Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуногистохимические маркеры в оценке клинического течения, эффективности лечения и прогноза у больных раком шейки матки (обзор литературы) 9
1.1 .Эпидемиология рака шейки матки
1.2. Морфологические особенности опухолей шейки матки
1.3.Методы лечения больных раком шейки матки
1.4. Прогностические и предсказательные факторы при раке шейки матки
1.4.1 .Клинико-морфологические факторы
1.4.2. Иммуногистохимические маркеры как биологические факторы прогноза
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
Глава 3. Определение иммуногистохимичесісих маркеров в плоскоклеточном раке шейки матки 49
3.1 .Оценка лучевого патоморфоза опухолевой ткани шейки матки
3.2. Пролиферативная активность клеток плоскоклеточного рака шейки матки как фактор биологического поведения опухоли
3.3.Оценка репаративных способностей клеток плоскоклеточного рака шейки матки, их значение в предсказании эффективности лучевой терапии
3.3.1.Оценка процессов репарации в опухолевой ткани по экспрессии Ки-70
3.3.2. Изучение экспрессии Ки-86 в клетках плоскоклеточного рака шейки матки
3.4. Одно- и многофакторный анализ прогностической значимости клинических, морфологических и иммуногистохимических признаков РШМ
Глава 4. Обсуждение результатов 78
Выводы 84
Практические рекомендации 86
Список литературы 87
- Морфологические особенности опухолей шейки матки
- Иммуногистохимические маркеры как биологические факторы прогноза
- Пролиферативная активность клеток плоскоклеточного рака шейки матки как фактор биологического поведения опухоли
- Изучение экспрессии Ки-86 в клетках плоскоклеточного рака шейки матки
Введение к работе
Актуальность темы.
Рак шейки матки (РШМ) остается одной из наиболее распространенных форм новообразований, занимая 7-е место среди всех злокачественных опухолей.
Среди разных типов рака у женщин - 3-е место (после рака молочной железы и рака толстой кишки) и 1-е место среди всех злокачественных новообразований женских половых органов (Двойрин В.В. и др., 1998, Чиссов В.И., Дарьялова О.Л., 2000, Мерабишвили В.М., 2002, Parkin D.M. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 370000 новых случаев заболевания (ВОЗ, 2002), из них значительная часть выявляется уже на поздних стадиях, когда эффективность современных методов лечения резко снижается. По данным Международной федерации гинекологов и акушеров (FIGO), около 60% впервые выявленных случаев РШМ составляют местнораспространенные формы опухоли. Почти половина больных инвазивным РШМ умирает от прогрессирования заболевания в течение 5 лет после окончания первичного лечения (Вишневская Е.Е., Бохман Я.В., 1994, Вишневская Е.Е. и др., 1999, Винокуров В.Л., 2003).
Одним из основных методов лечения больных РШМ является лучевая терапия (ЛТ). Лучевая терапия в качестве самостоятельного метода или как компонент комбинированного лечения используется более чем у 90% больных РШМ. Если сочетанная ЛТ при клинически локализованных опухолях (1-Иа стадия), наряду с комбинированным лечением, является методом выбора, то для 75% больных с местнораспространенными формами заболевания (ПЬ - Ш стадия), сочетанная ЛТ - не только основной, но часто единственно возможный метод лечения (Бохман Я.В., Лютра У.К., 1991; Вишневская Е.Е.. 1998, Чиссов В.И., Дарьялова Л., 2000). Поэтому совершенно очевидно, что показатели выживаемости и смертности в значительной степени определяются эффективностью ЛТ..
Результаты лучевого лечения зависят от ряда факторов, определяемых на различных уровнях: организменном (общее состояние больного, например, по шкале Карновского, иммунный статус, наличие сопутствующих заболеваний), органном (объем опухоли, степень распространения, поражение регионарных лимфатических узлов, особенности кровоснабжения), тканевом (макроскопическая форма роста, морфологический тип опухоли, соотношение стромы и паренхимы в опухоли) и клеточном (кинетические параметры - время удвоения опухоли, длительность S-фазы, индекс пролиферации, скорость репарации потенциальных или сублетальных лучевых повреждений, показатели репопуляции в опухоли). Знание всех этих факторов до начала и в процессе лучевой терапии позволяет судить о патоморфозе новообразования на морфо-функциональном уровне и предвидеть ответ опухоли на проводимое лечение, а также позволяет индивидуализировать план ЛТ и вносить соответствующие коррекции в период ее проведения.
В последнее время много внимания уделяется значению иммуногистохимических показателей, отражающих функциональное и биохимическое состояние опухолевых клеток, в оценке особенностей течения и исхода онкологического заболевания и чувствительности опухоли к проводимой терапии (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000).
Одним из наиболее широко используемых показателей прогноза онкологического заболевания является пролиферативная активность клеток опухоли. Пролиферативный индекс служит независимым прогностическим показателем возникновения рецидива и коррелирует с общей и безрецидивной выживаемостью при самых разнообразных новообразованиях (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000, Hon Koop A. et al., 1998); а также является предсказательным фактором для определения их чувствительности к химио- и лучевой терапии (Rozan S. et al., 1998, Sahebali S. et al., 2003). В настоящее время существуют высокоинформативные иммуногистохимические маркеры пролиферации. В первую очереДЬ, к ним относится антиген Ki-67, экспрессирующийся практически во всех фазах митотического цикла, и, в соответствии с этим, отражающий пролиферативный пул опухоли. В работах, посвященных опухолям шейки матки, принципиально доказано прогностическое значение индекса Ki-67. Однако нет единого мнения о критическом прогностическом уровне пролиферативной активности РШМ и ее связи с клинико-морфологическими факторами прогноза течения и исхода заболевания (Liu S.S. et al., 2001, Nacano Т. et al., 1997).
Естественно, что рост новообразований и их ответ на лечебные воздействия зависят и от репаративных потенций опухолевых клеток. К сожалению, в клинической онкологии эти механизмы практически не рассматривались.
Только в самое последнее время появились сведения о том, что экспрессия энзимов Ки-70, Ки-86, являющихся составной частью ДНК-зависимой протеин киназы, участвующей в репарации двухнитевых разрывов ДНК, является предсказательным маркером эффективности ЛТ рака толстой кишки (Komuro Y. и др., 2002), шейки матки (Wilson C.R. и др., 2000), пищевода (Zhao H.J. и др., 2000). Эти протеины, пожалуй, первые и пока единственные критерии действия лучевых факторов на опухоль, и заслуживают дальнейшего интенсивного изучения.
Таким образом, дальнейшее изучение и внедрение в клиническую практику определения указанных иммуногистохимических маркеров является актуальным и перспективным направлением в повышении эффективности ЛТ больных РШМ. Целью настоящей работы является иммуногистохимическая оценка пролиферативной активности (Ki-67) и репаративных способностей (Ки-70 и Ки-86) плоскоклеточного рака шейки матки в сопоставлении с клиникоморфологическими характеристиками опухоли и значение этих маркеров в прогнозе эффективности лучевой терапии Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1) определить уровень экспрессии маркеров Ki-67, Ku-70, Ku-86 до начала лечения и в процессе проведения сочетанной лучевой терапии;
2) сопоставить исходный уровень маркеров со степенью распространения
(стадией) опухоли и степенью ее дифференцировки;
3) сопоставить уровень иммуногистохимических маркеров с результатом сочетанной лучевой терапии;
4) установить вероятную зависимость между экспрессией маркеров в опухоли и отдаленными результатами лечения больных;
5) представить обоснованные рекомендации, касающиеся использования иммуногистохимических показателей Ki-67, Ku-70, Ku-86 в предсказании эффективности лучевой терапии рака шейки матки.
Научная новизна исследования Впервые проведено комплексное клинико-иммуногистохимическое исследование местнораспространенного рака шейки матки с одновременным иммуногистохимическим анализом двух наиболее важных процессов, определяющих жизнеспособность опухолевых клеток плоскоклеточного рака шейки матки, а именно пролиферативной активности и репаративной способности ДНК, оцениваемые по экспрессии Ki-67, Ku-70, Ku-86.
Показано, что пролиферативная активность является независимым прогностическим фактором течения и исхода местнораспространенного рака шейки матки. Впервые показано взаимодействие изученных иммуногистохимических маркеров, обуславливающее биологическое поведение злокачественной опухоли шейки матки.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Пролиферативная активность опухолевых клеток - важная биологическая характеристика, определяющая клиническое течение заболевания и выживаемость больных местнораспространенным раком шейки матки.
2. Высокая экспрессия антигена Ki-67, отражающая высокий уровень пролиферативной потенции опухоли, является неблагоприятным фактором клинического течения и исхода заболевания раком шейки матки, по своей информативности превосходящим такие традиционно учитываемые показатели, как стадия заболевания и степень дифференцировки опухоли.
Практическая значимость Показана высокая информативность иммуногистохимического определения экспрессии Ki-67 для предсказания эффективности лучевой терапии местнораспространенного РШМ. Желательно использовать эти показатели в клинической практике при решении вопроса о целесообразности назначения адъювантной терапии и оценке прогноза заболевания онкогинекологических больных.
Внедрение Результаты исследования внедрены в практику работы клиники РНЦРХТ (отделение радиохирургической гинекологии, отделение новых технологий лучевой терапии). Результаты диссертации доложены на совместной научной конференции отделения радиохирургической гинекологии и иммуногистохимической лаборатории РНЦРХТ, на заседании научного общества врачей патологоанатомов Санкт-Петербурга, на научной конференции молодых ученых «Современные технологии диагностики и лечения в клинической медицине» (2006), на Невском радиологическом форуме «Новые горизонты» (2007).
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 журнальные статьи в журнале, рекомендуемом ВАК, все по теме диссертации.
Морфологические особенности опухолей шейки матки
Принято считать, что степень клинической агрессивности опухоли определяется ее морфологическими особенностями. Суммарная оценка прогноза РШМ отражена в гистологических классификациях FIGO (2002) и TNM (2002), основанных на установлении степени распространения опухоли (глубина инвазии опухоли, размер образования в поперечнике, переход на тело матки и(или) стенки влагалища, вовлеченность параметральной клетчатки в патологический процесс, поражение регионарных лимфатических узлов, переход опухоли на смежные органы: мочевой пузырь и прямую кишку, отдаленные метастазы) и гистопатологической дифференцировки новообразования. Раку шейки матки часто предшествует дисплазия и (или) carcinoma in situ, лечение которых служит фактором профилактики истинного рака. (Бохман Я.В., 2002, Koss, 1979). До настоящего времени четко не определено, каким образом предраковые изменения тканей шейки матки переходят в рак. Различие между морфологическими вариантами выражается в преобладании парабазальных, более зрелых клеток или базальных, незрелых. Имеются работы, доказывающие, что усиление атипии клеток шейки матки связано со снижением активности апоптоза. Так, согласно полученным данным, один из факторов прогрессирования неоплазии в шейке матки - это снижение скорости нормальной (апоптозной) гибели клеток (Sheets Е. at al., 2004). Также есть данные о патогенетическом значении поли- и анеуплоидии ядерной ДНК клеток ростковых зон по мере нарастания малигнизации (Аватандилов Г.Г., Глухова Ю.К., 2004). Уже более 20 лет при исследовании РШМ применяется метод проточной цитометрии, с помощью которого определяются содержание ДНК, плоидность клеток, количество клеток, находящихся в S-фазе, степень злокачественности (Буторина О.Д. и др., 1994, Strang P. et al, 1997, Gasinska А. et al, 1999, 2004). Доля клеток, находящихся в S-фазе (показатель S-фазы), плоидность клеток являются также независимыми прогностическими факторами РШМ; так, в исследованиях было показано, что частота возникновения рецидивов выше при показателе S-фазы в опухоли более 20% (Буторина О.Д., Винокуров В.Л., 1995, Strang P. et al., 1997). Опухоли с диплоидным содержанием ДНК отличаются существенно лучшим прогнозом, чем с анеуплоидным (Gasinska A. et al, 2004). Анеуплоидия сочетается с неблагоприятными клинико-морфологическими признаками опухоли: частота ее выявления нарастает с понижением дифференцировки опухоли и с повышением способности новообразования к метастазированию. Эти факторы определяют не только прогноз заболевания, но и эффективность лучевой терапии (Кравец О.А., Марьина Л.А., 2004).
Гистологическое строение опухоли также рассматривается в качестве одного из факторов, влияющих на прогноз у больных РШМ.
Наиболее часто встречается плоскоклеточный рак, который диагностируется у 80-95% больных злокачественными опухолями шейки матки (Бохман Я.В. и др., 2002, Nguen et al., 1999). Выделяют плоскоклеточный рак с ороговением и рак без ороговения, а также мелкоклеточный рак. Однако на сегодняшний день прогностическое значение степени дифференцировки плоскоклеточного рака считается относительно небольшим (Бохман Я.В., 2002, Yuan С.С. et al., 1998). Только низкодифференцированный плоскоклеточный рак несколько ухудшает прогноз заболевания, однако частота данной гистологической формы не превышает 3-5% среди всех случаев рака шейки матки (Бохман Я.В., 1989, Sevin B.U. et al., 1996, Alfsen G.C. et al., 2001). Но необходимо учитывать, что при прочих равных условиях этот тип опухоли чаще дает метастазы в регионарные лимфатические узлы (Annual Report., 1991, Sevin B.U. et al., 1996), частота отдаленных метастазов также имеет тенденцию к увеличению (Masood М. et al., 1993). Отмечено снижение эффективности лечения больных с низкой дифференцировкой по сравнению с более дифференцированным плоскоклеточным раком (Lasry et al., 1991, Rogers et al., 1999). Однако эти отличия относительно невелики; так частота регионарных метастазов низкодифференцированного плоскоклеточного рака при I стадии достигает 26-30% (Chen et al., 1991), в то время как при более дифференцированном раке этот показатель составляет 10-16% (Бохман Я.В., 2002, Moberg P.J. et al., 1995). Пятилетняя выживаемость больных низкодифференцированным раком шейки матки при I стадии колеблется от 63 до 70% (Костромина К.Н., 1989); по данным же других авторов, низкая дифференцировка опухоли значительно ухудшает показатели выживаемости, она составляет всего 36% (Sevin B.U. et al., 1996, Chang T-C. et al., 1998).
Необходимо учитывать, что прогрессия любой исходной формы инвазивного рака, ведущей чертой которой является потеря дифференцировки, может привести к низкодифференцированной опухоли.
Второе место по частоте встречаемости среди гистологических форм РШМ занимает аденокарцинома, по данным различных авторов, (Румянцева С.Ю., 1998, Chang Т.С. et al., 1994, Ishikawa et al., 1999) она встречается у 3-15% больных раком шейки матки. В последние годы отмечается неуклонное нарастание частоты аденокарциномы шейки матки; так по данным некоторых авторов (Miller В.Е. et al., 1993, Freytag С. et al., 1996) ее частота увеличилась с 16 до 24 %; однако это увеличение скорее относительное, чем абсолютное (Hopkins М.Р. et al., 1991) и связано со снижением общей заболеваемости плоскоклеточным раком шейки матки в результате скрининговых мероприятий, отмечаемое практически во всех развитых странах (Azodi С. et al., 1999, Тау, Yew, 1999).
Гораздо реже наблюдаются смешанные формы, в которых сочетаются структуры железистого и плоскоклеточного рака, диморфный и мукоэпидермоидный рак (Yajima A. et al., 1984). Редкой разновидностью РШМ является светлоклеточная аденокарцинома мезонефроидного типа (Tanaka Y. et al., 1984, Hajj, Welch, 1981). Казуистическими гистологическими формами злокачественных опухолей шейки матки являются адено-кистозный и железисто-плоскоклеточные раки (на них приходится менее 1% всех случаев аденокарциномы шейки матки), отличающиеся достаточно агрессивным ростом, высокой потенцией к метастазированию и неблагоприятным прогнозом (Grayson W. et al., 1999).
Иммуногистохимические маркеры как биологические факторы прогноза
Неудовлетворенность результатами лучевой терапии местнораспространенного РШМ диктует необходимость отбора больных с плохим прогнозом для проведения соответствующего, более жесткого, лечения. Однако биологическое поведение опухолей, в том числе РШМ, остается в достаточной степени непредсказуемым даже для больных с одинаковым распространением новообразования. В последнее время для оценки агрессивности опухоли большое значение придается иммуногистохимическим (ИГХ) маркерам. Клеточные или тканевые маркеры определяются непосредственно в опухолевой ткани и характеризуют определенные биологические особенности новообразования, специфику его «поведения», выражающуюся в степени его агрессивности (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000). Определение любого молекулярного маркера несет в себе две задачи: выявить группу риска больных, требующих дополнительного лечения или более тщательного наблюдения при более ранних стадиях злокачественного процесса и оценить чувствительность опухоли к определенным видам терапии, что тем самым позволит индивидуализировать схему адъювантного лечения больных с местнораспространенным процессом. В современной медицине, постоянно увеличивается количество показателей, рассматривающихся в качестве потенциальных маркеров, что отражает достижения в области изучения механизмов регуляции пролиферации и апоптоза, ангиогенеза и дифференцировки опухолевых іслеток и их взаимоотношением с окружающими нормальными клетками. В основе злокачественной трансформации клеток лежит активация единичных или множественных клеточных онкогенов или генов-супрессоров, которая может определяться с помощью иммуногистохимического исследования (Копнин Б.П., 2004). Пролиферативная активность является ведущим фактором, как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникшей опухоли (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000).Одним из наиболее изученных показателей агрессивности опухолевого роста является клеточная пролиферация, которая может быть оценена с помощью митотического индекса и процентного содержания Кі-67- позитивных ядер. Кі-67 представляет собой ядерный антиген, экспрессируемый во всех фазах клеточного цикла, за исключением GO и ранних стадий фазы G1. Кі-67 кодирует ген, локализующийся на длинном плече 10-й хромосомы (Bar I.K. et al., 1996). Физиологическая роль антигена Кі-67 в жизни клетки пока не ясна, однако его присутствие во всех активных фазах митотического цикла позволяет использовать данный белок в качестве универсального маркера пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований (Шацева Т.А., Мухина М.С., 2004). Антитела к Кі-67 применяют для оценки пролиферативной активности многих новообразований. Для удобства оценки рассчитывается индекс Кі-67 — отношение числа опухолевых Ki-67-позитивных клеток к общему их количеству, выраженное в процентах. Пролиферативный индекс при различных локализациях опухоли служит независимым прогностическим показателем возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости, а также предсказательным фактором для определения чувствительности к химио- и лучевой терапии. Определена прогностическая роль активности процессов пролиферации для опухолей молочной железы, рака мочевого пузыря, аденокарциномы матки и прямой кишки, гепатоцеллюлярного рака, различных заболеваний крови и опухолей головного мозга (Коган Е.А. и др., 2002, Коршунов А.Г. и др., 2002, Самсонова Е.А., 2004, Hon Koop A. et al., 1998, Jansen R.L. et al., 1998, Nordstrom M. et al., 1996, Allegra C.J. et al., 2002, King K.L. et al., 1998). К настоящему времени уже имеется большое количество работ, посвященных изучению пролиферативной активности при патологии шейки матки. В работах различных авторов показано увеличение индекса пролиферации по мере нарастания атипии в клетках плоскоклеточного эпителия шейки матки (Фролова И.И., Бабиченко И.И., 2004). Индекс пролиферации в нормальной ткани шейки матки колеблется от 4% до 11%, при дисплазии I-II степени он увеличивается до 15% -21,4%; при дисплазии шейки матки тяжелой степени может достигать 60% (Geng L. et al., 1999, Payne S. et al., 1996, Bulten J. et al., 1996, Dunton C.J. et al., 1997, Kuo K.T. et al., 2006, Siemens F.C. et al., 2006, Looi M.L., 2008). В ряде работ подчеркивается, что пролиферативная активность клеток плоскоклеточного РШМ достоверно увеличивается при переходе преинвазивных форм в инвазивные (Pahuya S. et al., 2004, Keating J.T. et.al., 2001, Ho D.M. et al., 2000, Saheballi S. et al., 2003, Cambruzzy E. et al., 2005). Кроме того, в литературе имеются данные об увеличении индекса пролиферации в опухолях шейки матки с увеличением стадии заболевания (Lee J.S. et al., 2002, Cheung A.N.Y. et al., 2004, Sahebali S. et al., 2003). Во всех работах, имеющихся по этой теме, подчеркивается ассоциированность Ki-67 с папилломовирусом человека 16/18 типа и непосредственно с белком Е7 (al-Saleh W. et. al., 1995, Dunton C.J. et. al., 1997, Dallenbach-Hellweg et al., 2004, Saheballi S. et al., 2003).
Связь между пролиферативной активностью и гистологическим типом новообразований шейки матки неоднозначна. Имеются работы, в которых обнаружен более высокий индекс Кі-67 в аденокарциноме шейки матки, чем в плоскоклеточном РШМ (Negri G.et al., 2003, Cina S.J. et al., 1997, Lee K.R. et al., 2000). Рядом авторов также отмечено увеличение индекса Кі-67 по мере нарастания атипии от диспластических процессов в эндоцервиксе до аденокарциномы in situ и инвазивной формы (Сіла S.J. et al., 1997, Cambuzzi E. et al., 2005).
Liu S.S. и соавт. (2001) показали, что имеется связь между уровнем Ki-67 и апоптотическим индексом и их корреляция с выживаемостью больных РШМ: чем ниже эти показатели, тем лучше прогноз заболевания. Такие же результаты получены и в работе Lee J.S. и соавт.(2002): увеличение индекса Ki-67 и апоптотического индекса связано с прогрессированием дисплазии в инвазивный рак шейки матки.
Levine EX. с соавторами (1995) обнаружили достоверную связь между апоптотическим индексом, митотическим индексом и индексом Ki-67 и радиочувствительностью РШМ — 5-летняя выживаемость больных снижается с 79% до 47% при высоких показателях Ki-67 и индекса апоптоза и высоких значениях SF2; однако, влияние уровня Кі-67 на результаты лучевой терапии в этой работе оказалось не достоверно. Такие же результаты получены в других работах: при индексе Ki-67 ниже 7% и апоптотическом индексе менее 1% - 5-летняя выживаемость составила 67%; а при Ki-67 7% и индексе апоптоза более 1%, этот показатель снижался до 33% (Tsang R.W. et al., 1999, Harima Y. et al., 2000, Gasinska A. et al., 2004). Прослежена корреляция между индексом пролиферации и экспрессией онкобелка р53, отвечающим за апоптотическую активность опухоли (Siohara S. et al., 2005).
Существует обратная связь между индексом Ki-67 и митотическим индексом в клетках плоскоклеточного РШМ (Nacano Т. et al., 1997, 1993, KamoiS. etaL, 2001).
Пролиферативная активность клеток плоскоклеточного рака шейки матки как фактор биологического поведения опухоли
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование опухоли было проведено всем 80 больным с морфологически верифицированным плоскоклеточным РШМ. Повторно 37 пациентам ИГХ исследование было выполнено также и в процессе ЛТ, по достижении суммарной очаговой дозы 14 - 20 Гр в точке А.
Образцы опухолей были фиксированы в нейтральном забуференном формалине, прошли обычную проводку и залиты в парафин. До недавнего времени Ki-67 можно было исследовать только в криостатных тканевых срезах, что значительно ограничивало практическое использование (Braun N.et.al., 1990). С получением рекомбинантных моноклональных антител (МКАТ: МІВ 1-3 - Molecular Immunology Borstel) стало возможным изучать пролиферативную активность в парафиновых срезах. В нашей работе для выявления антигена Ki-67 были использованы моноклональные антитела (фирма «DAKO»). Необходимо отметить, что при использовании различных антител (MKAT-MIB1, ММ1, поликлональных Rah Ki-67 и NCL- Ki-67) средние значения индекса Ki-67 могут значительно различаться даже для опухолей одной локализации (Шацева Т.А., Мухина М.С., 2004). Ki-67 определяется во всех фазах клеточного цикла, кроме G0 и самых начальных стадий фазы G1. Для оценки репаративных способностей плоскоклеточного РШМ определяли в ядрах клеток энзимы Ku-70/Ku-80, гетеродимера, являющегося частью ДНК-зависимой протеинкиназы, которая непосредственно участвует в процессе клеточной репарации. Ku-70/Ku-80 определяли с помощью поликлональных антител (фирма «Santa Cruse», США). Приводим протокол иммуногистохимического анализа исследуемых маркеров: 1 .Прогревание в термостате при температуре 60С - 30-60 минут. 2. Депарафинизация в ксилоле (3 минуты х 2 раза), абсолютном спирте (3 минуты х 2 раза), 96 этиловом спирте (3 минуты х2). 3. Блокирование эндогенной пероксидазы в 3% растворе перекиси водорода в метаноле (20 минут при +4 С в холодильнике) или 5 минут в 3% водном растворе перекиси. 4. Промывание в дистиллированной воде (3 минуты). Этапы с 2-го по 4-ой были одинаковы для всех трех маркеров. Этапы 5-8 для антигенов Ki-67 и Ku-70/Ku-86 были индивидуальными. ДляКі-67: 5. Восстановление активности антигенов проводилось путем кипячения в буфере с ЭДТА на водяной бане при повышенном давлении в скороварке. Температура водяной бани 95-99С, стекла со срезами помещают в контейнер с буфером ЭДТА (рН 9,0), прогревают до момента выравнивания температуры буфера и воды (под контролем термометра) и выдерживают 20 минут, затем еще 20 минут при комнатной температуре. Переносят в дистиллированную воду на 1-2 минуты, затем промывают в TBS (2 раза по 5 минут). 6. Инкубация с нормальной сывороткой или 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в Трис-буфере (20 минут, комнатная температура). 7. Инкубация с моноклональными антителами Ki-67 ( фирма «DAKO»), разведение 1:1500 в растворе бычьего сывороточного альбумина в Трис-буфере (18 часов, t-6C). 8. Инкубация с анти-Mouse (30 минут, t-37C). После этапа 8 и 9 -промывание в TBS (2 раза по 5 минут). Для Ku-70/Ku-86: 5. Восстановление активности антигенов производилось путем кипячения в цитратном буфере (рН 6,0) при повышенном давлении в скороварке марки Magefesa — до появления первого кольца предохранительного клапана (4 минуты). После кипячения препараты оставались в буфере 15 минут, затем были перенесены в дистиллированную воду (2 минуты). 6. Инкубация с нормальной сывороткой или 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в Трис-буфере (20 минут, комнатная температура). 7. Инкубация с поликлональными антителами Ки-70 ИЛИ Ки-86 (фирма «Santa Cruse»), разведение 1:1200/1:400 соответственно в течение 30 минут в термостате t=37C. 8. Инкубация с Envision Rubbit (фирма «DAKO») в течение 30 минут при t=37C. Этапы 9—13 были одинаковы для всех трех маркеров. 9. Реакция с DAB (3 минуты, под контролем микроскопа, при комнатной температуре). Рабочий раствор DAB готовиться путем добавления к 1 мл буфера 1 капли концентрированного хромогена. 10. Смывание хромогена дистиллированной водой, промывание в дистиллированной воде в течение 3 минут. 11. Докрашивание ядер гематоксилином (2 минуты). Подсинивание в проточной воде (под контролем микроскопа). 12. Обезвоживание и заключение в бальзам — 96 спирт (2 минуты х 2 раза), карболксилол (2 минуты х 2 раза), ксилол (2 минуты х 2 раза). 13. Заключение в бальзам. Процедура подсчета. Положительным результатом являлось наличие специфического коричневого окрашивания ядер при выявлении антигена Ki-67 и энзимов Ки-70 и Ки-86 (рис.3). Подсчет ИГХ маркеров проводили с помощью светового микроскопа «Leica» при анализе 1000 клеток с применением иммерсионного объектива (хЮО). Уровень пролиферативной активности клеток плоскоклеточного рака шейки матки оценивали по величине индекса Ki-67, который вычисляли как отношение Ki-67-позитивных клеток к общему количеству всех клеток, выраженное в процентах. Для оценки репаративных клеточных потенций рассчитывался индекс белков Ku-70/Ku-86, который также рассчитывался на тысячу клеток (рис.4,5).
Изучение экспрессии Ки-86 в клетках плоскоклеточного рака шейки матки
Для рака шейки матки достаточно хорошо изучены общепринятые клинико-морфологические факторы прогноза, такие как гистологический тип опухоли, степень ее морфологической дифференцировки, глубина инвазии, лимфоваскулярная инвазия, стадия заболевания (Fregnani J.H. et al., 2006). Весьма информативным для определения биологического и клинического «поведения» новообразования оказалось содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток, особенно при использовании метода проточной цитометрии (Буторина О.Д., Винокуров В.Л., 1994, Кравец О.А., Марьина Л. А., 2004, Gasinska A. et al., 2004). Однако в последние два десятилетия ситуация с выявлением факторов, помогающих в оценке особенностей течения и исхода онкологических заболеваний, изменилась благодаря широкому внедрению в практику иммуногистохимических маркеров, отражающих функциональное состояние опухолевых клеток (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000).
В отношении плоскоклеточного РШМ количество иммуногистохимических исследований невелико, и согласованного мнения о прогностическом значении ИГХ маркеров, их связи с клинико-морфологическими факторами не получено, все это и послужило основанием для проведения настоящего исследования. В настоящее время установлено, что пролиферативная активность является ведущим фактором, как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. Принято считать, что оптимальным пролиферативным маркером для широкого использования является Ki-67. По нашим данным, пролиферативная активность плоскоклеточного РШМ прямо коррелирует со стадией заболевания, а также влияет на непосредственные и отдаленные результаты лечения. Пролиферативный индекс служит независимым прогностическим показателем 5-летней выживаемости пациенток. Результат проведенного исследования позволяет заключить, что активность пролиферативных процессов плоскоклеточного РШМ коррелирует со стадией заболевания. Так, с увеличением степени распространенности опухолевого процесса нарастает и пролиферативная клеточная активность. В работах многих авторов подчеркивается увеличение индекса Ki-67 при переходе диспластических процессов в шейке матки в преинвазивный, а затем и в инвазивный РШМ (Liu S.S. et al., 2001, Cheung A.N.Y. et al., 2004, Kimura M. et al., 2006, Lee J.S. et al., 2002, Sahebali S. et al., 2003, Payne S., 1996).
Нами также было установлено, что у значительной части больных в процессе ЛТ индекс пролиферации достоверно снижается, что согласуется с результатами других авторов (Kamer S.A. et al., 2003, Higuchi K.H. et al., 2001, Nacano T. et al., 1997, Tsang R.W., 1999). В этих исследованиях было показано влияние уровня пролиферативной активности на радиочувствительность плоскоклеточного РШМ; лучший прогноз имели те больные РШМ, у которых наблюдалось значительное снижение пролиферативной активности опухолевых клеток в процессе облучения.
В нашей работе мы получили, что лучший непосредственный эффект лучевого лечения наблюдался у пациенток с изначально невысокой пролиферативной активностью опухоли: у больных с индексом пролиферации ниже медианы клиническое излечение наблюдалось практически в 2 раза чаще, чем у пациенток с высокой пролиферативной активностью.
Однако, в работе Nacano Т. и соавт. (1993) РШМ с изначально высоким индексом пролиферации лучше реагирует на проводимую лучевую терапию и в группе таких больных достоверно выше частота «локальных ответов», а также показатели безрецидивной и 5-летней выживаемости. Это противоречит результатам нашей работы, где высокая частота локальных ответов и лучшие отдаленные результаты мы наблюдали у пациентов с более низким исходным индексом пролиферации.
Мы не получили достоверных различий между 5-летней выживаемостью в группах больных с снижением пролиферативной активности в процессе облучения и увеличением индекса пролиферации после достижения СОД в точке А 14-20 Гр. В работе Kamer S.A. и соавт. (2003) также пришли к выводу об отсутствии связи между изменениями Кі-67 в процессе лучевой терапии (СОД от внутриполостной ЛТ 9 Гр) и локальным контролем опухоли, в тоже время, этим автором отмечена связь между увеличением Кі-67 в процессе лечения и частотой отдаленных метастазов.
В мировой литературе нет окончательного единого мнения о значении пролиферативной активности плоскоклеточных опухолей для определения их радиочувствительности. Так в работах Cole D.J. и соавт. (1992), Ока К. (1996) было показано отсутствие корреляции между пролиферативной активностью рака шейки матки и ответом на проводимую ЛТ; не было выявлено достоверной связи между индексом Кі-67 и отдаленными результатами лечения. В проведенной работе не было установлено достоверной связи между активностью пролиферативных процессов в опухоли шейки матки и ее гистологическим типом. Такие же результаты были получены в работах Ока К. и соавт. (1996), Nacano Т.и соавт.(1997), Cole DJ (1992). Необходимо подчеркнуть, что практически во всех работах, посвященных пролиферативной активности ткани шейки матки, указывается на увеличение индекса пролиферации по мере нарастания атипии с увеличением степени дисплазии (Queiros С. et al., 2006, Kang G.H. et al., 2001, Siemens F.C. et al., 2006, Delias A. et al., 1997, Nair P. et al., 1999). Пролиферативная активность плоскоклеточного РШМ не зависела от состояния менструальной функции женщин.
![Улчшение результатов комплексного лечения местнораспространенного рака шейки матки [Электронный ресурс]](/i/i/4414/200428.png "Улчшение результатов комплексного лечения местнораспространенного рака шейки матки [Электронный ресурс] Югай Константин Викторович")