Введение к работе
1. 1.1. Актуальность проблемы
Отличительной особенностью карцином является то, что после возникновения трансформированного клона его рост долгое время может сдерживаться окружающей нормальной тканью. По мнению Ваинберга (Напапап and Weinberg 2000), нормализующими факторами могут быть взаимодействия трансформированных клеток с внеклеточным матриксом, межклеточные взаимодействия с нормальными клетками через щелевые контакты и выделяемые нормальными клетками цитокины. Необходимо подчеркнуть, что все эти факторы поддерживают дифференцированный нормальный фенотип исходной ткани.
При эволюции трансформированного клона - его прогрессии -накапливаются мутации, обеспечивающие максимальную пролиферацию клеток, отбираются варианты, независимые от регуляторных систем организма-хозяина, и способные жить на территориях негомологичных тканей, то есть инвазивные и метастазирующие (Абелев 2000). Одновременно наблюдается снижение дифференцировки карцином - как по их морфологии, так и по способности синтезировать тканеспецифические маркеры. Однако, при детальном исследовании коллекции гепатокарцином мышей было показано, что полного исчезновения печень-специфических маркеров в них никогда не наблюдается (Khramkova et al. 1963, Куприна 1965).
Феноменологически процесс антигенного упрощения в гепатокарциномах описан достаточно полно, в то время как молекулярные механизмы, лежащие;в его основе, изучены гораздо хуже, также как и механизмы, обеспечивающие способность карцином к ре-дифференцировке. Между тем, такие исследования важны как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Повышение уровня дифференцировки в карциномах (в том числе и в гепатоцеллюлярных карциномах (ГК) может увеличить чувствительность опухоли к терапии.
Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов, определяющих снижение дифференцировки при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином.
Тогда как для некоторых других тканей известны так называемые «мастер-гены», способные определять направление и уровень дифференцировки однозначным образом, фенотип печени формируется совокупным действием ряда регуляторов, так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ). Спектры экспрессии этих факторов тканеспецифичны, и их наибольшие количества обнаруживают в печени. Сайты связывания ГЯФ обнаруживают в регуляторных районах большинства известных гепатоспецифических генов. К ГЯФ относят пять семейств факторов: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6.
Экспрессия ГЯФ в печени взаиморегулируется, однако связи чрезвычайно сложны. В настоящее время четко показано, что многие из ГЯФ играют ключевые роли в раннем эмбриональном развитии (например, vHNF1 и HNF4 необходимы для формирования висцеральной энтодермы, a HNF3J} играет ключевую роль в закладке печени). Кроме того, недавно показано, что роль фактора HNF4 не ограничивается регуляцией тканеспецифичных генов, этот фактор также является эпителиальным морфогеном [Spath, 1998 #693]. Однако остается неясным, какова роль ГЯФ, и в частности, HNF4, при гепатоканцерогенезе.
В настоящей работе роль ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - была исследована на созданной в нашем институте коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки.
1.2. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является исследование роли ГЯФ в прогрессии гепатоцеллюлярных карцином и поиск возможных путей реверсии злокачественного фенотипа. Было запланировано решение следующих экспериментальных задач:
-
Выяснить, как экспрессия гена HNF4 соотносится с уровнем дифференцировки перевиваемых ГК мыши.
-
Проанализировать, какие изменения в экспрессии
опухолевых маркеров, ГЯФ, тканеспецифичных регуляторов и генов,
характерных для эпителиального фенотипа, произошли при скачкообразной прогрессии от медленнорастущей цифференцированной ГК к быстрорастущему недифференцированному варианту.
3. Исследовать роль HNF4 в произошедшей скачкообразной прогрессии.
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы Научная новизна настоящей работы в значительной мере зпределяется использованной системой. Впервые проведен анализ жспрессии ГЯФ и тканеспецифических регуляторов в ГК мыши in vivo. Сроме того, в работе охарактеризована полученная в нашем институте юдель, включающая медленнорастущую дифференцированную ГК и ;е быстрорастущий дедифференцированный вариант.
В работе показано, что уровень экспрессии гена HNF4 четко оррелирует с уровнем дифференцировки ГК мыши. При :качкообразной прогрессии от медленнорастущей іифференцированной ГК к быстрорастущему .едифференцированному варианту происходит полное подавление кспрессии гена HNF4. Продемонстрировано, что эта прогрессия опровождается подавлением экспрессии маркеров ифференцировки - сывороточного альбумина (СА), трансферрина ГФН) и транстиретина (ТТР), подавлением экспрессии генов оннексина 32 и Е-кадхерина, характерных для эпителиального юнотипа и активацией транскрипции пролокомотивного рецептора аминина аЗ интегрина. В ходе исследуемой прогрессии произошло олное подавление экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов NF1 и HNF6, и частичное подавление vHNF1, С/ЕВРа и HNF3y. роме того, снизились уровни транскрипции энтодермапьных ядерных (акторов GATA4 и GATA6 и изменились уровни экспрессии (анеспецифичных ядерных рецепторов FTF и COUP-TFI. Для хледования роли HNF4 в произошедших изменениях проведена габильная трансфекция клеточной культуры дедифферєнцированной іпатомьі векторами, экспрессирующими HNF4. Показано, что сзогенная экспрессия HNF4 активирует транскрипцию патоцитарных ядерных факторов HNF1 и HNF3y и маркера
дифференцировки ТФН, таким образом, под воздействием HNF4 восстанавливается часть гепатоспецифических синтезов. При экзогенной экспрессии HNF4 морфология клеток меняется в сторону эпителиальной и активируется транскрипция гена коннексина 32, таким образом, восстанавливается часть эпителиальных свойств. Нами впервые показано, что при экзогенной экспрессии HNF4 происходит подавление транскрипции ядерного рецептора COUP-TFI и активация транскрипции HNF3y.
Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию роли ГЯФ в прогрессии ГК и разработке возможных путей ре-дифференцировки ГК и реверсии злокачественного фенотипа.
1.4. Апробация работы
Диссертация апробирована 18 января 2002 года на совместной научной конференции лабораторий иммунохимии опухолей, цитогенетики, механизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза. Материалы диссертации докладывались на 27-ой Ежегодной Конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (27 th FEBS Annual Meeting), 2001 г. Лиссабон, Португалия и Специальной Конференции Американской Ассоциации Раковых Исследований «Мышиные модели Канцерогенеза» (American Association for Cancer Research Special Meeting "Mouse Models of Cancer"), 2000r., La Jolla, USA.
1.5. Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
