Asp810 DFG мотива и Glu640 рецептора. В нашем исследовании делеции и делеции с заменой аминокислоты в 11 экзоне обнаружены в 50 случаях стромальных опухолей ЖКТ (табл. 18). При этом мы подразделяем группу А на подгруппы: первая подгруппа включает мутации, затрагивающие кодоны 557-559, и вторая подгруппа включает мутации, не затрагивающие кодоны 557-558. Группа Б включает в себя только мутации-двух кодонов 557-558: Мутацишэтих двух кодонов чаще встречаются в метастазирующих опухолях- с плохим прогнозом в отсутствии лечения иматинибом [156]. В, 25 случаях обнаружены делеции затрагивающие кодоны 557-559.
Опухоли с такими делециями преобладали у женщин в 64,0% (46/25) случаев и локализовались преимущественно в желудке — 60%(15/25), семь опухолей, локализовались в тонкой кишке; а также 3 опухоли обнаружены в толстой кишке. Опухоли были в основном крупного размера (от 10 до 36см), веретеноклеточного, или смешанного типа строения и высокой степени злокачественности. Интересен случай стромальной опухоли желудка, №105 размером 20см у мужчины 66 лет. В ДНК из операционной биопсии рецидива GIST желудка обнаружена делеция. (рис.32) в 11 экзоне гена c-K.it, которая начинается-в 10 интроне и захватывает 550-558 нуклеотидыЛ 1 экзона (Del 131440-131468 del К550-К558). Причем, при постановке ПЦР с ДНК первичной опухоли со среза, полученной путем микродиссекции, ПНР-продукт получен не был. Зона посадки праймера, позволяющего получить более короткий продукт была затронута делецией. У больного дважды возникали рецидивы и при последующей прогрессии обнаружены метастазы в печень и сальник. Стромальная опухоль имела смешанный фенотип и очень высокий митотический индекс: 25 митозов в 50 полях зрения при 400-кратном увеличении в первом рецидиве и 50 митозов в 50 полях зрения - во втором. В 9 случаях GIST (из них 7 опухолей возникли у женщин) обнаружены делеции и делеции с заменой только 557-558 кодонов в 5 -конце экзона 11, из них метастазы присутствовали в 5 случаях. В 16 случаях GIST обнаружены делеции, не затрагивающие 557-558 кодоны, которые встречались с равной частотой у мужчин и женщин, половина из них локализована в тонкой кишке (8/16). Такие новообразования имели веретеноклеточный (11 опухолей) или смешанный гистотип (5 опухолей). GIST с делениями 550-556 чаще располагались в тонкой кишке (8/14). Эти опухоли характеризовались преимущественно низкой митотической активностью, за исключением 2 случаев, где митотическая активность была 30 митозов в 50 полях зрения и 33 митоза в 10 полях зрения при 400-кратном увеличении.
Опухоли в тонкой кишке имели метастазы в 57% случаев. Также мы обнаружили крупные делеции в центральной части 11 экзона в районе сайтов аутофосфорилирования Y568, Y570 (563-578 положение на белковом уровне) в 7 случаях стромальных опухолей ЖКТ, причем важно, что такие мутации обнаружены в опухолях различной локализации и различных гистологических типов (табл. 20). Кроме того, в двух случаях опухоли содержали делеции 1-2 нуклеотидов, не затрагивающие сайтов аутофосфорилирования, в одном из них обнаружена деления в З -конце 581-582 с заменой К (Lys) на R (Arg) в 581 положении. В другой стромальной опухоли № 55 выявлена делеция изолейцина в 571 положении. Миссенс-мутации (точечные замены) в 11 экзоне гена c-Kit Миссенс-мутации или точечные замены в GIST встречаются во всех экзонах гена c-Kit, кроме девятого. Наиболее часто они присутствуют в 11 экзоне гена c-Kit. По данным литературы они затрагивают определенные кодоны - W557, V559 и V560 [81, 89, 136, 148]. Мы выявили однонуклеотидные замены на 5 - конце 11 экзона в 15 стромальных опухолях. На рис.31 представлен пример секвенирования ПЦР продукта 11 экзона образца GIST #148 с точечной заменой (миссенс-мутация). Как видно из рисунка в позиции гена c-Kit с двойным сигналом (пик красного
