Содержание к диссертации
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы. Молскулярио-биологичсские маркеры мстастазнрования и опухолевой прогрессии н их клиническая значимость при РТК 16
Современные представления о факторах мстастазнрования и прогноза
при РТК 16
Семейство кадхеринов и клиническая значимость Е-кадхерина при РПС...18
Семейство катенинов и клиническая значимость Р-катенина при РТК 22
Роль кадхерш I - катаппювого комплекса в регуляции опухолевой прогрессии...24
Молекулы семейства ССМ4 и клиническая значимость СС)44у6 при РТК..25
Матриксные металлопротеиназы и клиническая значимость ММР-2 и ММП-9 при РТК 30
Система активации плазминогена при РТК 36
Компоненты базальных мембран и клиническая значимость коллагена IV типа и ламинина при РТК 37
Супрессоры метастазирования и клиническая значимость белка пш23
при РТК 41
Факторы пролиферации и клиническая значимость РСЫА и Кл67 при РТК.. ..49
Белок р53 и его клиническая значимость при РТК 53
Белки системы Раз/ТаБЬ и их клиническая значимость при РТК....55
Белки семейства Вс1-2/Вах и их клиническая значимость при РТК.. ..57 Заключение 60
Общая характеристика клинических наблюдений и клинико-
морфологический анализ материала 62
Методы иммуногистохимического исследования 68
Методы электронно-микроскопического исследования 71
Методы биохимического исследования 72
Методы статистического анализа данных 75
Результаты собственных исследований
Глава 3. Система межклеточной и клеточно-матриксной адгезии
при РТК 83
3.1 Иммуногистохимические особенности содержания Е-кадхерина, р-катенина
и С044у6 в опухолях больных РТК 83
3.1.1. Особенности содержания молекул межклеточной адгезии в первич! гых АТК.83 3.12. Особенности содержаия молекул межклеточной адгезии в метастазах АТК..85
Связь содержания молекул межклеточной адгезии в опухоли с клинико-морфологическими признаками РТК. 87
Связь содержания молекул межклеточной адгезии в опухоли с развитием метастазов в печени и местных рецидивов РТК 90
Прогностическая значимость содержания молекул межклеточной адгезии в опухолях больных РТК 96
3.2. Ультраструктурные аспекты межклеточных взаимодействий в первичных и
метастатических АТК и особенности апикальной и базальной дифференцировки
раковых клеток 99
Глава 4. Внеклеточные протсолитичсские системы и компоненты
базальных мембран при РТК 104
Особенности содержания ММР-2 и ММР-9 в первичной опухоли и сыворотке крови больных РТК 104
Особенности содержания ММР-2 и ММР-9 в метастазах и местных рецидивах РТК 105
Связь содержания ММР-2 и ММР-9 в опухоли с клинико- морфологическими признаками и развитием метастазов в печени и местных рецидивов РТК 108
Прогностическая значимость содержания ММР-2 и ММР-9 в опухолях больных РТК 111
Особенности содержания ColllV и Lam в первичных АТК 114
Особенности содержания Coll IV и Lam в метастазах и местных
рецидивах РТК 115
Связь содержания белков в опухоли с клипико- морфологическими признаками и развитием метастазов в печени и местных рецидивов РТК 116
Ультраструктурные особенности базальных мембран в АТК и их метастазах 117
Прогностическая значимость содержания компонентов БМ в опухолях больных РТК 119
Сравнительное исследование содержания ММР-2, ММР-9, Coll IV, Lam и -cat и особенности экспрессии белков в зонах инвазивного фронта АТК.. 120
Глава 5. Иммуногистохимические особенности содержания белковых
маркеров nm 23 и с-егЬВ-2 в опухолях больных РТК 123
5.1. Экспрессия белка nm 23 в клетках АТК 123
5.1.1. Экспрессия белка nm 23 в первичных АТК и регионарных метастазах 123
Экспрессия белка nm 23 в отдаленных метастазах и местных рецидивах РТК. Сравнительное исследование содержания белка в первичных и
вторичных очагах поражения 124
Связь содержания белка nm 23 в опухолях больных РТК с клинико- морфологическими параметрами заболевания и наличием метастазов в печени и местных рецидивов РТК 128
Прогностическая значимость содержания белка nm 23 в опухолях больных РТК 131
5.2. Особенности содержания онкобелка с-егЬВ-2 в опухолях больных РТК 133
Экспрессия онкобелка с-егЬВ-2 в первичных АТК 133
Экспрессия онкобелка с-егЬВ-2 в метастазах и местных рецидивах РТК 134
Связь гиперэкспрессии онкобелка с-егЬВ-2 в опухоли с клинико- морфологическими признаками и развитием метастазов в печени
и местных рецидивов РТК 135
Прогностическая значимость пшерэкспрессии онкобелка с-егЬВ-2 в опухолях больных РТК 138
Заключение 140
Экспрессия PCNA и Ki67 в первичных АТК и их метастазах 142
Связь индексов пролиферации PCNA и Ki67 в опухоли с клинико- морфологическими особенностями и прогнозом течения РТК 147
Иммуногистохимические и биохимические факторы апоптоза при РТК...149
6.2.1. Иммуногистохимические особенности экспрессии белка р53 в
опухлоли и их связь с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом течения РТК 150
Иммуногистохимические особенности экспрессии белков Bcl-2 и Вах в опухоли и их связь с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом течения РТК 155
Биохимическое исследование содержания растворимого Fas- антигена в сыворотке крови больных РТК и его связи с клинико- морфологическими параметрами и распространенностью РТК....162
6.3. Электронно-микроскопический анализ дифференцировки раковых клеток
и ультраструктурные признаки апоптоза в первичных АТК и их
метастазах 166
Глава 7. Многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических и молекулярно-биологических
факторов при РТК 177
Заключение 181
Список литературы 214
Введение к работе
Актуальность темы.
РТК является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований человека, показатели заболеваемости и смертности от которого согласно статистическим данным последнего десятилетия неуклонном растут в России и экономически развитых странах мира [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2005; Барсуков Ю.А., Кныш В.И., 2006; Greenlee R.T. et al., 2000; Engstrom P.F., 2000]. Рак данной локализации занимает 2-е место в структуре женской онкологической заболеваемости после рака молочной железы и 3-е место в структуре мужской онкологической заболеваемости после рака предстательной железы и легкого [Engstrom P.F., 2000]. Ежегодно в мире регистрируется более 800 тысяч новых случаев РТК [Трапезников H.H., Аксель Е.М., 2000; Мартынюк В.В., 2000; Симонов H.H. и соавт., 2000; Parkin D.M. et al., 1999].
Поскольку самым грозным осложнением и основной причиной смерти больных злокачественными новообразованиями чаще всего являются отдаленные метастазы, изучение феномена метастазирования продолжает оставаться важной и актуальной задачей современной онкологии.
Инвазия и метастазирование — главные проявления прогрессии злокачественных новообразований человека, в том числе РТК. Известно, что более 30% больных РТК имеют клинически выявляемые метастазы на момент первичной диагностики [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002]. По данным ряда авторов, еще у 30-40% пациентов метастазы имеются в скрытом виде и проявляются в дальнейшем [Трапезников H.H., Аксель Е.М., 2001; Имянитов E.H., 2005]. I. Vogel и соавт. (2000) указывают, что циркулирующие в крови опухолевые клетки можно обнаружить у 40%, а микрометастазы в костном мозге - у 39% больных I—II стадиями рака ободочной кишки [Vogel I., Soeth Е.,
Ruder С. et al., 2000]. По некоторым данным, метастазы в печени выявляются у 55% больных РТК, подвергшихся радикальному удалению первичной опухоли [Патютко Ю.И. и соавт., 2001]. Это служит основанием для разработай дополнительных методов оценки метастатического потенциала раковых клеток и выявления групп риска для адыовантной терапии после радикального хирургического вмешательства с целыо улучшения отдаленных результатов лечения.
Основными параметрами, определяющими риск прогрессии РТК, остаются стадия заболевания (TNM) и степень дифференцировки опухоли. Классификация Dukes, отражающая глубину инвазии опухолью стенки ТК, также часто рассматривается как важный критерий послеоперационного прогноза заболевания [Baldus S.E., 2003; Baldus S.E., 2003; Yamada Н. et al., 2001; Piard F. et al., 2002]. Однако агрессивность опухолевого процесса не всегда определяется этими критериями. В настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии. Правильная оценка биологических факторов, коррелирующих с прогнозом заболевания и продолжительностью жизни пациентов, важна как при локализованных формах РТК, так и при наличии отдаленных метастазов опухоли [Aldrighetti L. et al., 2005; Ambiru S. et al., 1999].
Исследование особенностей биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем онкологии. Основой для выделения клинически значимых молекулярных факторов послужило открытие наблюдаемых в процессе развития и прогрессии опухоли структурных и функциональных изменения онкогенов и генов-супрессоров [Копнин Б.П., 2000; Vogelstein В. et al., 1988; Pasche В. et al., 2003]. Особенности экспрессии кодируемых этими генами белков могут выявляться иммуногистохимическими методами в клетках РТК и служить специфическими показателями биологической активности раковых клеток. Кроме того, расширяются возможности для биохимического определения растворимых рецепторов антигенов в сыворотке крови больных РТК и в ткани опухоли с помощью иммуноферментных методов [Kahlenberg M.S. et al., 2003; Davies R.J. et al., 2005].
Среди большого количества молекулярно-биологических показателей, которые могут влиять на клиническое течение РТК, особое место отводится поиску маркеров, прогнозирующих метастазирование [Forte А. et al., 2002; Yamada Н. et al., 2001; Davies R.J., et al., 2005;].
Большинство работ, посвященных изучению клинической значимости молекулярных маркеров при РТК, сосредоточено на факторах, ответственных за пролиферацию и апоптоз (Ki67, PCNA, р53, bcl-2, bax, Fas/FasL). Соотношение скорости клеточной пролиферации и активности индукторов и ингибиторов апоптоза обуславливает опухолевую прогрессию и влияет на развитие дополнительных компонентов зокачественного фенотипа клеток РТК [Houlston R.S. et al., 2001; Bendardaf R. et al., 2004; Arnold C.N., Blum H.E., 2005].
Не менее важными показателями профессии опухолевого роста являются молекулы, непосредственно влияющие на приобретение опухолевыми клетками высокой инвазивной способности [Ahmed F.E. et al., 2007; Muller W.et al., 1998; Sarris M., Lee C.S., 2001]. К формированию метастатического фенотипа клеток РТК приводит изменение активности таких факторов, как молекулы межклеточной адгезии (E-cad, -cat, CD44v6), ММР (ММР-2 и ММР- 9), компоненты система активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1), основные структуры БМ (Coll IV, Lam), белки nm 23 и c-erbB-2(Her-2/neu).
Особую значимость в оценке инвазивных способностей раковых клеток имеет определение уровня экспрессии молекул межклеточной адгезии, таких как E-cad, -cat и CD 44v6, роль которых в развитии метастазов РТК в печени изучена недостаточно [Wong N.A., Pignatelli V., 2002]. Редукция экспрессии Е- cad и последующее нарушение межклеточных связей, которые обеспечивают эти молекулы, способствует прогрессированию опухолевого процесса и свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания [Kaihara Т., et al.,
. -cat считается регулятором целого ряда процессов, влияющих на клеточную пролиферацию [Morin P.J., 1999]. Различные модели экспрессии Е- cad и Р-cat отражают особенности состояния адгезивного комплекса и могут иметь большое значение при оценке злокачественного потенциала РТК. CD44v6 является белком, который играет важную роль не только при взаимодействии клеток друг с другом, но и с ВКМ. Известно, что CD44v6 существенно влияет на инвазивный и метастатический потенциал клеток некоторых типов опухолей человека, однако данные о роли белка в опухолях ТК имеют противоречивый характер [Jungling В. et al., 2002; Bendardaf R. et al.,
. Большой интерес представляет изучение ферментов, способствующих деградации ВКМ, к которым относятся ММР-2 и ММР-9. Выработка раковыми клетками этих ферментов, влияющих на подвижность опухолевых клеток, лежит в основе инвазии и метастазирования и может служить показателем агрессивности опухоли. ММР не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов [Mysliwill A.G., Ornstein D.L., 2002; Waas Е.Т. et al., 2002]. Аналогичными свойствами обладают представители другого семейства протеолитических ферментов — сериновые протеазы и компоненты системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) [Gontero P. et al., 2004]. Основные белки БМ (Coll IV и Lam) являются не только структурным барьером для метастатического распространения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей в опухолевой прогрессии [Galbavy S. et al., 2002]. Данные о влиянии белка nm 23 на метастатическую активность РТК крайне противоречивы, однако, несомненно, что он является одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки [Bazan V. et al., 2002; Berney C.R. et al., 2001; Dursun A. et al., 2002]. Большое значение при оценке метастатического потенциала опухоли имеет суперэкспрессия онкобелка с- егЬВ-2. Установлено, что высокая экспрессия белка, в основном, связана с амплификацией гена c-erbB-2 и коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы. Существует предположение, что гиперэкспрессия белка может быть необходимым условием инвазии опухолевых клеток также и при РТК [Forte А., et al., 2002; Hayer J. et al., 2001; Lee J.C. et al., 2002]. Актуальным и перспективным направлением является возможность использования этих маркеров для прогнозирования течения опухолевого процесса и выявления больных РТК с высоким риском развития метастазов и раннего рецидива заболевания [Aldrighetti L, et al., 2005; Neal C.P. et al., 2006; Ahmed F.E., 2005].
Несмотря на то, что в последние годы накапливается все больше данных о нарушениях нормальной экспрессии и функционирования молекулярных факторов при РТК, их влияние на клиническое течение и прогноз заболевания изучено недостаточно. Многие вопросы, касающиеся корреляции клинико- морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе метастазирования РТК, нуждаются в уточнении. Необходимость поиска новых методов диагностики и более точного прогнозирования течения заболевания определяет актуальность изучения молекулярных критериев, обусловливающих инвазивно-метастатический фенотип РТК. Цель работы.
Изучение экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухолях и сыворотке крови больных РТК иммуногистохимическими, ультраструктурными и биохимическими методами с учетом основных клинико- морфологических характеристик опухоли и возможности использования этих показателей для оценки клинического течения болезни и прогноза развития метастазов.
Задачи исследования.
1. Изучить иммуногистохимические особенности экспрессии белковых маркеров в клетках первичных опухолей ТК и в прилежащей к опухоли слизистой оболочке ТК.
Исследовать особенности иммунофенотипа метастазов РТК в лимфатических узлах, печени и других органах, а также местных рецидивов опухолей.
Провести сравнительный анализ особенностей иммунофенотипа первичных и метастатических опухолей ТК и выявить их взаимосвязь с основными клинико-морфологическими параметрами заболевания.
Определить клиническую роль особенностей экспрессии маркеров в первичных опухолях и их метастазах при оценке прогноза заболевания.
Провести иммуноферментное определение ряда молекулярно- биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных РТК и изучить корреляцию биохимических показателей с клинико-морфологическими параметрами РТК.
Выявить ультраструктурные маркеры клеток РТК в первичных опухолях и их метастазах в лимфатических узлах и печени.
Провести статистическую обработку данных и определить на основании анализа результатов исследования наиболее значимые прогностические показатели.
Научная новизна.
Новый подход к диагностике и прогнозированию клинического течения РТК основан на использовании показателей экспрессии молекулярно- биологических маркеров, определяющих инвазивно-метастатический потенциал опухолевых клеток. Впервые проведен комплексный клинико- морфологический, иммуногистохимический, ультраструктурный и биохимический анализ целого ряда современных молекулярных факторов, таких как молекулы межклеточной адгезии, компоненты ВКМ, белки- супрессоры метастазирования, факторы апоптоза, маркеры пролнферативной активности. Показана четкая взаимосвязь экспрессии ряда белков с развитием метастазов и рецидивов РТК и, как следствие, возможность использования данных маркеров для уточнения диагноза и прогноза выживаемости. На основании исследования молекулярных характеристик РТК разработаны фенотипические критерии, позволяющие идентифицировать случаи РТК с повышенным риском развития отдаленных метастазов. Молекулярные маркеры, изученные в ткани первичных опухолей ТК и в отдаленных метастазах в печени, позволили оценить факторы прогноза РТК не только после проведенного хирургического удаления первичной опухоли, но и после резекции печени по поводу метастазов. Впервые при РТК изучена корреляция между экспрессией супрессоров метастазирования, белков межклеточных контактов и БМ и активностью протеолитических ферментов и компонентов системы активации плазминогена. Изучение экспрессии белковых маркеров в первичных опухолях и метастазах РТК позволило уточнить некоторые механизмы, обеспечивающие метастазирование опухолевых клеток. Практическая значимость.
Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза больных РТК и выделения групп повышенного риска развития метастазов и рецидивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динамического наблюдения. Проведенное исследование позволило на основании полученных данных выделить наиболее надежные признаки повышенного риска отдаленного метастазирования РТК, которые могут использоваться для индивидуального прогнозирования течения заболевания у больных РТК. Принадлежность пациента по результатам оценки экспрессии маркеров к группе неблагоприятного прогноза позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях РТК.
На основе анализа молекулярных особенностей опухоли определены прогностические критерии для оценки предрасположенности больных РТК к развитию метастазов с использованием иммуногистохимических, электронно- микроскопических и биохимических методов. Результаты исследования будут внедрены в клиническую практику в НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены и обсуждены на III конференции Российского общества патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии» (Москва, 15-17 сентября 2003г.), на III съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004г.), на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004г.), на научно-практическом симпозиуме «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина» (Москва, 20-22 октября 2004г.), на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 30 мая - 2 июня 2005г.), на III (VII) Съезде научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 11-14 октября 2005г.), на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.).
Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием научных сотрудников патологоанатомического отделения, лаборатории гистохимии и электронной микроскопии, лаборатории клинической цитологии, лаборатории молекулярной патологии, лаборатории клинической биохимии, отделения проктологии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 13 июня 2007г. Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 35 научных работ. Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 240 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 31 таблицей и 42 рисунками и микрофотографиями. Указатель литературы содержит 338 работ отечественных и зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Молекулярно-биологические маркеры метастазирования и прогноза при раке толстой кишки
![Тактические аспекты комплексного лечения распространенного рака прямой кишки [Электронный ресурс]](/i/i/4442/175205.png "Тактические аспекты комплексного лечения распространенного рака прямой кишки [Электронный ресурс] Смирнов Владимир Владимирович")
![Оптимизация хирургического лечения рака ободочной кишки [Электронный ресурс]](/i/i/4466/193514.png "Оптимизация хирургического лечения рака ободочной кишки [Электронный ресурс] Булатов Ильдар Халяфович")
![Пути улучшения функциональный результатов лечения больных раком прямой кишки [Электронный ресурс]](/i/i/4716/195487.png "Пути улучшения функциональный результатов лечения больных раком прямой кишки [Электронный ресурс] Мягков Роман Евгеньевич")