Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Структура и функции печени 9
1.2. Канцерогенез
1.2 . Гепатоканцерогенез 15
2.2. Другие злокачественные заболевания печени 18
1.3. Ткане-специфические транскрипционные факторы 20
1.3.1. Семейство HNF1, , ' 24
1.3.2. Семейство HNF3 25
1.3.3. Семейство HNF6 27
1.3.4. Семейство С/ЕВР 28
1.3.5. Семейство HNF 29
1.4. ГЯФ при патологиях 43
1.4.1. Диабет 43
1.4.2. ГЯФ при канцерогенезе 45
1.5. Другие транскрипционные регуляторы развития печени 47
1.5.1. FTF 47
1.5.2. Семейство GATA 47
1.6. Эпителиально-мезенхимальный переход 50
1.7. Апоптоз 53
1.8. Модель одноступенчатой прогрессии 55
1.9. Другие гены, изменение экспрессии которых ассоциировано с 57
гепатоканцерогенезом '
1.9.1. Остеопонтин 58
1.9.2. ЦиклинОІ 60 1.9.3 SLPI 60
1.9.4. Цитохезины 62
1.9.5. GILZ 62
1.9.6. Кавеолин 63
1.9.7. TGIF 64
1.9.8. РКА 65
1.9.9. Белки семейства TGFP 66
2. Материалы и методы 70
2.1. Коллекция мышиных гепатокарцином 70
2.2. Забор и хранение опухолей 70
2.3. Гистологические препараты 70
2.4. Выделение РНК 70
2.5. Реакция обратной транскрипции 72
2.6. Праймеры 72
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 75
2.8. Культуры клеток 77
2.9. бактериальные штаммы и плазмидные векторы 77
2.10. Трансформация клеток Е. Coli 78
2.11. Выделение плазмид 78
2.12. Трансфекция эукариотических клеток 79
2.13. Измерение активности гена люциферазы 80
2.14. Список использованных растворов и сред 81
3. Результаты исследования и их обсуждение 82
3.1. Сравнительная характеристика панели гепатокарцином мыши незавтисимого происхождения и разной степени дифференцировки
3.1.1. Гистологический анализ 82
3.1.2. Сравнительный анализ экспрессии генов в гепатокарциномах мыши 87
3.1.2.1. Анализ экспрессии печень-специфических генов 88
3.1.2.2. Анализ экспрессии генов, продукты которых вовлечены в ЭМП 95
3.1.2.3. Анализ экспрессии генов, продукты которых задействованы в регуляции апоптоза
3.1.2.4. Анализ экспрессии протоонкогенов, активация которых описана дляГК
3.1.2.5. Анализ экспрессии возможных маркеров гепатоканцерогенеза и генов, определяющих опухолевую прогрессию
3.1.2.6. Анализ экспрессии генов семейства TGF0 109
3.2. Сравнительный анализ экспрессии генов в опухолях печени человека 113
3.2.1. Анализ экспрессии генов в гепатокарциномах человека 113
3.2.2. Анализ экспрессии генов в других опухолях печени человека 119
3.3. Изучение регуляторного района гена HNF4al 129
Заключение 137
Выводы 140
Список Литературы 141
- Структура и функции печени
- Другие злокачественные заболевания печени
- Коллекция мышиных гепатокарцином
- Сравнительная характеристика панели гепатокарцином мыши незавтисимого происхождения и разной степени дифференцировки
Введение к работе
Гепатокарциномы (ГК) - опухоли, возникающие из зрелых гепатоцитов. Их возникновение ассоциировано с хроническими инфекциями вирусами гепатита В (HBV) или С (HCV), алкоголизмом, циррозом печени, а также связано с действием на организм химических канцерогенов и гепатоканцерогенов, таких как микотоксин или афлатоксин В1 [Rocken и McGrath, 2001].
Прогрессия гепатокарцином представляет собой многостадийный процесс, который приводит к приобретению опухолью злокачественного фенотипа. При этом развитие опухоли сопровождается снижением уровня дифференцировки, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии и приобретением способности к метастазированию. Опухолевая прогрессия ассоциирована с изменением паттерна экспрессируемых генов, в том числе последовательностей, кодирующих опухолевые супрессоры, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, а также -ткане-специфические белки. Определяющую роль в регуляции экспрессии , функциональных генов печени играет несколько семейств регуляторных белков, і получивших общее название гепатощггарных ядерных факторов (ГЯФ; Hepatocyte nuclear • factors - HNF): HNF1, С/ЕВР (СААТ/энхаксер связывающий белок a), KNF3, HNF4 и HNF6. Роль этих факторов в развитии и дифференцировке гепатоцитов активно изучается, однако их роль в гепатоканцерогенезе до сих пор исследована недостаточно полно.
Для решения этой проблемы ранее в лаборатории была использована экспериментальная система одноступенчатой прогрессии, в которой из медленнорастущей высокодифференцированной ПС мыши одномоментно вылепился злокачественный быстрорастущий низкодифференцированный вариант. Было показано, что дедифференцировка медленнорастущей гепатокарциномы сопровождалась подавлением активности большинства гепатощггарных ядерных факторов, а также снижением уровня экспрессии генов, определяющих эпителиальный фенотип гепатоцитов. Восстановление экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора HNF4a в культуре клеток быстрорастущей гепатокарциномы привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа. Было выдвинуто предположение, что скоординированная работа гепатоцитарных ядерных факторов играет ключевую роль в поддержании дифференцировки гепатоцитов, причемг HNF4a является ключевым регулятором этого процесса;
Для дальнейшего поиска генов; вовлеченных в прогрессию гепатокарцином, спектры экспрессии генов в гепатокарциномах мыши были исследованы с помощью гибридизации с кДНК микрочипами. Было выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых была более чем в 5 раз повышена во всех исследованных гепатокарциномах по сравнению с нормальной печенью, и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в дедифференцированной гепатокарциноме.
В настоящей работе мы выяснили, тсакие из закономерностей, выявленных на модели одноступенчатой "прогрессии гепатокарциномы,": имеют наиболее общий характер, а также определили частоту встречаемости изменения уровней транскрипции факторов;, выявленных при кДНК гибридизации, при прогрессии гепатокарцином.
В работе была использована серия химически индуцированных мышиных гепатокарцином из коллекции, полученной ранее в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН, а также образцы опухолей печени человека, полученные при резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН. Мы провели сравнительный анализ исследуемых опухолей и выявили гены, изменение экспрессии которых наиболее четко отражает- развитие злокачественного фенотипа.
Структура и функции печени
Печень — самая крупная железа организма. Основной функцией печени является детоксикация вредных веществ и продуктов обмена, а также преобразование питательных веществ, поступивших с током крови из кишечника. Печень обладает экзо- и эндокринными функциями. В качестве экзокринной железы печень секретирует желчь. Желчь содержит кислоты, соли, фосфолипиды, холестерин и пигменты. Соли желчных кислот и свободные желчные кислоты эмульгируют жиры; превращают жирные кислоты в водорастворимые формы (что необходимо для всасывания как самих жирных кислот, так и жирорастворимых витаминов A, D, Е и К); обладают антибактериальным действием. Эндокринная функция печени заключается в синтезе белков сыворотки крови, таких как альбумин и протромбин, синтез витаминов А и В12, а также белковых компонентов. липопротеинов. Кроме того, печень участвует в метаболизме всех веществ, всасьтаемых в кровь из пищеварительного тракта, здесь протекают реакции превращения аминокислот (дезаминирование и переаминирование).
Печень участвует в регуляции уровня глюкозы крови. Если этот уровень возрастает, клетки печени превращают глюкозу в гликоген и депонируют его. При снижении содержания глюкозы в крови гликоген расщепляется, и глюкоза поступает в кровоток. Помимо этого, печень способна осуществлять глюконеогенез: синтез глюкозы из других веществ, например аминокислот.
Еще одна функция печени - детоксикация. Лекарства и другие потенциально токсичные соединения могут превращаться в клетках печени в водорастворимую форму, что позволяет их выводить в составе желчи; они могут также подвергаться разрушению либо конъюгировать с другими веществами с образованием безвредных, легко вьтодящихся из организма продуктов. Некоторые вещества временно откладываются в клетках Купфера или в иных клетках печени. Клетки Купфера особенно эффективно удаляют и разрушают бактерии и другие инородные частицы. Благодаря им печень играет важную роль в иммунной защите организма.
Эмбриональная печень является- органом эритропоэза и местом созревания В-лимфоцитов, а взрослая участвует в кроветворении путем- экскреции продуктов распада гемоглобина и запасания железа, необходимого для синтеза нового гемоглобина.
Уникальным свойством печени является ее способность к регенерации. После частичной гепатэктомии (хирургического удаления 2/3 печени), она полностью восстанавливается, в основном за счет одновременного деления всех гепатоцитов.
Печень млекопитающих состоит из нескольких долей, окруженных общей соединительнотканной оболочкой. Структурно-функциональными единицами органа являются печеночные дольки. Они погружены в соединительную ткань, в которой располагаются печеночные триады. Каждая из триад представлена междольковыми веной, артерией и желчным выводным протоком. В соединительной ткани, окружающей дольку, располагаются поддольковые (собирательные) вены, лимфатические сосуды и нервные волокна.
Паренхима печени представлена в основном эпителиальными клетками — гепатоцитами, которые составляют 80% всех клеток печени. Это клетки многоугольной формы, с крупными сферическими ядрами, зернистой цитоплазмой, содержащей большое количество митохондрий, пероксисом и лизосом, с хорошо развитой эндоплазматической сетью. Внутри дольки гепатоциты создают определенную архитектуру, укладываясь в балки. Гепатоциты не образуют типичной базальной мембраны, характерной для эпителиальной ткани, но обладают другим важным свойством эпителиальных клеток -они поляризованы. Своей апикальной частью они образуют желчные капилляры путем смьпсания прилежащих друг к другу желобков на поверхности соседних клеток. В просвет желчного капилляра обращены микроворсинки, а его содержимое отделено от межклеточного пространства плотными соединениями и опоясывающими десмосомами. По желчным капиллярам секретируемая гепатоцитами желчь вытекает в выводные желчные потоки. Базальная часть гепатоцитов обращена в пространство Диссэ (перисинусоидальное пространство), образованное внеклеточным матриксом, мелкими сосудами и мезенхимными клетками. Именно через эту часть гепатоцита - за счет микроворсинок, обращенных в пространство Диссэ, идет наиболее интенсивный обмен с кровью. Гепатоциты образуют сложные комплексы межклеточных соединений, включающие опоясывающие десмосомы, плотные и щелевые контакты, которые обеспечивают прочную механическую связь и химические взаимодействия клеток печени. Кроме того, в состав печени входят другие пять типов клеток:
1. Эндотелиальные клетки, образующие выстилку синусоида. В их уплощенной цитоплазме имеются скопления мелких пор (ситовидные пластинки) и крупные отверстия, через которые просвет капилляров сообщается с пространством Диссэ.
2. Звездчатые макрофаги (клетки Купфера). Эти клетки располагаются в щелях между эндотелиальными клетками или распластываются по их поверхности. Они обладают ярко выраженной фагоцитарной активностью, очищая проходящую кровь от чужеродных частиц. Кроме того, клетки Купфера осуществляют захват и переработку старых нефункциональных клеток крови (в основном эритроцитов).
При этом разрушаются молекулы гемоглобина, их глобиновые цепи повторно утилизируются, а гемм расщепляется на железо и билирубин.
3. Перисинусоидальные липоциты (клетки Ито), находящиеся в пространстве Диссэ.
В покоящемся состоянии клетки Ито имеют несколько выростов с микроворсинками, охватывающих синусоидный капилляр. Именно покоящиеся клетки отличает присутствие в цитоплазме жировых капель. В патологических условиях (например, при повреждении печени) клетки Ито активируются: фенотип клетки и паттерн экспрессируемых генов изменяются, снижается содержание жировых запасов, клетка начинает активно вырабатывать компоненты внеклеточного матрикса, в том числе значительные количества коллагена, что приводит к формированию рубцовой ткани или развитию фиброза печени.
4. Pit-клетки. Это печень-специфические клетки-киллеры. Для их цитоплазмы характерно высокое содержание секреторных гранул различного цвета. Располагаются на прерывистой базальной мембране в периферическом и центральном отделе долек.
5. Холангиоциты - эпителиальные клетки, выстилающие желчные протоки [Ченцов, 2004]. Принято считать, что холангиоциты образуются из гепатобластов - клеток-предшественниц, общих для холангио- и гепатоцитов [Lemaigre, 2003; Leinaigre и Zaret, 2004; Shiojiri et al, 1991; Zhao и Duncan, 2005; Zaret, 2002]. Дифференцировка. гепатобласта начинается в момент формирования зачатков протоков и обусловлена действием целого спектра транскрипционных факторов. В процессе дифференцировки холангиоцита из бипотентного гепатобласта происходит подавление активности таких гепатоцитарных генов как АФП, альбумин, генов, кодирующих ферменты каскада превращения мочевины, а также гена С/ЕВРа (раздел 1.3.4); параллельно активируется экспрессия генов белков базальной подложки (ламинина) и специфических кератинов желчных протоков [Shiojiri et al, 2004]. В процессе дифференцировки гепатобласта в холангиоцит также принимают участие различные глюкокортикоиды, TGFa, HGF/scatter фактор. Взрослые холангиоциты обладают очень низким митотическим потенциалом за счет постоянной экспрессии таких факторов, как ингибитор циклин-зависимых киназ р27, генов bcl2, bcl-Xl и МС1-1 [Alvaro, 2007].
Другие злокачественные заболевания печени
Клетки различных тканей организма предназначены для выполнения особых, присущих только им функций, необходимых для жизнедеятельности всего организма. Эта избирательность функций осуществляется с помощью селективной экспрессии генов. Регуляторами такой селективной экспрессии служат транскрипционные факторы. Все транскрипционные факторы можно разделить на факторы, общие для большинства клеточных типов, и ткане-специфические факторы. Регуляция экспрессии кансдого гена осуществляется сложным взаимодействием различных факторов между собой и с регуляторными участками гена.
Транскрипционные факторы представляют собой транс-активационные ДНК-связывающие белки, взаимодействующие с цис-элементами последовательности ДНК регуляторного района гена. Связываясь со специфической последовательностью ДНК, они взаимодействуют с транскрипционной машиной и дают возможность осуществляться экспрессии данного гена. Чаще всего в этот процесс вовлечено множество разных типов факторов, связывающихся с ДНК, что позволяет проводить кооперативный контроль экспрессии. Кроме того, сложность механизмов регуляции усиливается за счет белок-белковых взаимодействий между транскрипционными факторами и коактиваторами или корепрессорами [Buendia, 2000].
Специфическое узнавание ДНК транскрипционным фактором осуществляется специальными ДНК-связывающими доменами транскрипционных факторов. Эти мотивы обладают характерной аминокислотной последовательностью и специфической трехмерной организацией, что позволяет классифицировать транскрипционные факторы. Трехмерная структура ДНК-связывающих мотивов определяет специфичность ДНК-белкового взаимодействия путем образования водородных и Вандерваальсовых связей. Существует несколько типов ДНК-связывающих доменов.
Гомеодомены. Принадлежат к большому классу белковых доменов, содержащих необходимый для контакта и узнавания ДНК структурный элемент спираль-поворот-спираль (helixurn-helix, "НТН"). Гомеодомены высоко консервативны. В состав гомеодомена входит N-концевой наиболее вариабельный по структуре участок («рука») и три а-спирали. Первая спираль и следующая за ней вторая располагаются антипараллельно и почти под прямым углом к третьей спирали, которая собственно является узнающей и взаимодействует со специфической последовательностью ДНК в большой бороздке. Структурному мотиву НТН соответствуют вторая и третья спирали. При образовании комплексов с ДНК происходят конформационные перестройки гомеодомена. К классу гомеодоменов также относят семейство ДНК-связьгвающих мотивов ONECUT, которые характеризуются наличием двух основных доменов: CUT-домена и атипичного гомеодомена.
Winged helix/forkhead домен представлен мономером в 100 аминокислот. ДНК-связывающий домен складывается в специальный НТН мотив и состоит из трех а-спиралей и двух характерных петель - «крыльев». Известно около 100 генов, содержащих этот домен [Kaestner et al, 2000].
«Цинковые пальцы». Один из наиболее распространенных ДНК-связывающих доменов. Различают два варианта строения «цинкового пальца»: первый (С2Н2 мотив) состоит из 30 аминокислот и содержит два цистеиновых и два гистидиновых остатка. Эти аминокислоты стабилизируют вторичную структуру домена, образуя комплекс с ионом цинка Zn . Другой тип домена (С4 мотив) содержит четыре цистеина, также связывающих Zn+2.
«лейциновая молния» (leucine zipper). Содержит характерное распределение нескольких лейцинов, отделенных друг от друга цепочками из семи аминокислот. Сама «молния» необходима лишь для димеризации транскрипционных факторов, а за специфическое связывание с ДНК отвечают примыкающие к ней последовательности основных аминокислот.
Фенотип гепатоцитов формируется совокупным действием ряда регуляторов, так называемых ГЯФ. Спектры экспрессии этих факторов ткане-специфичны, их наибольшие количества выявляются в печени. Сайты связывания гепатоцитарных ядерных факторов обнаружены в регуляторных районах большинства известных гепато-специфических генов.
В настоящее время выделяют пять семейств транскрипционных факторов печени. Это семейства HNF1, HNF3, HNF4, HNF6 и С/ЕВР. Каждое из семейств гепатоцитарных транскрипционных факторов включает несколько представителей. Кооперативная работа факторов всех пяти семейств необходима для правильного функционирования и поддержания уровня дифференцировки клеток печени. Образование гепатобластов из энтодермы на начальных этапах развития печени происходит за счет согласованной деятельности HNF3a и HNF3p [Duncan et al, 1998; Zaret, 2002; Lemaigre и Zaret, 2004]. GATA6 и HNF4al не играют ключевой роли в закладке печени, однако необходимы для ее дальнейшего роста и дифференцировки. Контроль над дифференцировкой гепатобластов в холангиоциты — эпителиальные клетки желчных протоков - лежит на HNF6 и HNFlp [Clotman et al, 2002].
Необходимо отметить, что ни один из перечисленных факторов не способен в одиночку индуцировать развитие гепатоцита из клетки негепатоцитарного происхождения; транскрипционная регуляция большинства печень-специфичных генов осуществляется за счет координированной работы нескольких упомянутых регуляторов. Необходимость такой согласованной регуляции подтверждается наличием многочисленных цис-элементов в промоторных участках печень-специфических генов [Kyrmizi et al, 2006; Cereghini, 1996; Costa et al, 2003]. Обнаружение функциональных сайтов связывания гепатоцитарных ядерных факторов в их собственных промоторах подтверждает существование сложной перекрестной регуляции активности этих факторов. Так, промоторы генов HNF4a и HNFla несут сайты связывания для этих трансфакторов; сайты HNF6 и HNFla обнаружены промоторе HNF4a7; для гиперэкспрессии гена HNF3P мыши необходимо одновременное участие HNF6 и C/EBPa [Kyrmizi et al, 2006; Odom et al, 2004].
Несмотря на то, что они являются ключевыми регуляторами развития и функционирования печени, гепатоцитарные ядерные факторы обнаружены и в других тканях: например, HNFla, HNF3a, HNF3P, HNF3y, HNF4a7 и HNF6 экспрессируются в Р-клетках поджелудочной железы [Buendia, 2000; Locker, 2001].
Сводные данные о спектрах экспрессии ГЯФ различных тканях представлены в Таблице 1 [по Abelev и Lazarevich, 2006].
Коллекция мышиных гепатокарцином
Небольшие образцы опухолей мышей помещали в 10% нейтральный формалин, в котором образцы хранились до приготовления срезов. Затем кусочки опухоли отмывали от формалина в проточной воде в течение суток и обезвоживали в батарее спиртов с повышающейся концентрацией. Полученные обезвоженные образцы помещали в парафин и затем делали микротомные срезы на стеклах, предварительно обработанных белком. Срезы размером 5 мкм получали в криостате фирмы Leitz, при температуре -15 С.
Полученные срезы окрашивали гематоксилином в течение 10 минут, отмывали проточной водой, докрашивали в течение минуты эозином и после проводки по спиртам заключали в канадский бальзам. Окрашенные препараты смотрели и фотографировали на микроскопе Axioplan-2 фирмы Zeiss.
Иллюстрации гистологических срезов, представленные в работе, были сделаны с помощью фотокамеры AxioCam MRc и программы Axiovision 4 (Zeiss).
Для выделения РНК из ГК замороженные образцы тканей измельчали в парах жидкого азота предварительно охлажденным и тщательно обработанным 96% спиртом
гомогенизатором Поттера. Далее тотальную РНК выделяли с помощью набора для выделения РНК фирмы Promega (SV Total RNA Isolation System):
1. К измельченному образцу добавляли 175 мкл холодного лизис-буфера, в котором проводили полную гомогенизацию полученного раствора.
2. К гомогенизированному раствору добавляли 350 мкл буфера для растворения; аккуратно покачивая пробирку с полученным раствором, перемешивали ее содержимое и нагревали пробирки со смесью при температуре +70 С в течение трех минут для полной денатурации белков.
3. После этого пробирки центрифугировали 10 минут при 12000 оборотов в секунду.
4. Супернатант, полученный в результате центрифугирования, отбирали в чистую пробирку и перемешивали с 200 мкл 95% этанола.
5. Полученную смесь - переносили в специальную колонку, содержащую пористую мембрану, и центрифугировали 1 минуту при 12000 оборотов.
6. Жидкость, прошедшую через колонку, удаляли, а в колонку добавляли 600 мкл раствора для промывки с последующим одноминутным центрифугированием, проводимым при тех же условиях.
7. Далее проводили очистку образцов от ДНК, для этого в колонку добавляли смесь, состоящую из 5 мкл ДНКазы.1, 5 мкл МпСЬ (0.09 М) и 40 мкл Yellow Core буфера. Колонки инкубировали 15 минут при комнатной температуре.
8. В колонку добавляли 200 мкл раствора, блокирующего ДНКазу и центрифугировали колонки в течение 1 минуты при 12000 оборотов.
9. Жидкость, прошедшую через колонку, удаляли, а в колонку добавляли 66 мкл раствора для, промывки с последующим одноминутным центрифугированием при тех же условиях, затем колонку повторно промывали 250 мкл того же раствора с последующим центрифугированием 2 минуты.
10. Жидкость удаляли, в колонку добавляли 100 мкл воды, очищенной от РНКаз, колонку помещали в чистую пробирку и центрифугировали, полученный раствор РНК замораживали при -20 С и использовали в дальнейшей работе.
Качество вьщеленной РНК определяли визуально, по результату проведенного электрофореза. Электрофорез РНК проводили на горизонтальных пластинах 1.0% агарозного геля, приготовленного на буфере ТАЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА (Sigma)) с добавлением бромистого этидия. В электрофорез брали 1 мкл раствора РНК и 1 мкл краски (1 мМ ЭДТА, 0.25%) бромфеноловый синий, 0.25% ксилен-цианол, 50% глицерин (Sigma) в НгО). Электрофорез РНК проводили в течение 3-5 минут в поле с напряженностью 2-5 В/см. Концентрацию РНК определяли по оптической плотности раствора, измеренной на спектрофотометре (Eppendorf BioPhotometr) при длине волны 260 нм. Об отсутствии примесей в образце судили по соотношению значений оптической плотности раствора при длине волны 260 и 280 нм.
Далее с полученных РНК ставили реакцию обратной транскрипции (ОТ). Для этого 3 мкг РНК смешивали с 0.1 мкг случайных гексамерных олигонуклеотидов ("Синтол"), денатурировали при 65 С и охлаждали на льду. В ОТ-смесь входили: 2 ед. обратной транскриптазы MMLV ("Promega"), соответствующий буфер, 2 мМ дитиотритола, 0.5 ед. ингибитора рибонуклеаз и смесь дезоксинуклеотид-трифосфатов, по 0.5 мМ каждого. Реакцию проводили при 42 С в течение 30 мин, затем останавливали реакцию инактивацией ревертазы при 94 С в течение 5 минут, добавляли 80 мкл НгО и использовали аликвоты для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) со специфическими праймерами.
Сравнительная характеристика панели гепатокарцином мыши незавтисимого происхождения и разной степени дифференцировки
Следующим этапом работы стало проведение анализа набора генов, экспрессируемых в панели мышиных гепатокарцином. Для этого из образцов опухолей была выделена тотальная РНК, панель соответствующих РНК была подвергнута обратной транскрипции (ОТ-реакция) с последующей полимеразной цепной реакцией (ГЩР). Для постановки ГЩР использовали специфические праймеры к кДНК исследуемых генов. Полученные данные подтверждали повторными ГЩР с независимо ревертированных кДНК.
В качестве контроля нормального уровня экспрессии генов в панели использовали РНК из нормальной печени взрослой мыши линии BDF (образец №1).
В реакцию обратной транскрипции брали равное количество РНК из каждого образца, однако для полного подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену HPRT, который равномерно экспрессируется во всех клетках. В зависимости от результатов этой реакции проводили дополнительное выравнивание панели, и после повторной реакции на HPRT приступали к исследованию уровней экспрессии интересующих нас факторов.
Данные ОТ-ПЦР анализа обобщены в Таблице 4 и представлены на Рисунках 6-11. На электрофорез продукты ПЦР наносили в обычном порядке (1-12). Достоверность того, что продукт ГЩР действительно является фрагментом исследуемого гена, подтверждали, основываясь на размере продукта: он должен был совпадать по размерам с рассчитанным по нуклеотиднои последовательности, фланкированной двумя участками посадки праймеров.
В первую очередь нами был проведен анализ спектров экспрессии печень-специфических генов. В эту группу попали ген альбумина, АФП и различные представители ГЯФ.
Оказалось, что экспрессия гена альбумина — основного маркера зрелых гепатоцитов - наблюдается лишь в нормальной печени и в тех пяти опухолях, которые при гистологическом анализе были признаны высокодифференцированными (Рисунок 6). Таким образом, наблюдалось соответствие между гистологическим и молекулярным методами оценки уровня дифференцировки образцов.
Несмотря на то, что эмбриональный сывороточный белок АФП является признанным маркером гепатокарцином [Abelev et al, 1963], экспрессия этого гена не наблюдалась в 4 из 11 опухолей панели (Рисунок 7). Примечательно, что все эти ПС были охарактеризованы как низкодифференцированные. Следует заметить, что повышение уровня АФП в крови пациентов с опухолями печени наблюдается на стадиях гепатоканцерогенеза, предшествующих той степени опухолевой прогрессии, которой достигают дедифференцированные варианты химически индуцированных ПС мыши. Логично предположить, что активация экспрессии этого эмбрионального белка является достаточно ранним событием гепатоканцерогенеза, а дальнейшая прогрессия опухоли сопровождается подавлением экспрессии его гена. Это явление может быть обусловлено нарушением функции ключевых транс-активаторов гена АФП (например, HNFla и FTF [Galarneau et al, 1996; Locker, 2001]), транскрипция которых подавлена в дедифференцированных опухолях. Не исключено также, что вклад в повышение уровня АФП в крови вносят не только опухолевые клетки, но и нормальные гепатоциты, синтезирующие этот белок в ходе регенерации печеночной ткани, окружающей опухоль. HNF4a предположительно связывается с респонсивными элементами более, чем 12% генов [Odom et al, 2004], экспрессируемых в гепатоцитах человека, продукты этих генов вовлечены в самые разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки. и роста. HNF4a активирует основные ферменты глюконеогенеза [Rhee et al, 2003] и синтеза желчных кислот [Hayhurst et al, 2001]; он необходим для регуляции обмена липидов, за счет активации экспрессии аполипопротеинов Apo-AII, Apo-CII, Аро-СШ, L-FABP и МТР. HNF4a играет значительную роль в формировании плотных Рисунок 6. Экспрессия генов, участвующих в дифференцировке печени, уровень экспрессии которых коррелирует с дифференцировочным статусом ГК МЫШИ. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам.
COUPF1 контактов: он активирует транскрипцию таких генов как окклюдин, клаудин-6, клаудин-7, JAM-A [Satohisa et al, 2005], а также плакофилина 2, десмоколлина 2 и коллагена XXI типа [Lucas et al, 2005], группой авторов [Spath и Weiss, 1997] даже было выдвинуто предположение, что HNF4a является морфогеном и способен индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход. Поскольку одной из транскрипционных мишеней этого фактора является ген р21 - ключевого ингибитора циклин-зависимых киназ, предполагается, что HNF4al способен подавлять клеточную пролиферацию. Кроме того, HNF4a признан ключевым регулятором дифференцировки гепатоцитов [Duncan et al, 1997; Thorgeirsson и Grisham, 2002; Hatzis и Talianidis, 2001; Zhong et al, 1994; Taravaris et al, 1994; Lazarevich et al, 2004]. Таким образом, функциональная активность HNF4a представляется важным фактором в жизнедеятельности гепатоцита. Мы задались целью выяснить, какие изменения в экспрессии гена HNF4a происходят в ходе гепатоканцерогенеза. Анализ экспрессии гена HNF4a в образцах ГК с помощью праймеров к последовательности гена, общей для всех изоформ, показал, что этот фактор экспрессирован во всех высокодифференцированных опухолях на том же уровне, что и в нормальной печени мыши (Рисунок 6). При этом экспрессии HNF4a в дедифференцированных образцах не было обнаружено. Это подтверждает ранее выдвинутое предположение [Lazarevich et al, 2004] о взаимосвязи активности гена HNF4ct и уровня дифференцировки клеток и важной роли репрессии этого фактора при прогрессии ГК.
