Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Современные концепции формирования септических состояний и полиорганной недостаточности 12
1.2. Молекулярные основы патофизиология сепсиса и полиорганной недостаточности 17
1.2.1. Начальные клеточные события врожденного иммунитета:
сигнализация 17
1.2.2. Процесс внутриклеточного воспаления 19
1.3. Цитокиновая регуляция при сепсисе 21
1.4. Экстракорпоральные методы детоксикации при сепсисе 27
1.4.1. Классификация методов экстракорпоральной детоксикации 27
1.4.2. ЭКД в комплексе интенсивной терапии больных с органной и полиорганной недостаточностью 29
1.4.3. Элиминация цитокинов при ЭКД 32
1.4.4. Элиминация средне- и крупномолекулярных белковых фракций при ЭКД 34
Глава II. Методы исследования 38
2.1.Общая характеристика больных 38
2.4. Технические аспекты применения ЭКД 41
2.4.1. Аппаратура и расходные материалы 41
2.4.2. Сосудистые доступы 42
2.2. Материалы и методы 43
2.2.1 Подготовка образцов биологических жидкостей 43
2.2.2. Получение экзогенного цитокина 43
2.2.3. ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ 44
2.2.4. Подготовка ультрафильтрата к выделению белков 45
2.2.5. Одномерный электрофорез 46
2.2.6. Идентификация белков 46
Глава III. Результаты 47
3.1. Потери белков при проведении гемофильтрации (ГФ) 47
3.2. Потеря белков при проведении ГФ онкологическим больным с послеоперационный септическими осложнениями 50
3.3. MALDI-TOF масс-спектрометрическое определение белков, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с послеоперационными септическими осложнениями 53
3.3.1. Идентификация белка с молекулярной массой около 13 кД 53
3.3.2. Идентификация белка с молекулярной массой около 25 кД 54
3.3.3. Идентификация белка с молекулярной массой около 30 кД 54
3.3.4. Идентификация белка с молекулярной массой около 45 кД 55
3.3.5. Идентификация белка с молекулярной массой около 70 кД 55
3.3.6. Идентификация белка с молекулярной массой около 80 кД 56
3.3.7. Идентификация белка с молекулярной массой около 90 кД. 56
3.4. Количественное определение белковых фракций, выделенных из ультрафильтратов, полученных при проведении гемофильтрации онкологическим больным с сепсисом 59
3.4.1. Количественное определение белковых фракций, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом с помощью сканирования электрофореграмм 60
3.4.2. Количественное определение белковых фракций, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом с помощью гель-фильтрации 64
3.5. Истощение белков сыворотки крови при проведении
последовательных процедур вено-венозной ГФ онкологическим больным
с послеоперационным сепсисом 65
3.6. Элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной
детоксикации онкологическим больным 68
3.6.1. Сывороточные концентрации и элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкохирургическим больным с изолированной острой почечной недостаточностью 70
3.6.2. Сывороточные концентрации и элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкологическим больным множественной миеломой 73
3.6.3. Сывороточные концентрации и элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкологическим больным с сепсисом 75
3.7. Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови 81
3.7.1. Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови доноров по отношению к провоспалительным цитокинам 81
3.7.2. Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови онкологических больных с сепсисом по отношению к провоспалительным цитокинам 86
Глава IV. Обсуждение результатов 103
Выводы 113
Приложение 1 114
Список литературы
- Современные концепции формирования септических состояний и полиорганной недостаточности
- ЭКД в комплексе интенсивной терапии больных с органной и полиорганной недостаточностью
- Потеря белков при проведении ГФ онкологическим больным с послеоперационный септическими осложнениями
- Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови доноров по отношению к провоспалительным цитокинам
Введение к работе
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем
современной медицины является сепсис, летальность при котором,
несмотря на интенсивную терапию, достигает 40-90% [30,70,102] в
зависимости от этиологических причин и степени органных нарушений
[44]. В онкологических клиниках проблема сепсиса особенно значима, так
как присущие опухолевому процессу нарушения различных звеньев
гомеостаза усугубляются инвазивными диагностическими
исследованиями, лучевой и химиотерапией, применением больших доз глюкокортикоидов [97,100]. Современные тенденции хирургического лечения онкологических больных, характеризующиеся расширением объема и зон оперативных вмешательств [20], сопровождаются высоким риском развития послеоперационных осложнений. Частота и тяжесть гнойно-септических осложнений неуклонно растет, несмотря на технические достижения в интенсивной терапии и поддерживающее лечение [1,2,3,4,7,12]. Лечение септических пациентов было и остается таким же сложным, как и увеличение степени выживаемости, а так же ясное клиническое определение картины сепсиса.
Неэффективность стандартного комплекса интенсивной терапии
нарушений гомеостаза при сепсисе всё чаще приводит к необходимости
применения экстракорпоральных методов детоксикации. В настоящее
время многими исследователями показано, что одним из наиболее
гемодинамически толерантных и эффективных методов интенсивной
терапии сепсиса, независимо от почечной функции, является
гемофильтрация [38,91,93]. Помимо адекватной коррекции азотемии [18],
при гемофильтрации элиминируются также различные медиаторы
воспаления. В литературе имеются многочисленные противоречия
относительно качественного спектра молекул, элиминируемых в процессе
гемофильтрации, в зависимости от их молекулярной массы, структуры, тканевого и клеточного связывания [32,59,65]. Считается, что именно удаление провоспалительных медиаторов и ряда белков оказывает положительный эффект при лечении больных с сепсисом, так как провоспалительные цитокины и белки острой фазы играют важную роль в развитии септического шока и органной или полиорганной недостаточности [149]. В настоящее время в литературных источниках, а также в технических протоколах указывается, что при гемофильтрации элиминируются молекулы с молекулярной массой до 50 кД [162]. Однако, с другой стороны, известно, что при гемофильтрации из крови больных диабетом удаляются гликозилированные молекулы с молекулярным весом до 80 кД [82,144]. Недавние исследования, посвященные спектру белков, удаляемых при проведении длительной заместительной почечной терапии у пациентов с острой почечной недостаточностью, также обнаружили элиминацию протеинов с молекулярным весом выше 50 кД [124,136]. Факт потери молекул такого крупного размера косвенно подтверждает возможность удаления с помощью гемофильтрации медиаторов воспаления, которые имеют гораздо меньший молекулярный вес. Но, с другой стороны, этот же факт указывает на возможность потери в процессе гемофильтрации и более крупных белковых молекул, удаление которых может сказываться на общем состоянии пациента. Онкологические больные имеют ряд специфических нарушений гомеостаза, отличающихся от таковых при изолированной уремии. У ряда больных с распространенным опухолевым процессом отмечается гипопротеинемия, и потеря некоторых белковых фракций для них может быть весьма значимой, что требует уточнения для проведения компенсаторных мероприятий.
Цель работы - изучить элиминацию белковых фракций у онкологических больных с септическими осложнениями при проведении процедур экстракорпоральной детоксикации (ЭКД). Задачи исследования:
Изучить спектр белковых потерь при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.
Исследовать элиминацию цитокинов при проведении процедур ЭКД.
Оценить потенциальные возможности сыворотки крови пациентов с сепсисом по связыванию избытка цитокинов.
Идентифицировать элиминируемые крупномолекулярные белковые фракции.
Провести количественную оценку потери белков при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.
Научно-практическая значимость
Впервые исследован спектр белков элиминируемых при гемофильтрации у онкологических больных с гнойно-септическими осложнениями.
Впервые была произведена количественная оценка белков сыворотки крови, теряемых при проведении экстракорпоральных методов детоксикации пациентам со злокачественными новообразованиями.
Впервые показано истощение сыворотки крови по минорным белкам (ретинол-связывающий белок, трансферрин, цинк-связывающий белок).
Впервые показано нарушение связывания цитокинов белками сыворотки крови и получены новые данные, характеризующие динамику элиминации цитоикинов из системного кровотока при проведении гемофильтрации.
Показано восстановление способности белков сыворотки крови связывать избыток цитокинов после проведения гемофильтрации. Показано участие провоспалительных цитокинов в развитии системной воспалительной реакции.
Полученные результаты могут быть использованы для коррекции методов экстракорпоральной детоксикации и адекватного возмещения белков сыворотки крови.
Полученные в работе результаты оптимизируют возможности практического использования метода гемофильтрации у онкологических больных с гнойно-септическими осложнениями.
Современные концепции формирования септических состояний и полиорганной недостаточности
В 1991 году на американо-канадской согласительной конференции в Нортбруке [27] было предложено использовать такое понятие, как синдром системного воспалительного ответа (ССВО), и рассматривать его как универсальный ответ организма на воздействие сильных раздражителей, включающих и инфекцию. ССВО может быть вызван не только инфекционными агентами, но и неинфекционными нарушениями, такими как травма или панкреатит. Сепсис, ассоциированный с гипоперфузией внутренних органов, которая приводит к синдромам органной недостаточности, таким как олигурия, ацидоз и изменения ментальных функций, и/или гипотензией классифицируется как «септический шок», который, как правило, имеет наихудшие прогнозы [145].
В соответствии с господствующей в медицине бактериологической концепцией, в патогенезе ранних послеоперационных осложнений, включая синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, септический шок, органную и полиорганную недостаточность (ПОН), наиболее частыми возбудителями септических состояний являются представители условно-патогенной флоры, составляющие часть нормальной микрофлоры организма человека [9,10], транслоцитующиеся в кровяное русло при обширных хирургических вмешательствах. Таким образом, существуют основания считать, что бактериальная транслокация кишечной микрофлоры является основным механизмом эндогенного инфицирования и при определенных обстоятельствах может быть причиной системной инфекции и сепсиса у человека [6]. «Пусковым» механизмом сепсиса считают стимуляцию клеток хозяина чрезмерным количеством бактерий и/или их фрагментов, однако при бактериальном сепсисе, который является наиболее частым, у 20-50% больных бактериемию зарегистрировать не удается [191], что заставляет задуматься о других возможных причинах формирования ССВО. Важным является также факт, что реакции, наблюдаемые при септических состояниях, отмечаются и при других патологических процессах, непосредственно не связанных с участием микроорганизмов и/или их компонентов - при травме, шоке, обширных хирургических вмешательствах. Поэтому, еще в 1956 г Давыдовским И.В. [15] в развитии септического процесса на первый план была выдвинута роль макроорганизма и состояние его реактивности. Согласно его представлениям, клинические проявления системных патологических явлений определяются реакциями самого организма. Патологические процессы развиваются по общебиологическим закономерностям и обусловлены, прежде всего, собственными, присущими самому организму, эндогенными механизмами. Повреждающий фактор (операционная травма, микроорганизмы, эндотоксин и т.д.), играет роль причины и обязательного условия развития, но является лишь количественным регулятором эндогенеза системных патологических процессов [17]. В последние годы появились многочисленные сведения о роли эндогенных биорегуляторов различной природы (цитокинов, кининов, фосфолипидов, метаболитов арахидоновой кислоты и др.) в развитии структурных и функциональных изменений, которые приводят к системным воспалительным реакциям, септическому шоку, острой почечной, печеночной и полиорганной недостаточности, пневмонии и другим осложнениям после высокотравматичных мультиорганных операций [189,156,156]. Особая роль в патогенезе заболеваний отводится медиаторам иммунной системы - цитокинам. Высокая биологическая активность цитокинов наряду с их токсичностью и незначительным разрывом между терапевтической и токсической дозами обуславливает их участие не только в жизненно важных физиологических, но и в патологических процессах [25,50,61,67,151].
Самым угрожающим для жизни пациента осложнением или финальной стадией ССВО и сепсиса является полиорганная недостаточность (ПОН), которая развивается у 30 % пациентов с сепсисом, а также у пациентов с травмами, ожогами и острым панкреатитом [49,53,84,129,186]. На сегодняшний день существует точка зрения, что массированная воспалительная реакция в результате системного высвобождения цитокинов является обычным путем, лежащим в основе ПОН [88]. Кроме того, известно, что большинство пациентов имеют признаки дисфункции в одном или более органах задолго до того, как разовьется ПОН. Однако, принимая во внимание все вышесказанное, практически невозможно точно определить специфический цитокин, или специфическую реакцию, являющиеся причиной ССВО. Цитокины высоко плейотропны и, по-видимому, они способны продуцировать различные эффекты в зависимости от гормонального фона окружающей среды. Более того, организм имеет чрезвычайно сложную, жестко регулируемую сеть рецепторных антагонистов и других регуляторных агентов, которые постоянно модулируют эффекты цитокинового высвобождения. Таким образом, системное высвобождение цитокинов может иметь место при различных нарушениях, не приводя к органной дисфункции. Даже при таких нарушениях, которые часто ассоциируются с органной дисфункцией, модель системного высвобождения цитокинов различна.
Системный ответ осуществляется посредством продуцируемых макрофагами цитокинов, которые направлены на органные рецепторы в ответ на повреждение или инфекцию. Воспалительный ответ на повреждение или инфекцию чрезвычайно консервативен и регулируется реакциями организма. После опознавания инфицирующего агента организм продуцирует растворимые белки (цитокины) и липидные провоспалительные молекулы (лейкотриены, производные арахидоновой кислоты, простагландины), которые активируют клеточные механизмы защиты. После этого продуцируются соответствующие противовоспалительные молекулы для того, чтобы аттенуировать и поддерживать ответ организма на инфекцию (противовоспалительные цитокины, рецепторы, рецепторные антагонисты) [46]. Обычно цитокиновый ответ регулируется сложной сетью про- и противовоспалительных медиаторов. Начальный воспалительный ответ контролируется снижением продукции и нейтрализацией уже выделенных цитокинов, что свидетельствует о присутствии сложной системы про- и противовоспалительных молекул [72,148]. При этом такая система регулирования не всегда адекватна и, в некоторых случаях, может работать против организма и вызывать ССВО и ПОН. Именно это может объяснять, тот факт, что при сходных начальных клинических состояниях пациентов трудно прогнозировать развитие ПОН и ССВО. В зависимости от течения ответа организма на травму или инфекцию в литературе выделяется несколько вариантов развития событий: 1) пациенты с сепсисом, обширными ожогами, массированными травматическими повреждениями, или другими тяжелыми повреждениями практически не обнаруживают признаков системного воспаления или органной дисфункции, хотя их выздоровление может быть замедленно вследствие тяжести течения болезни; 2) пациенты с сепсисом или другими тяжелыми травмами, у которых развивается легкая форма ССВО и некоторые признаки дисфункции в одном или двух органах, которые быстро разрешаются; 3)массивная системная воспалительная реакция, быстро развивающаяся после первоначальной травмы, со смертью от серьезного шока, часто следующей в промежутке нескольких дней.
ЭКД в комплексе интенсивной терапии больных с органной и полиорганной недостаточностью
Тяжёлый сепсис и септический шок являются главными причинами развития СПОН и летальности в отделениях интенсивной терапии [166,178], уровень которой, несмотря на интенсивную многокомпонентную терапию, не опускается ниже 16-38% [5], достигая 60% при тяжёлом сепсисе [11,35, 95].
Проблема сепсиса приобретает особое значение при лечении онкологических больных, так как присущие опухолевому процессу нарушения различных звеньев гомеостаза усугубляются проведением инвазивных диагностических исследований, химио- и лучевой терапии, применением глюкокортикоидов и иммуносупрессоров, расширением показаний к выполнению обширных травматичных, с мультиорганной резекцией хирургических вмешательств, в том числе у лиц пожилого возраста с сопутствующей соматической патологией [13,28,54, 73,80,86,118,154,157].
Есть указания на целесообразность проведения замещающей почечной терапии (ЗПТ) пациентам с сепсисом вследствие острого перитонита, имеющим повреждение 2-3 органных систем и 15-20 баллов по шкале APACHE II [29,71], при условии корректного мониторинга баланса жидкости, антикоагуляции, гипотермии и элиминации лекарственных препаратов [93]. При высоком риске развития СПОН септического генеза как можно раньше должна быть начата ГДФ с целью воздействия на процессы диссеминированного внутрисосудистого воспаления [139]. Аппаратная и безаппаратная артериовенозная ГФ успешно применяется у больных, перенесших септический шок [185]. Многие авторы признают, что ГФ может стать специфическим методом лечения сепсиса вне зависимости от почечной функции [36,42].
Несмотря на то, что гемофильтрация признана наиболее толерантной процедурой у гемодинамически нестабильных больных [112], адекватный объём фильтрации неизвестен. Необходимо широкое внедрение методов ЗПТ в практику ОРИТ, с увеличением объёма УФ у пациентов с сепсисом [165]. Рандомизированные исследования показали, что при проведении гемофильтрации критическим больных с сепсисом и ОПН наиболее высокая выживаемость (57%) отмечена при объёме фильтрата не менее 35 мл/кг/час, при фильтрационном объёме 20 мл/кг/час выживаемость не превышает 41% [115,179]. Раннее начало продолженной вено-венозной ГФ способствует значительному снижению смертности неолигурических пациентов с сепсисом и СПОН в отделениях интенсивной терапии [188]. Малообъёмная ГФ (1-2 литра в час) не приводит к значимому клиническому и лабораторному эффекту при проведении её пациентам с септическим шоком и органными дисфункциями и не может быть рекомендована в качестве эффективной составляющей интенсивной терапии этих больных [57]. Этими же исследователями при раннем назначении пациентам с септическим шоком и СПОН высокообъёмной (до 6 литров в час) вено-венозной ГФ продемонстрирована возможность редукции дозы норадреналина, необходимой для поддержания среднего артериального давления на уровне 70 мм рт. ст., а также достоверного снижения сывороточных концентраций анафилатоксинов и некоторых цитокинов [56].
Положительный эффект ГФ пропорционален объёму ультрафильтрата и, следовательно, количеству удалённых медиаторов сепсиса [90,98,108,174], особенно при использовании гемофильтров из высокопроницаемых мембран с размером пор 60 кД, несмотря на неизбежные потери общего белка, достигающие 7,6 г за 12 часов [137,138]. Есть сообщения об одинаковой эффективности и хорошей гемодинамической толерантности [92] процедуры при проведении критическим больным с сепсисом (APACHE II = 32,3-33,6 баллов) продолженного 12-часового ГД и продолженной 12-часовой ГФ с объёмом замещения 30 мл/кг/час [113]. У 90-95% выживших больных отмечается полное восстановление органных функций [164].
Наряду с этим другие исследователи не отмечают существенных различий в летальности критических больных при применении продолженных или интермиттирующих процедур [116] или выражают сомнение в целесообразности раннего начала ЗПТ, в том числе применения высокообъёмной ГФ у критических больных при развитии олигурической ОПН вследствие циркуляторной и дыхательной недостаточности [47].
Развитие органной и полиорганной недостаточности у онкологических больных создаёт целый комплекс проблем как медицинского, так и технического характера. Сведения о применении ЭКД в комплексе интенсивной терапии онкологических больных при развитии у них органной недостаточности немногочисленны и в большинстве случаев имеют характер сообщений об отдельных успехах сочетания ЭКД и специального лечения. Основной проблемой в настоящее время остается отсутствие специфических биологических мишеней экстракорпорального очищения крови при ССВО [8]. Предполагается, что биологическими мишенями ЭКД являются некоторые системы растворимых медиаторов, которые включают в себя следующие молекулы: эйкозаноиды, лейкотриены, система комплемента, цитокины, факторы активации тромбоцитов, оксиданты, хемокины и другие потенциально важные олигопептиды и вазогенные вещества, а также, возможно, система уремических токсинов. Кроме того, неизвестно, действительно ли те вещества, которые предполагаются мишенями для вмешательства при сепсисе и СПОН, могут быть удалены с помощью ЭКД. В настоящее время доказано, что большинство из этих молекул-мишеней являются водорастворимыми, что очень важно, так как современные методы экстракорпорального очищения крови эффективны в отношении именно водорастворимых субстанций. Однако, несмотря на отсутствие четкой картины удаления молекул и ясного понимания клинического эффекта от этого удаления конкретных молекул, методы заместительной терапии положительно зарекомендовали себя в клинической практике.
Потеря белков при проведении ГФ онкологическим больным с послеоперационный септическими осложнениями
При исследовании белка, выделенного из сывороток онкологических больных с сепсисом, с помощью MALDIOF масс-спектрометрии и библиотеки NCBI, получен список вариантов возможных белков с различной степенью совпадений последовательностей (вероятности). В списке белков (таблица 16 приложения 1), найденных с помощью библиотеки NCBI, удовлетворяющими условиям статистической значимости (63), являются все белки в таблице 16 приложения 1: к-легкая цепь иммуноглобулина вариабельный регион. Данные MALDIoF масс-спектрометрии в данном случае однозначно указывают на то, что третьим белком на электрофореграммах, полученных при разделении смеси белков из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, является вариабельный домен к-легкой цепи иммуноглобулина.
При исследовании белка, выделенного из сывороток онкологических больных с сепсисом, с помощью MALDIOF масс-спектрометрии и библиотеки NCBI, получен список из 20 вариантов возможных белков (таблица 17 приложения 1). В белках, найденных с помощью библиотеки NCBI, удовлетворяющими условиям статистической значимости (63), являются белки с номерами с 1 по 16, приведенные. Основным белком в таблице оказался альфа 1-антитрипсин (gi 1942629). Согласно данным MALDIoF масс-спектрометрии с высокой долей вероятности можно утверждать, что четвертым белком на электрофореграмме белковой смеси, полученной из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, является а 1-антитрипсин, что не противоречит исходным условиям - источнику и массе белка. При этом известно, что а 1-антитрипсин является довольно распространенным белком плазмы крови человека.
При исследовании белка, выделенного из сывороток онкологических больных с сепсисом, получен список из 20 вариантов возможных белков (таблица 18 приложения 1). В белках, найденных с помощью библиотеки NCBI, удовлетворяющими условиям статистической значимости (63), являются белки с номерами с 1 по 17. Наиболее вероятными претендентами являются три первых белка в списке вероятных белков сывороточный альбумин (gi28592), предшественник альбумина (gi4502027, gi6013427). Одним из основных компонентов сыворотки является сывороточный альбумин, а также его предшественник. Таким образом, было принято, что исследуемым белком, удовлетворяющим всем поставленным условиям, является смесь сывороточного альбумина и его предшественника.
При исследовании белка, выделенного из сывороток онкологических больных с сепсисом, получен список из 20 вариантов возможных белков (таблица 19 приложения 1), удовлетворяющих условиям статистической значимости (63), являются белки с номерами с 1 по 4: трансферрин (gi37747855, gi31415705), сывороточный альбумин (gi23307793) и предшественник сывороточного альбумина (gi6013427). По данным MALDIoF масс-спектрометрии основными претендентами на роль последнего белка на электрофореграмме являются трансферрин, альбумин и его предшественник. Таким образом, было принято, что исследуемым белком является смесь трансферрина, альбумина и его предшественника.
Помимо указанных белков у одного из больных с сепсисом в ультрафильтрате был найден белок с молекулярной массой около 90 кД, что практически в два раза превышает цифру 50 кД, заявляемую ранее в качестве порога удаления белков при ГФ.
При исследовании белка, выделенного из сыворотки онкологического больного с сепсисом, с помощью MALDIOF масс-спектрометрии и библиотеки NCBI получено 20 вариантов белков. В списке белков, представленных в таблице 20 приложения 1 только белки под номером 1 и 2: zinc finger protein (gi42660239, gi28380242) удовлетворяют порогу значимости (в данном случае 63). При окончательной идентификации белка в расчет принимался источник получения белка - сыворотка крови онкологического больного и примерная молекулярная масса - 90 кД, что позволило идентифицировать данный белок как цинк-содержащий белок (zinc finger protein).
В таблице 6 приведен список идентифицированных белков, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, которым проводилась ГФ в комплексе интенсивной терапии. Белки идентифицировали с помощью MALDIOF масс-спектрометрии и базы данных US National Center for Biotechnological Information. Среди белков, обнаруженных в фильтратах присутствовали (32-микроглобулин, ретинол-связывающий белок, а 1-антитрипсин, к-легкие цепи иммуноглобулинов, сывороточный альбумин, трансферрин и цинк содержащий белок (zinc finger protein), обнаруженный у одного больного.
Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови доноров по отношению к провоспалительным цитокинам
В исследованной группе онкологических больных с септическими послеоперационными осложнениями отмечались повышенные концентрации TNFa в сыворотке крови пациентов. До проведения ЭКД концентрации TNFa в сыворотке крови в отдельных случаях достигали 500 пг/мл, при этом тенденция к снижению концентрации этого цитокина после проведения ЭКД не отмечалась и концентрация цитокина оставалась практически на прежнем уровне 72,9±125,5 пг/мл. Содержание этого цитокина в фильтрате относительно невысоко (28,8±31,4 пг/мл), и не отражает эффективной элиминации его из кровотока. При этом возможна сорбция цитокина на гемофильтры [182], без попадания его в ультрафильтрат, однако данный факт недостаточно изучен. В сыворотке крови данной группы больных практически не детектировался IL-lb, однако в фильтрате содержание этого цитокина достигало 22,2±50,6 пг/мл. Данный факт может быть обусловлен скрытой гиперцитокинемией и высвобождением IL-lb в ультрафильтрат из его рецепторных комплексов, циркулирующих в крови. Такая гипотеза была сформулирована в работах Тугуз А.Р., Громовой Е.Г. [93,94], однако до сих пор не была изучена динамика циркуляции цитокин/рецепторных комплексов и время их полужизни. Кроме того, отсутствие значимых концентраций в крови и наличие высоких концентраций в ультрафильтрате может объясняться стимуляцией клеток при прохождении через гемофильтр, вызывая тем самым секрецию цитокина. В случае IL-6 наблюдались повышенные сывороточные концентрации 226,2±385 пг/мл с тенденцией к незначительному снижению после проведения ЭКД (206,9±389 пг/мл). Кроме того, в ультрафильтрате было отмечено значительное содержание этого медиатора (105,1±272 пг/мл), свидетельствующее об эффективном удалении его из кровотока. Сходная картина наблюдалась и в случае IL-2, чья сывороточная концентрация снижалась после ЭКД с 349,5±442 до 191±399 пг/мл. При исследовании IL-10 и IL-12 повышенных сывороточных концентраций в данной группе больных не выявлено, а также не было отмечено элиминации IL-10 в ультрафильтрат при его незначительных сывороточных концентрациях, снижающихся после ЭКД. Таким образом, суммируя результаты по изучению сывороточных уровней и элиминации цитокинов во всех рассмотренных группах можно отметить следующие наблюдаемые отличия: максимальная сывороточная концентрация провоспалительных цитокинов TNFa и IL-6 наблюдалась в группе онкохирургических больных с сепсисом, причем в данной группе также отмечалась элиминация значительных количеств этих медиаторов при проведении ЭКД. Однако по нашим наблюдениям, отмечались высокие концентрации этого цитокина, который рассматривается не только как информативный критерий тканевого повреждения, но и параметр тяжести сепсиса, септического шока, ПОН. Более того, по мнению В.Н.Дроздова, уровень IL-6 "тесно" коррелирует с гнойными осложнениями в послеоперационном периоде. В группе больных с множественной миеломой концентрации TNFa в некоторых случаях также были повышены, однако средние концентрации этого цитокина были на порядок ниже, чем у больных с сепсисом. Содержание IL-lb в сыворотке во всех случаях было низким, и лишь в группе больных с сепсисом отмечались значимые концентрации его в ультрафильтрате. Сывороточная концентрация IL-2 была повышена у больных множественной миеломой и у больных с септическими осложнениями. В обоих случаях наблюдалась тенденция к снижению уровня цитокина при проведении ЭКД. Предыдущие исследования, посвященные изучению IL-10 [143], отмечали его повышенные концентрации в сыворотке крови, особенно при развитии септических осложнений, а также элиминацию данного цитокина при проведении ЭКД. В нашем случае картина противоположная. Из 23 пациентов с сепсисом и ПОН концентрации IL-10 в сыворотке лишь в трех случаях отличались от нуля, а в моче и фильтратах он не детектировался. Нековалентный характер специфического связывания с рецепторними лигандами способствует диссоциации цитокинов. Локальное высвобождение значительных количеств цитокинов, обладающих вазоконстрикторными свойствами, в так называемых "шоковых" органах — почках, легких и т.д., может обуславливать развитие ОПН, интерстициальных отеков легких и таких системных патологических процессов как шок, ПОН; то есть цитокины сами по себе способны инициировать практически весь спектр наблюдаемых в послеоперационном периоде осложнений. Эти выводы согласуются с многочисленными исследованиями патофизиологической роли цитокинов в избыточной продукции метаболитов арахидоновой кислоты, нарушении микроциркуляции, снижении артериального давления, внутрисосудистого свертывания крови — характерными клиническими проявлениями септического шока.
Существование недетектируемых, но не инактивированных форм медиаторов, подтверждает факт их возможно более длительного персистирования в системном кровотоке, вопреки устоявшимся представлениям о местной продукции и метаболизме цитокинов. Таким образом, сывороточный уровень иммуномодулирующих медиаторов представляет проблемы в интерпретации, так как иммуноанализ может определить только свободные, циркулирующие медиаторы, но не медиаторы, связанные с клетками или рецепторами. Следовательно, измеренное количество медиаторов может не соответствовать истинному. В биоанализе, используемом для измерения функциональной активности цитокинов, часто отсутствует специфичность и поэтому количество присутствующих медиаторов может быть преувеличено. Другая проблема заключается в том, что анализ сывороточного уровня производится один раз в день или реже, хотя высвобождение медиаторов носит фазный характер. Учитывая это, представляется целесообразным исследование не самих цитокинов, а факторов, обуславливающих их специфическое связывание в сыворотке — растворимых рецепторов к цитокинам. Однако и в этом случае исследователи сталкиваются с подобными проблемами специфичности при интерпретации результатов сывороточных уровней рецепторных молекул. При исследовании экспрессии mRNA цитокинов МНК онкологических больных также было показано отсутствие корреляции между уровнями экспрессии mRNA цитокинов и их количеством даже на внутриклеточном уровне, не говоря уже о системной концентрации последних.
Таким образом, полученные нами данные о влиянии ЭКД на уровень цитокинов в сыворотке крови, диализате и моче согласуются с имеющимися литературными данными. Исходя из этих результатов не выявлено корреляции между тяжелыми септическими состояниями и концентрацией цитокинов в сыворотке крови пациентов. Однако возможно существует еще один механизм, который бы мог объяснить отсутствие такой корреляции, а также показал бы неадекватность подхода к изучению сывороточных цитокинов с помощью ИФА анализа с другой.
