Введение к работе
Актуальность проблемы
Гепатокарцинома (ГК) является пятой по распространенности и третьей по уровню смертности опухолью в мире [Parkin et al., 2005]. Интенсивные эпидемиологические исследования последних лет позволили идентифицировать множество факторов риска возникновения ГК. Однако ключевые молекулярные механизмы, лежащие в основе гепатоканцерогенеза, остаются недостаточно изученными. В ходе прогрессии ГК происходят изменения активности внутриклеточных сигнальных каскадов и нарушения программы экспрессии гепатоспецифических генов. Одними из основных молекулярных изменений сигнальных путей, идентифицированных для ГК человека, являются нарушения активности Wnt/p-катенин сигнального пути, р53, МАРК, JAK/STAT, Ras и TGFp сигнального каскада [Aravalli et al., 2008].
TGFp является плейотропным цитокином, контролирующим различные свойства клеток организма, такие как пролиферация, подвижность, адгезия и дифференцировка. Генетические изменения компонентов TGFP сигнального каскада описаны для опухолей различного происхождения, но его роль в канцерогенезе противоречива, так как TGFP в зависимости от клеточного контекста может проявлять либо свойства опухолевого супрессора, либо онкогенные черты. Считается, что в нормальных клетках и на ранних этапах развития эпителиальных опухолей TGFp подавляет пролиферацию и индуцирует апоптоз, однако на более поздних стадиях прогрессии он индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), усиливает инвазию и метастазирование [Pardali et al., 2007].
Роль TGFp в возникновении, и развитии ГК также неоднозначна и недостаточно изучена. TGFpi является значимым ингибитором пролиферации нормальных гепатоцитов. При повреждении печени TGFpi сигнальный каскад активируется, останавливая рост регенерирующих гепатоцитов [Bissell et al., 1995]. С другой стороны, у пациентов с ГК уровень TGFpl в плазме крови и моче повышен [Tsai et al., 1997; Dong et al., 2008]. Иммуногистохимическими методами было показано, что TGFpi продуцируется в более чем 40% исследованных образцов ГК [Abou-Shady et al., 1999].
У млекопитающих выявлены три белка семейства TGFP (pi, р2 и рЗ), которые высоко гомологичны по аминокислотной последовательности. Однако при инактивации генов TGFp наблюдаются непохожие эффекты, что, по-видимому, свидетельствует о функциональном различии изоформ TGFP [Massague, 1998]. Большинство исследований, проводимых на гепатоцитах, сосредоточено на изучении роли TGFpi, однако наши результаты свидетельствуют о том, что при прогрессии гепатокарцином можетЧ
усиливаться транскрипция гена TGFP2. Роль такой активации в гепатоканцерогенезе в настоящее время не изучена.
Цель и задачи исследования Основной целью настоящей работы являлось изучение роли TGF02 в регуляции экспрессии генов, кодирующих ГЯФ и маркеры дифференцировки, а также исследование влияния TGFp2 на процессы, ассоциированные с прогрессией ГК. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Проанализировать изменения экспрессии гепатоспецифических генов и генов, продукты которых ассоциированы с прогрессией ГК, в культуре дифференцированной гепатомы человека HepG2 при обработке цитокинами TGFP1HTGFP2.
Провести трансдукцию линии гепатомы HepG2 лентивирусной конструкцией, экспрессирующей TGF[i2. Исследовать влияние гиперэкспрессии гена TGFp2 на кинетику пролиферации, клоногенную активность, уровни экспрессии гепатоспецифических генов; генов, ассоциированных с ЭМП и TGFp2-pecnoHCHBHbrx мишеней.
Исследовать вклад латентной и активной формы TGFp2 в регуляцию процессов, связанных с активацией TGFp сигнального пути. Провести трансдукцию лентивирусной конструкцией, экспрессирующей мутантную форму TGFP2, не подвергающуюся протеолитической деградации, и сравнить эффекты от аналогичной конструкции с нормальным вариантом TGFP2.
Разработать систему для подавления синтеза TGFP2 в культуре НЗЗ, полученной из низкодифференцированной быстрорастущей ГК мыши. Изучить изменения в кинетике пролиферации, способности к инвазии и профиле экспрессии гепатоспецифических генов в клетках НЗЗ с подавленной продукцией TGFP2.
Научная новизна и практическая значимость исследования
В представленной работе впервые проанализированы изменения экспрессии генов в дифференцированной гепатоме человека HepG2 при воздействии рекомбинантньгх цитокинов TGFpl и TGFp2. Обработка цитокинами привела к повышению экспрессии генов аЗ субъединицы интегрина, остеопонтина, фибронектина 1 и Pig-h3 (TGFP индуцируемого гена-ИЗ), активация которых ассоциирована с развитием злокачественного
фенотипа ГК. Кроме того, было показано, что действие обоих цитокинов приводит к снижению экспрессии генов, кодирующих ГЯФ, которые необходимы для поддержания дифференцировки гепатоцитов.
Мы показали, что экзогенная экспрессия TGFp2 в культуре HepG2 вызывает снижение экспрессии ключевых регуляторов гепатоцитарной дифференцировки С/ЕВРа и HNF4a, а также к повышению скорости пролиферации и клоногенной активности этих клеток.
Впервые установлено, что подавление продукции TGFP2 в культуре клеток низкодифференцированной гепатомы НЗЗ индуцирует реэкспрессию эндогенных HNF4a и С/ЕВРа. Кроме того, подавление продукции TGFP2 привело к снижению подвижности и скорости пролиферации этих клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что TGFP2 регулирует экспрессию генов, продукты которых контролируют дифференцировку гепатоцитов, и влияет на такие важные свойства клеток, как пролиферация и подвижность. Эти данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия TGFP2, наблюдаемая в дедифференцированных ГК мыши и человека, способствует развитию злокачественного фенотипа опухолевых клеток. Кроме того, полученные результаты демонстрируют возможность регуляции сети ГЯФ и дифференцировки клеток гепатоцитарного происхождения за счет изменения активности нетканеспецифических сигнальных путей. Эти факты способствуют расширению представлений о фундаментальных основах опухолевого роста и прогрессии злокачественных новообразований. Возможность восстановления дифференцированного фенотипа гепатоцитов при ингибировании TGFP сигнального пути представляется перспективным подходом для разработки новых методов прогноза и терапии ГК. Анализ TGFp-индуцируемых внутриклеточных механизмов будет способствовать развитию методов эффективного подавления продукции TGFP для терапии эпителиальных опухолей различного происхождения.
Апробация работы
Диссертация апробирована 16 февраля 2009 г на совместной научной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов и механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на международном конгрессе «Исследования заболеваний печени» Европейской ассоциации по исследованию печени (Копенгаген, 2009), международной конференции «Ядерные рецепторы и заболевания печени» (Вена, 2009), конференции «Молекулярные механизмы сигнальной трансдукции и рака» Европейской Федерации Биохимических обществ (FEBS) (Спецес, 2007), на 13
съезде Европейской Конференции по раковым исследованиям (ЕССО) (Париж, 2005), и на конференции «Клеточная сигнализация» Европейской Федерации Биохимических обществ (FEBS) (Дубровник, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах и 10 тезисов международных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 30 рисунков, 1 таблицу. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 231 источник, в том числе 9 в отечественных рецензируемых изданиях.
Похожие диссертации на Роль трансформирующего ростового фактора (TGF) в прогрессии гепатокарцином
![Роль индукторов апоптоза TGF [B] 1 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором](/i/i/4228/392260.png "Роль индукторов апоптоза TGF [B] 1 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором Кирсанов Алексей Николаевич")
