Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и Методы 17
1.1 Клеточные линии и условия культивирования 17
1.2 Образцы тканей 17
1.3 Выделение нуклеиновых кислот 18
1.3.1 Выделение плазмидной ДНК 18
1.3.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей 19
1.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агароз ных гелей 19
1.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 20
1.5 Молекулярное клонирование 20
1.5.1 Получение компетентных клеток E. coli 20
1.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli 21
1.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 21
1.5.4 Реакция лигирования 21
1.5.5 Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК и получение экспрессирующих векторов 22
1.5.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК 22
1.6 Обратная транскрипция РНК 23
1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23
1.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23
1.7.2 ПЦР в реальном времени 24
1.8 Трансфекция и получение псевдовирусных частиц 26
1.9 Инфекция псевдовирусными частицами 27
1.10 Анализ белков 27
1.10.1 Приготовление клеточных лизатов 27
1.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого 28
1.10.3 Электрофорез белков и Вестерн-блот гибридизация 28 1.10.4 Анализ активности фосфолипазы PLD 30
1.10.5 Анализ активности малой ГТФазы Ral 31
1.10.6 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса 31
1.10.7 Анализ желатиназной активности 31
1.10.8 Анализ активности uPA 32
1.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro 32
1.11.1 Анализ динамики пролиферации 32
1.11.2 Анализ динамики пролиферации с использованием МТТ 32
1.11.3 Анализ подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay) 33
1.11.4 Анализ клоногенности (тест на образование колоний в условиях разреженной популяции 33
1.11.5 Анализ способности к неприкрепленному росту (тест на образование колоний в полужидкой среде) 33
1.11.6 Анализ направленного движения по градиенту концентрации факторов роста 34
1.11.7 Анализ инвазивной активности (тест на инвазию in vitro) 34
1.12 Исследование клеточных характеристик in vivo 34
1.12.1 Определение туморогенности и динамики роста опухолей 34
1.12.2 Определение экспериментальной (ЭМА) и спонтанной (СМА) метаст атической активности 35
1.13 Иммуногистохимический анализ ( ИГХ). 35
1.14 Статистическая обработка результатов 36
1.15 Растворы, реагенты и среды 36
Глава 2. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала 39
2.1. Состояние проблемы 39
2.2.Собственные результаты 60
2.2.1 Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути 60
2.2.2 Роль малой ГТФазы RalА в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток 66
2.2.3. Значение активации RalА в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов и трансформированных фибробластов, прошедших селекцию in vivo 67
2.3.Обсуждение результатов 74
Глава 3. Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами высоко-агрессивного фенотипа и метастатической активности 79
3.1 Состояние проблемы 79
3.2 Собственные результаты 100
3.2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов 100
3.2.2 Совместная экспрессия белков RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению метастатической активности 103
3.2.3 Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток .. 105
3.2.4 Анализ изменения экспрессии белков: Cyclin D1, CD-24, Cav-1, а также активности белков Erk1/2, Jnk, p38 и Stat3 под влиянием экспрессии экзогенных белков RalA и RalB 114
3.2.5 Определение эффекторных мишеней белков RalA и RalB, взаимодействие с которыми необходимо для реализации их прометастатической функции. 118
3.3 Обсуждение результатов 122
Глава 4. Роль малой ГТФазы Arf6 в пролиферации, инвазии и активации ключевых в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей 131
4.1 Состояние проблемы 131
4.2 Собственные результаты 171
4.2.1 Сравнение влияния экспрессии экзогенного Arf6, а также его совместной экспрессии с белками RalA/RalB на метастатическую активность трансформированных фибробластов 179
4.2.2 Arf6-зависимая стимуляция пролиферации и активация фосфолипазы D 179
4.2.3 Идентификация Arf6/PLD/mTORC1/S6K1/S6 и Arf6/PLD/mTORC1/4E-BP1 сигнальных путей, приводящих к Arf6-зависимой активации комплекса инициации трансля ции 187
4.2.4 Влияние Arf6 на активацию МАР киназ Erk1/2, Jnk и p38 194
4.2.5 Молекулярные механизмы Arf6-зависимой стимуляции пролиферации включают активацию мTORC1 комплекса и МАР киназы р38 196 4.2.6 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в клинических образцах
опухолей немелкоклеточноно рака легкого 201
4.3 Обсуждение результатов 207
Глава 5. Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, в усилении высокоагрессивного фенотипа трансформированных клеток 217
5.1 Состояние проблемы 217
5.2 Собственные результаты 228
5.2.1 Корреляция экспрессии CRABP1 с уровнем спонтанной
метастатической активности трансформированных
фибробластов 228
5.2.2.Модуляция туморогенности и метастатической активности
клеток при активации и подавлении экспрессии CRABP1 230
5.2.3.Анализ экспрессии мРНК и продукции белка CRABP1 в
клинических образцах опухолей мезенхимального
происхождения – мягкотканых сарком различного генеза 239
5.2.3.1 Изучение экспрессии мРНК СRABP1 и CRABP2 в образцах опухолей мягких тканей человека 239
5.2.3.2 Анализ экспрессии белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком 242
5.3 Обсуждение результатов 244
Заключение 248
Выводы 252
Список сокращений и условных обозначений 254
Список литературы
- Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей
- Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК и получение экспрессирующих векторов
- Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути
- Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Диссертационная работа посвящена одной из важнейших задач экспериментальной онкологии - идентификации роли различных белков и сигнальных путей, регулирующих злокачественный потенциал опухолевых клеток. Как известно, в процессе селекции опухолевые клетки (или клоны клеток) за счет генетической нестабильности приобретают дополнительные качества, позволяющие им выживать в условиях гипоксии, проникать в окружающую ткань и в кровоток, выживать в кровяном русле, противостоять атакам со стороны иммунной системы, прикрепляться и проникать в органы-мишени и, в конечном счете, пролиферировать в новом микроокружении, создавая очаги вторичного роста, то есть метастазы. Несмотря на появление новых методов диагностики, онкологические заболевания часто обнаруживают уже в ходе процесса метастазирования. Очевидно, что это клинически значимое явление невозможно предотвратить без понимания фундаментальных механизмов, определяющих процесс метастазирования на молекулярном и клеточном уровнях. Перечисленные выше характеристики клеток, приобретаемые ими в процессе отбора, являются результатом многочисленных изменений активности как отдельных генов и их продуктов, так и целых каскадов, передающих внутриклеточные и дистанционные сигналы. Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, имеющиеся данные в значительной степени противоречивы и фрагментарны и далеко не в полной мере объясняют картину событий, происходящих в процессе приобретения трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа. Этим во многом объясняется тот факт, что таргетная терапия злокачественных новообразований, направленная на подавление отдельных онкогенов и регулируемых ими процессов, в ряде случаев оказывается недостаточно эффективной, поскольку зачастую направленное подавление активности одного белка (и активируемого им сигнального каскада) вызывает активацию альтернативных сигнальных путей, которые приводят к приобретению опухолевой клеткой дополнительных селективных преимуществ. Иногда такая терапия приводит к отбору еще более агрессивных клонов, и после короткой ремиссии происходит стремительное прогрессирование заболевания. Поэтому все активнее развиваются идеи одновременного (параллельного или последовательного) подавления нескольких белков и сигнальных путей, вовлеченных в процесс трансформации и опухолевой прогрессии.
Очевидно, что такой комплексный подход требует понимания всей совокупности событий, происходящих в опухолевой клетке, и, прежде всего, четких представлений о функциях и механизмах регуляции отдельных белков, их взаимосвязи с другими белками и внутриклеточными сигнальными путями, а также их роли в различных аспектах процесса
злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. Данная работа посвящена выявлению белков, участвующих в регуляции важнейших в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей, таких как Ha-Ras-, PLD-mTORC1- и Erk1/2-ассоциированные каскады, и исследованию функциональной роли в опухолевой прогрессии и метастазировании малых ГТФаз суперсемейства Ras: RalA, RalB, Arf6, а также белка, связывающего ретиноевую кислоту, CRABP1. Идентификация и функциональный анализ новых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и процесса метастазирования, является важнейшей фундаментальной задачей молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.
Цель исследования.
Целью данной работы является поиск и исследование функциональной роли новых внутриклеточных сигнальных путей и белков, участвующих в регуляции процессов опухолевой прогрессии и метастазирования.
Задачи исследования.
-
На экспериментальной модельной системе клеток трансформированных фибробластов сирийского хомяка исследовать влияние экспрессии онкогена H-Ras на уровень метастатической активности клеток.
-
Идентифицировать основные эффекторные белки и сигнальные пути, реализующие прометастатическую активность онкогена H-Ras.
-
Определить функциональное значение активации и подавления активности малой ГТФазы Ral для модуляции спонтанной метастатической активности клеток данной экспериментальной системы.
-
Провести сравнительный анализ влияния изоформ RalA и RalB на характеристики клеток in vivo и in vitro, ассоциированные с опухолевой прогрессией.
-
Определить важнейшие молекулы-эффекторы белков RalA и RalB, задействованные в Ral-зависимом усилении метастатической активности. Изучить влияние белков RalA/RalB на продукцию и активность ряда белков, вовлеченных в различные аспекты опухолевой прогрессии, таких как протеиназы внеклеточного матрикса, МАР киназы, белки CD24, Cav-1, Cyclin D1 и др.
-
Определить влияние экспрессии малой ГТФазы Arf6 (а также совместной экспрессии белков Arf6, RalA и RalB) на уровень спонтанной метастатической активности исследуемых клеток. Определить значение экспрессии Arf6 для пролиферативной и инвазивной активности клеток.
-
Идентифицировать сигнальные пути и молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6. Исследовать роль данной ГТФазы в отношении активности
фосфолипазы PLD, комплекса mTORC1 и его мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4E-BP1, а также МАР киназ Erk1/2, p38 и Jnk.
-
Провести анализ экспрессии генов Ral и Arf6 в клинических образцах немелкоклеточного рака легкого. Сопоставить полученные данные с клинико-морфологическими характеристиками исследуемых образцов.
-
Определить функциональную роль экспрессии белка CRABP1 в формировании высокоагрессивного фенотипа клеток на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Изучить влияние данного белка на туморогенность и метастатический потенциал клеток in vivo.
-
Исследовать экспрессию мРНК CRABP1 в образцах сарком мягких тканей. Исследовать продукцию белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах.
Научная новизна исследования.
В ходе работы были получены результаты, свидетельствующие о значительном влиянии онкогена H-Ras на усиление метастатического потенциала трансформированных клеток, и определены основные мишени и сигнальные пути, реализующие про-метастатическую функцию H-Ras. Результаты, полученные в процессе данной работы, являются одними из первых в мире опубликованных доказательств первостепенной значимости H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути в H-Ras-зависимой стимуляции метастазирования, а также роли собственно малых G-белков, RalA и RalB, в данном процессе. В работе первые показано, что среди двух гомологичных белков, RalA и RalB, активация RalB в большей степени усиливает спонтанную метастатическую активность клеток in vivo. Ранее аналогичных работ по сравнению влияния гомологов RalA и RalB на спонтанную метастатическую активность клеток не проводилось. При этом обнаружено, что про-метастатическая активность белка RalB осуществляется за счет взаимодействия с фосфолипазой D (PLD). Также впервые показано, что малая ГТФаза Arf6, также относящаяся к суперсемейству малых G-белков Ras, активируя PLD, потенцирует один из ключевых в аспекте канцерогенеза белков, киназу mTOR, стимулируя PLD/mTORC1/-S6K1-S6 и PLD/mTORC1/-4E-BP1 сигнальные пути, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. Кроме того, экспрессия Arf6 стимулирует важнейшие митоген-активируемые киназы (MAP киназы) Erk1/3 и p38, причем активация последней также приводит к активации компонентов комплекса инициации трансляции. Ранее данных об Arf6-зависимой активации киназы р38 опубликовано не было. Полученные данные также впервые свидетельствуют о промитогенной функции Arf6, реализуемой за счет активации Arf6/PLD/mTOR- и Arf6/p38-зависимых сигнальных путей.
Еще одним исследуемым в работе белком является связывающий ретиноевую кислоту белок CRABP1, значение которого в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования ранее не изучалось. Автором впервые показано, что в рамках данной экспериментальной модели экспрессия CRABP1 прямо коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности клеток. Более того, впервые обнаружено, что экспрессия CRABP1 усиливает туморогенность опухолевых клеток, а подавление экспрессии CRABP1 – снижает как туморогенность, так и метастатическую активность клеток. На основании полученных на экспериментальной модели результатов в рамках данной работы было впервые проведено исследование экспрессии гена CRABP1 в образцах опухолей человека мезенхимального происхождения – саркомах мягких тканей.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Проведенные исследования привели к обнаружению новых внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к приобретению трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа и метастатической активности. Получен ряд приоритетных данных, свидетельствующих о ранее не известных функциях в опухолевой прогрессии отдельных белков (таких, как белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1) и внутриклеточных путей передачи сигналов. Так, представленные в работе результаты выявили важнейшую роль H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути в приобретении высоко-метастазного фенотипа трансформированными клетками. Также большое значение имеет обнаружение про-митогенной активности малой ГТФазыArf6 и ее участия в регуляции таких ключевых в канцерогенезе белков, как киназы mTOR и Erk1/2. Идентификация новых сигнальных путей, Arf6PLDmTORC1S6K1S6, Arf6PLDmTORC14E-BP1 и p38S6, приводящих к активации компонентов комплекса инициации трансляции, также является крайне значимым как для понимания молекулярных механизмов регуляции mTOR и процесса инициации трансляции, так и для направленного изменения активности комплекса mTORС1 при разработке новых таргетных препаратов.
Основная масса полученных результатов опубликована как в отечественных, так и в известных международных научных журналах и имеет большое теоретическое значение, существенно расширяя уровень знаний о фундаментальных аспектах молекулярных нарушений и функциональных изменений трансформированных клеток, лежащих в основе опухолевой прогрессии и метастазирования. Полученные данные будут служить основой для дальнейших фундаментальных исследований в области молекулярных механизмов канцерогенеза. Ряд данных (в частности, новые механизмы регуляции mTOR и Erk1/2, а также обнаружение про-туморогенной активности CRABP1 и его убиквитарной экспрессии в синовиальных саркомах) имеет также и практическое значение, и может быть использовано в клинических исследованиях для оценки агрессивности, дифференциальной диагностики, прогнозировании течения и
разработки мишеней для направленной трансляционной терапии злокачественных опухолей человека. На основании полученных результатов предложено дальнейшее исследование белка CRABP1 в патогенезе синовиальных сарком (в частности, ИГХ анализ данного белка в образцах бифазных синовиальных сарком) и злокачественных фиброзных гистиоцитом в качестве потенциального диагностического и прогностического маркера.
Апробация работы.
Диссертация апробирована 28 октября 2013 г. на совместной научной конференции отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.
Публикации результатов исследования.
По итогам исследования опубликовано 33 научные работы (21 в зарубежной печати), из них 15 статей в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.H-Ras является стимулятором метастатической активности трансформированных фибробластов сирийского хомяка in vivo и реализует про-метастатическое действие посредством активации внутриклеточного сигнального пути: H-RasRalGDSRal.
2.Основными мишенями H-Ras, увеличивающими метастатический потенциал клеток данной экспериментальной модели, являются малые ГТФазы RalA и RalB, причем RalB обладает большей про-метастатической активностью.
3.Как RalA-, так и RalB-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается сходным повышением показателей уровня малигнизации клеток in vitro, однако про-метастатическое действие RalA и RalB опосредуется различными сигнальными путями.
4.Малая ГТФаза Arf6 активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней (рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4E-BP1), а также активирует МАР киназы Erk1/2 и р38. Идентифицированы активируемые белком Arf6 сигнальные пути: PLDmTORC1S6K1S6, PLDmTORC14E-BP1, p38S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции.
5.Arf6 усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6, включают активацию сигнального пути PLDmTORC1 и усиление активности р38.
6.Белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABP1) обладает протуморогенной и прометастатической активностью в отношении трансформированных фибробластов.
7. мРНК CRABP1 дифференциально экспрессируется в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах.
Степень достоверности результатов исследования.
Представленная работа выполнена с использованием современных методов молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. Результаты иллюстрированы рисунками, таблицами, схемами и фотографиями. Выводы вытекают из полученных результатов, полностью доказаны и адекватно отражают содержание диссертации. Достоверность результатов обеспечивается использованием современных методов исследования, наличием адекватных положительных и отрицательных контролей, проведением всех экспериментов в трех и более независимых повторах, применением современных способов статистической обработки данных. Все непосредственно изложенные в работе результаты опубликованы в ведущих отечественных и международных журналах.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, 11 выводов, списка сокращений и списка литературы, содержащего 643 источника. Материал диссертации иллюстрирован 13 таблицами и 97 рисунками.
Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей
Для анализа активности белков в кондиционированной среде на 6 луночные планшеты сажали 5105 клеток. На следующий день меняли среду на бессывороточную, через 24 часа собирали кондиционированную среду от клеток и центрифугировали ее 10 мин при 1500 g. Супернатант хранили в небольших аликвотах при -70 С. Для нанесения на SDS-ПААГ электрофорез 5 мкл среды смешивали с 5 мкл буфера для нанесения белков для зимографии.
Для анализа желатиназной активности (матриксных металлопротеаз) аликвоты проб кондиционированной среды разводили в 2 раза буфером для нанесения белков и наносили на гель (см. список растворов и сред). SDS-ПААГ электрофорез в 8% полиакриламидном геле с содержанием 0,2% желатина проводился в стандартных условиях в буфере Laemmly.
После проведения электрофореза гель инкубировали при аккуратном помешивании при комнатной температуре в буфере для ренатурации 30 мин, затем в тех же условиях в буфере для прохождения желатиназной реакции 30 мин. После этого гель помещали в свежий буфер для прохождения желатиназной реакции на 4 часа при аккуратном покачивании при +37С. Затем гель окрашивали в течение ночи в растворе коллоидного кумасси G-250. Избыток краски отмывали дистиллированной водой и фотографировали при помощи цифровой фотокамеры.
Для анализа активности uPA аликвоты исследуемых образцов разводили в 2 раза буфером для нанесения белков и наносили на гель. SDS-ПААГ электрофорез в 10% полиакриламидном геле с содержанием -казеина (Fluka) в концентрации 400 мг/мл и плазминогена (Sigma) 0,4 ед/мл проводился в стандартных условиях в буфере Laemmly.
После проведения электрофореза гель инкубировали в буфере для ренатурации 30 мин при аккуратном помешивании при комнатной температуре, затем в тех же условиях в воде 30 мин. После этого гель инкубировали в буфере для активации uPA 4 часа при аккуратном покачивании при +37 С. Гель окрашивали в течение ночи в растворе коллоидного кумасси G-250. Избыток краски отмывали дистиллированной водой и фотографировали при помощи цифровой фотокамеры.
Для анализа скорости пролиферации на 6-луночные плашки сажали по 10000 клеток каждой культуры в лунку в 2-х повторах для каждой временной точки. Клетки культивировались в стандартных условиях. Для анализа ежедневно из двух лунок снимали клетки раствором Версена. Затем из полученной суспензии смешивали аликвоту в расчете 1:1 (полученная суспензия : раствор трипанового синего). Количество клеток в ней подсчитывали в камере Горяева.
Для анализа скорости пролиферации на 96-луночные плашки сажались клетки в количестве от 1000 до 5х103 (в зависимости от культуры) в 3-х повторах для каждой временной точки. Клетки культивировались на среде с 10% содержанием сыворотки. Для анализа ежедневно из одной из лунок с клетками отбирали среду и добавляли 100 мкл раствора среды с 0,5 мгг/мл МТТ ( 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma), после чего плашки инкубировали 60 мин в CO2-инкубаторе. Затем из лунок отбирали по 80 мкл среды и добавляли 100 мкл лизирующего раствора (кислый изопропанол), лизаты тщательно перемешивали. Оптическая плотность (OD595) измеряли с помощью плашечного ридера Benchmark Plus, BioRad. Время удвоения клеток и графики динамики пролиферации рассчитывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm Software, версия 5.02.
Для проведения эксперимента клеточные линии рассаживали на 6-луночные плашки до 90% конфлюэнтности. Эксперимент ставился в двух вариантах – с обычной средой DMEM и средой DMEM с 1,5 мкг/мл содержанием Митомицина С (в случаях, когда сравнивались культуры с разной скоростью пролиферации, для нивелирования влияния этих различий на скорость зарастания «раны»). Концентрацию Митомицина С подбирали экспериментально так, чтобы клетки сохраняли жизнеспособность, но не делились. На дне плашки наконечником для дозаторов (200 мкл) чертилась прямая линия. После этой процедуры прикрепленные клетки на чашке отмывались от плавающих клеток. Участки чашек с так называемой «раной» фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX-51, координаты точки фиксировались. Через 24 часа среду меняли на свежую, после чего проводили повторное фотографирование тех же участков «раны». В каждом эксперименте для одной линии использовались 3 плашки. Проводилось 6 измерений ширины раны для каждой плашки. Таким образом, для одной временной точки для каждой клеточной линии проводилось 18 измерений. Для расчета процента миграции клеток использовалась формула: ([(ширина раны 0 часов)– (ширина раны 24 часа)]/(ширина раны 0 часов))100%.
Культуры клеток рассаживали по 100 клеток на 60 мм культуральные чашки Петри в стандартных условиях. Спустя неделю образовавшиеся колонии фиксировали 96% спиртом и окрашивали водным раствором кристаллического фиолетового. Количество колоний оценивалось с помощью программ Adobe Photoshop CS3 Extended (Adobe) и Total Lab ver. 2.0, модуль Colony Counter (Nonlinear Dynamics). раствор метилцеллюлозы смешивали с 2х средой DMEM (с 20% сывороткой и антибиотиком) в пропорции 1:1, добавляли клетки (в количестве от 5х102 до 2х103 в разных экспериментах), после чего смесь перемешивали и разливали на две 60 мм бактериальные чашки Петри. Спустя две недели в чашки добавляли водный раствор кристаллического фиолетового и охлаждали. Количество колоний оценивали с помощью программ Adobe Photoshop CS3 Extended (Adobe) и Total Lab ver. 2.0, модуль Colony Counter (Nonlinear Dynamics).
Тест на направленную миграцию in vitro проводили с использованием камер Бойдена с размером пор 8 мкм (Millipore). Внешняя камера заполнялась средой DMEM с 10% содержанием сыворотки, во внутреннюю камеру помещалось 10000 клеток (в среднем, в зависимости от культуры), ресуспендированных в бессывороточной среде. Проводилась инкубация в течение 18 часов в стандартных условиях, после чего среду отбирали, внутреннюю сторону мембраны тщательно очищали от клеток, а внешняя сторона окрашивалась водным раствором кристаллического фиолетового. Затем окрашенные клетки, преодолевшие барьер, фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX-51. Количество клеток оценивали с помощью программы Adobe Photoshop CS3 Extended (Adobe).
Анализ инвазивной активности (тест на инвазию in vitro) Тест на инвазию in vitro проводили с использованием камер Бойдена, покрытых матригелем, согласно протоколу производителя (Millipore). Вкратце, внешняя камера заполнялась средой DMEM без сыворотки, внутренняя камера с дном-мембраной опускалась во внешнюю на час (при комнатной температуре) для смачивания. После этого во внутреннюю камеру помещалось 20 000 клеток, ресуспендированных в бессывороточной среде, затем внутреннюю камеру переносили во внешнюю камеру, заполненную средой с 10% сыворотки. Проводили инкубацию в течение 24 часов при стандартных условиях, среду отбирали, внутреннюю сторону мембраны тщательно очищали от клеток, а внешнюю сторону окрашивали водным раствором кристаллического фиолетового. Затем мембрану с клетками, преодолевшими барьер, фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX-51.
Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК и получение экспрессирующих векторов
Поиск новых сигнальных путей и конкретных белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии и метастазирования, представляет огромный научный интерес как для понимания фундаментальных молекулярных механизмов, определяющих эти процессы, так и в аспекте клинической практики для прогнозирования течения онкологических заболеваний и комплексной таргетной терапии, основанной на совокупности всего спектра выявленных молекулярных изменений. Одним из основных подходов к изучению механизмов метастазирования и опухолевой прогрессии являются исследования in vitro и in vivo на экспериментальных моделях. Одна из таких моделей представляет собой систему стабильных клеточных линий общего происхождения – первичных трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus). Часть линий этой системы была получена с помощью трансформации путем инфекции разными изолятами штамма Schmidt-Ruppin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV) (линии группы HET-SR). Другая группа линий была получена при спонтанной трансформации эмбриональных фибробластов в культуре in vitro (линии группы STHE). Описываемая панель линий была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина, ранее подробно охарактеризована и многократно использовалась в работах российских ученых и зарубежных коллег, посвященных исследованию процесса метастазирования [65; 124; 125; 126; 643]. Было проверено, что все RSV-трансформированные линии содержат интактный интегрированный провирус и обладают сходным уровнем экспрессии и тирозин киназной активности v-Src [123; 570].
Клетки всех линий данной панели обладают типично трансформированным фенотипом, обладают выраженной туморогенностью при подкожном введении сингенным животным, но при этом принципиально различаются по уровню органоспецифического метастазирования в легкие в тесте на спонтанную метастатическую активность (различия по количеству легочных метастазов составляют десятки раз) (Рисунок 2.5 Б). Так, в состав описываемой коллекции входят исходно высоко-метастазные линии, приобретшие метастатический фенотип в процессе трансформации, низко-метастазные линии, а также линии, приобретшие высокий уровень метастатической активности в ходе селекции in vivo на экспериментальных животных (Рисунок 2.5 А). К основным достоинствам этой модели следует отнести: а - возможность исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе различий в уровне метастазирования клеток единого происхождения; б – исследование процессов метастазирования in vivo с использованием иммунокомпетентных животных; в - возможность изучения метастазирования с использованием теста на спонтанную метастатическую активность (СМА). Данный тест моделирует все этапы прогрессии - возникновение первичной подкожной опухоли, интравазию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Таким образом, данная модель является чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров метастазирования, поскольку позволяет наиболее адекватно моделировать процессы развития первичной опухоли и метастазирования, имеющие место в естественных условиях.
В данной работе использовались низко-метастазная (Н/М) линия HET-SR, исходно высокометастазные (В/М) линии HET-SR1 и HET-SR8, а также высоко-метастазная линия HET-SR-LNM, полученная в ходе селекции клеток HET-SR in vivo (после двух последовательных подкожных введений животным и последующего отбора клеток из метастазов в лимфоузлах). Спонтанно трансформированные линии включали низкометастазную линию STHE, а также ее высокометастазные варианты: STHE83/20 (клетки, выведенные в культуру из легочных метастазов, образовавшихся через 20 дней после внутривенного введения клеток STHE) и STHE-LNM8 (получена из метастаза в легком, образованным опухолью, сформированной через 50 дней после подкожной инъекции клеток STHE) (Рисунок 2.5 А).
Рисунок 2.5 А – Схема получения используемых в данной работе панель клеточных линий трансформированных фибробластов сирийского хомяка с разным уровнем спонтанной метастатической активности; Б – Схема эксперимента по изучению спонтанной метастатической активности (СМА) клеток in vivo. Ранее на использованной нами модели было показано, что введение активированного онкогена N-Ras не оказывает принципиального влияния на метастатический потенциал трансформированных фибробластов хомяка [570]. Вместе с тем, согласно ряду литературных данных, среди представителей семейства Ras на метастазирование в большей мере влияет H-Ras [349; 372; 508]. Поэтому для исследования влияния Ras на метастатическую активность клеток данной экспериментальной системы нами был выбран онкоген H-Ras.
Для этого мы использовали последовательность H-rasV12, содержащую типичную мутацию, приводящую к замене глицина на валин в 12 положении, которая кодирует конститутивно-активный белок. Находясь в ГТФ-связанном состоянии, H-RasV12 активно связывается с большинством эффекторов, в том числе с тремя основными своими мишенями: киназами Raf и PI3-К а также активатором малой ГТФазы Ral, белком Ral-GDS (Ral Guanidine dissociation stimulator). Последовательность мутантной формы H-RasV12 в ретровирусном векторе pLXSN была любезно представлена проф. Дж. Даунвардом (J. Downward, Imperial Cancer Research Fund, UK) [480; 601]. Эта конструкция была трансдуцирована методом ретровирусной инфекции в низкометастазную линию HET-SR.
В отобранных после селекции на антибиотике G418 клетках HET-SRH-Ras V12 было показано усиление экспрессии H-Ras (Рисунок 2.6А). Далее клетки HET-SRH-Ras V12, а также клетки контрольной линии, трансфицированные «пустым» вектором - HET-SRpLXSN - были тестированы на уровень СМА (рис 2.6 Б.В,Г). Для этого исследуемые клетки вводили хомякам подкожно в концентрации 2х104. Через два месяца животных усыпляли и проводили макроскопический визуальный обсчет количества легочных метастазов. Для каждого опыта использовали 10 хомяков в каждой экспериментальной группе. Каждый эксперимент проводили в трех независимых повторах.
На рисунке 2.6 представлены результаты сравнительного анализа СМА клеток HET-SRH-RasV12 и контрольной линии. Для наглядности на данном рисунке результаты представлены в двух вариантах. Рисунок 2.6 В иллюстрирует процент животных в экспериментальной и контрольной группах, у которых количество метастазов в легких соответствовало интервалу условно выделенных диапазонов. Так, количество метастазов у каждого хомяка (100%) из группы, которой прививались контрольные клетки HET-SRpLXSN, варьировало в пределах диапазона от 0 до 10. Наоборот, ни у одного хомяка (0%) из группы животных, которым прививали клетки линии HET-SRH-RasV12, количество метастазов не попадало в данный диапазон. Большинство животных (80%) данной группы демонстрировали более 100 метастазов, и у 20% количество метастазов попадало в диапазон от 40 до 100.
Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути
Обсуждаемый фрагмент работы посвящен сравнительному анализу двух изоформ белка Ral: RalA и RalB. Поскольку результаты, представленные в предыдущей главе, выявили, что именно RalGDS-Ral каскад является важнейшим сигнальным путем, опосредующим H-Ras– зависимое усиление спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов хомяка, в данном разделе исследования мы сравнивали влияние белков RalA и RalB на СМА клеток, а также исследовали Ral-зависимые изменения свойств клеток in vivo и in vitro, ассоциированные с приобретением высоко агрессивного фенотипа и метастазированием. Для этой задачи были получены производные низкометастазной линии HET-SR, экспрессирующие конститутивно активные формы белков RalA или RalB, а также линия с одновременной экспрессией обеих изоформ Ral. Сравнение СМА полученных линий показало, что хотя оба белка достоверно увеличивают метастатическую активность клеток, RalB обладает значительно более выраженной про-метастатической активностью, чем RalA. Эти результаты в целом согласуются с ранее выдвинутой идеей, согласно которой белки RalA и RalB задействованы в разных аспектах канцерогенеза. Так, предполагалось, что RalA в большей степени участвует в приобретении клетками способности к неприкрепленному росту, в то время как RalB «отвечает» за автономное выживание клеток [75; 82; 92; 525]. Данные, опубликованные позднее, также свидетельствуют о влиянии RalB на выживание клеток, в данном случае – за счет анти-апоптотического действия, реализуемого посредством активации RalB/TBK1 сигнального пути [37; 91]. В нашей экспериментальной системе, как показали эксперименты по анализу роста в метилцеллюлозе, исходные клетки низкометастазной линии HET-SR изначально обладали способностью формировать колонии в полужидкой среде. Возможно поэтому мы не выявили дополнительных изменений в этой характеристике при экспрессии белков Ral (и в частности, RalA). Если следовать логике приведенной выше идеи, то способность RalA стимулировать неприкрепленный рост в данном случае не использовалась, и в основе про-метастатического действия RalA лежат другие механизмы. Наоборот, идея о стимуляции белком RalB автономного выживания поддерживается результатами нашего исследования. Так, результаты анализа клоногенности показали, что средний размер колоний, образующихся из единичных клеток, экспрессирующих RalB, значительно больше размера колоний, формируемых контрольными клетками, и, что еще более важно, больше площади колоний, образуемых клетками, экспрессирующими RalA. Учитывая отсутствие различий в скорости пролиферации, это означает, что оба белка, и в особенности RalB, активно стимулируют выживание и рост клеток в условиях отсутствия клеточного микроокружения и секретируемых им цитокинов и факторов роста.В эту характеристику могут также вносить свой вклад и различия в локомоторной активности, поскольку RalB-экспрессирующие клетки обладают большей подвижностью. Важно отметить, что результаты данного теста соответствуют результатам анализа СМА — и в том, и в другом исследовании оба белка усиливали анализируемое свойство, при этом RalB оказывался «эффективнее». Очевидно, что способность к росту в отсутствии «привычного» микроокружения, усиленная под воздействием экспрессии белков Ral, дает клеткам очевидное селективное преимущество для вторичного роста в различных тканях при метастазировании в отдаленные органы. Таким образом, можно предположить, что как минимум одним из механизмов, лежащих в основе Ral-зависимого усиления СМА, является стимуляция автономного роста и независимости от клеточного микроокружения.
Одной из основных характеристик опухолевых клеток является повышенная скорость деления. По литературным данным известно, что белки Ral могут влиять на пролиферацию клеток, в частности увеличивая экспрессию CyclinD1 или подавляя активность ингибитора клеточного цикла p27kip [216]. Однако в рамках данной экспериментальной модели мы не обнаружили изменений в динамике пролиферации клеток при экспрессии белков RalA или RalB. Эти данные согласуются с результатами, описанными в предыдущей главе, согласно которым экспрессия мутантной формы H-RasV12G37, стимулирующей направление передачи сигнала по H-Ras-RalGDS-Ral сигнальному пути, также не вызывало изменений в пролиферативной активности клеток, в то время как экспрессия мутантных форм H-RasV12S35 и Ha-RasV12C40, стимулирующих МАР-киназный и PI3K-зависимый сигнальные пути соответственно, приводила к усилению пролиферации клеток. Отсутствием усиления пролиферации клеток in vitro при экспрессии изоформ Ral объясняется, по-видимому, и наблюдаемое отсутствие эффекта на характеристики роста опухолей in vivo, такие как размер и скорость роста прививаемых подкожно опухолей. Эти результаты отчасти противоречат данным Lim и соавторов, показавших на клетках рака поджелудочной железы, что подавление экспрессии эндогенного RalA приводит к подавлению туморогенности и роста опухолей [321]. В то же время, эти же авторы показывают, что подавление экспрессии RalB снижает инвазивную активность клеток in vitro и экспериментальную метастатическую активность in vivo, что соотносится с нашими данными о Ral-зависимой стимуляции инвазии и метастазирования. Однако, если данные вышеупомянутой работы в целом свидетельствуют о разнонаправленном эффекте белков RalА и RalB, то наши результаты скорее говорят о сходном, но в разной степени выраженном эффекте этих двух изоформ в отношении инвазии и метастазирования. Важно отметить, что в приведенной выше статье метастатическая активность оценивалась с помощью теста на ЭМА, в котором фактически анализируются только заключительные этапы процесса – выживание в кровотоке и способность формировать очаги вторичного роста. В нашей же работе исследовалось влияние белков Ral на спонтанную метастатическую активность, то есть клетки прививались животным подкожно, что позволяло оценить все этапы процесса метастазирования, начиная с формирования первичной опухоли. Обсуждая влияние изоформ Ral на СМА клеток, следует также отметить, что базируясь на гипотезе о неперекрывающихся функциональных активностях данных белков в отношении «озлокачествления» трансформированных клеток, мы проверили влияние их совместной экспрессии на метастатическую активность исследуемых клеток. К нашему удивлению, мы не обнаружили кумулятивного эффекта экзогенных RalA и RalB в отношении СМА. Так, введение активированного RalB в клетки, экспрессирующие активированный RalA, не привело к дополнительному усилению СМА. Более того, одновременная экспрессия двух изоформ привела к меньшему значению СМА по сравнению с клетками, экспрессирующими только RalB. Это может отчасти объясняться конкуренцией гиперэкспрессированных изоформ Ral за регуляторные молекулы (такие, как факторы обмена нуклеотидов) и эффекторные белки, в частности PLD, взаимодействие с которым, согласно полученным данным, является важнейшим условием RalB-зависимого усиления СМА. Этот последний результат был получен при исследовании Ral-зависимых сигнальных путей, задействованных в изменении метастатической активности клеток. Исследование проводилось с помощью сравнения воздействия различных эффекторных мутантов (дефектных в отношении взаимодействия с определенным эффектором) RalA и RalB на уровень СМА. Такой анализ позволяет оценивать вклад в исследуемую характеристику отдельных мишеней Ral, в данном случае, белков Sec5, RalBP1 и PLD. Результаты анализа показали, что исследуемые изоформы Ral влияют на СМА с помощью различных молекулярных механизмов, используя различные сигнальные пути или их комбинации
Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток
В первом разделе главы представлены результаты исследования влияния Arf6 на спонтанную метастатическую активность клеток. Предположение о возможном участии данного белка в регуляции метастатического потенциала клеток базировалось как на результатах предыдущей главы, указывающих на то, что RalB-зависимая стимуляция СМА требует взаимодействия RalB c PLD, так и на данных литературных источников, согласно которым Ral активирует PLD совместно с Arf6. Кроме того, множество работ, выполненных на разных клеточных моделях, демонстрируют участие данного G-белка в формировании высоко инвазивного фенотипа клеток [209; 227; 313; 359; 375; 553]. Как было отмечено выше, единственная опубликованная работа, указывающая на роль Arf6 в стимуляции метастазирования in vivo, была выполнена на высокоинвазивной клеточной линии меланомы LOX [381]. В нашей работе результаты анализа СМА клеток, экспрессирующих различные формы Arf6 (дикого типа, конститутивно активного мутанта и доминантно негативного мутанта) не выявили изменений метастатической активности по сравнению с контрольными клетками. Возможно, что способность Arf6 стимулировать метастатическую активность в сильной степени зависит от типа клеток. Кроме того, в указанной статье проводилось исследование экспериментальной метастатической активности, то есть клетки вводились непосредственно в кровоток животных. Соответственно, в этом случае анализируется преимущественно выживаемость клеток в кровяном русле и поздние этапы метастатического процесса, т.е. интравазия и возникновение очагов вторичного роста, в отличие от наших исследований, в которых анализировалась спонтанная метастатическая активность, моделирующая все этапы метастатического процесса, начиная с формирования первичной подкожной опухоли. Интересно, что экспрессия активированного Arf6 не повлияла на СМА клеток, в которых этот показатель был уже сильно увеличен с помощью экспрессии белков Ral. Как было сказано в начале главы, мы предполагали, что совместная экспрессия Ral (как минимум с RalА, но возможно и с RalВ) будет усиливать метастазирование в большей степени, чем экспрессия белков Ral по отдельности, за счет совместной Ral-Arf6 активации PLD. Однако результаты не подтвердили наше предположение. Экспрессия активированного Arf6, также как и его доминантно-негативного мутанта, не повлияла на уровень СМА, увеличенный в результате активности белков RalA и RalB. Это может означать, что ГТФ-связанная форма Arf6 не используется при стимуляции PLD (что противоречит имеющимся литературным данным), а также то, что нарушение кругооборота обмена нуклеотидов приводит к нарушению баланса активируемых Arf6 мишеней, что также влияет на конечные результаты эксперимента. Конечно, для окончательного выяснения роли Arf6 в RalA/B – зависимой активации СМА было бы разумно подавить эндогенный Arf6 в клетках, экспрессирующих экзогенный Ral, с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA) либо экспрессии малых шпилечных РНК (shRNA) и проанализировать таким образом вклад белка Arf6 в Ral-зависимую стимуляцию СМА. Однако, обе этих методики не представлялось возможным реализовать по ряду причин: во-первых, в связи с отсутствием расшифровки генома сирийского хомяка (что в принципе можно было обойти посредством секвенирования отдельного гена Arf6 c помощью подбора универсальных праймеров к консенсусным последовательностям); во-вторых, и это самое существенное, в литературе имеется ряд примеров использования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии Arf6, но практически нет примеров использования соответствующих shRNA. По всей видимости (и это согласуется с полученными нами позднее результатами на клеточных линиях человека, которые не вошли в данную работу), экспрессия Arf6shRNA обладает токсичным действием на клетки, которые, соответственно, либо погибают, либо «выбрасывают» соответствующие векторные последовательности на достаточно ранних пассажах, что делает невозможным исследование СМА. Что же касается siRNA, то этот подход широко используется для клеток in vitro, но также не подходит для длительных исследований in vivo, каковыми являются тесты на СМА.
Несмотря на то, что мы не выявили влияния Arf6 на метастатическую активность клеток, мы обнаружили принципиально важные эффекты экспрессии данного белка в отношении важнейших свойств клеток, ассоциированных с опухолевой прогрессией. В первую очередь это касается Arf6-зависимого увеличения пролиферации клеток. Мы показали, что Arf6 дикого типа и (в большей степени) конститутивно активная форма данного белка стимулируют динамику клеточной пролиферации, в отличие от доминантно-негативного мутанта или мутанта, не связывающего PLD. Эти результаты впервые прямо указывают на промитогенную функцию Arf6 и свидетельствуют о том, что влияние Arf6 на пролиферативную активность преимущественно реализуется в ГТФ-связанном состоянии и требует взаимодействия с PLD. Показанная нами Arf6-зависимая стимуляция пролиферации согласуется с данными Li M. и соавторов, полученными на клетках глиобластомы, о том, что введение siRNA к Arf6 или доминантно-негативного мутанта Arf6 приводит к ингибированию вызванной EGF стимуляции пролиферации клеток [314].
Мы также впервые показали, что экспрессия Arf6 увеличивает клоногенность, то есть способность клеток выживать в условиях недостатка секретируемых цитокинов и формировать колонии из единичных клеток в отсутствии клеточного микроокружения. Интересно, что экспрессия мутантной формы Arf6N48I наряду с диким типом и активированной формой Arf6 увеличивала клоногенность (в отличие от пролиферации). Это может объясняться различием в молекулярных механизмах, с помощью которых Arf6 усиливает пролиферативную активность и снижает потребность в факторах, секретируемых микроокружением. С другой стороны, на результаты эксперимента мог повлиять и тот факт, что клетки HET-SR Arf6N48I показали большую миграционную активность, что могло дать свой вклад в отщепление и распространение микроколоний. Возможно также, что для повышения клоногенности достаточно присутствия большого пула молекул Arf6. Это означает, что увеличение продукции Arf6 независимо от его статуса (ГТФ или ГДФ) приводит к снижению потребности клеток в ростовых факторах. Представляется удивительным, что доминантно-негативный мутант «ведет себя» так же, как и все остальные. Однако, существуют данные о том, что мутантная форма Arf6 T27N приводит к уменьшению аффинности Arf6 к обоим нуклеотидам и, достаточно нестабильна (агрегирует в растворе), тем не менее Arf6 T27N способен образовывать комплекс с EF6A [335]. Возможно, в нашем случае, экспрессия данной формы также не приводит к полному подавлению активности Arf6. Более того, в последнее время становится все более очевидным, что ГДФ-связанное состояние не приводит к инактивации Arf6, но определяет взаимодействие с другим набором эффекторов [160; 286; 348; 613]. Таким образом, возможно, что один и тот же результат – увеличение клоногенности клеток – достигается при экспрессии разных форм Arf6 посредством разных молекулярных механизмов. Возможно также, что в условиях бедного цитокинового окружения происходит включение неких компенсаторных механизмов, обходящих ингибирующий эффект Arf6 T27N. Так, например, в упомянутой выше статье на линии LOX показано, что клетки LOX-Arf6-ГДФ, способные к росту во вторичных очагах, «обошли» ингибирование активации ERK1/2, вызванное введением Arf6-ГДФ, с помощью пока не изученных компенсаторных механизмов [381].
