Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Современные представления о гормональной регуляции роста опухолей молочной железы и возникновении гормонорезистентности 10
1.2 Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы первого и второго типа в опухолях молочной железы. Гормональная регуляция экспрессии VEGF 17
1.3 Роль антиапоптотических сигнальных белков Akt и Вс1-2 при раке молочной железы. Механизмы взаимосвязи Akt и Вс1-2 с гормональной регуляцией роста опухолей молочной железы 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1 Культивирование клеток. Получение гормононезависимой линии клеток рака молочной железы человека 49
2.2 Получение клеточных экстрактов. Иммуноблоттинг 50
2.3 Характеристика больных 52
2.4 Получение и обработка тканей 54
2.5 Иммуноферментное определение содержания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAktnBcl-2 56
2.6 Определение рецепторов стероидных гормонов 57
2.7 Статистический анализ данных 59
Результаты и их обсуждение 60
Глава 3. Активация фактора роста эндотелия сосудов в гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы 61
3.1 Характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы 61
3.2 Гормональная регуляция экспрессии VEGF и Вс1-2 в клетках рака молочной железы 64
3.3 Экспрессия VEGF и его рецептора второго типа в гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы 67
3.4 Влияние ингибитора VEGF на рост клеток рака молочной железы и активность митогенных путей (ERK1 и ERK2) 70
3.5 Экспрессия и активность Akt в гормононезависимой и родительской линии клеток рака молочной железы 72
Глава 4. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов, его рецепторов первого и второго типа, активированной протеинкиназы акт и bcl-2 в первичных опухолях больных раком молочной железы 74
4.1. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы в первичных опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы 74
4.2 Активированная протеинкиназа Akt и Вс1-2 в первичных опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы 86
4.3 Взаимосвязь митогенных и антиапоптотических факторов при РМЖ 98
Глава 5. Заключение 103
Выводы по
Литература 112
- Современные представления о гормональной регуляции роста опухолей молочной железы и возникновении гормонорезистентности
- Культивирование клеток. Получение гормононезависимой линии клеток рака молочной железы человека
- Характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы
- Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы в первичных опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин [6, 69, 88]. Несмотря на значительный прогресс в его лечении, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов, уровень смертности от РМЖ остается достаточно высоким [6, 13, 20, 88]. Одним из факторов, определяющих высокий уровень смертности больных РМЖ, является существование резистентности опухоли к различным видам терапии [8, 13, 20]. В этой связи не теряет актуальности изучение молекулярных механизмов развития резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухоли к лекарственным препаратам in vivo.
Более 30 лет антиэстроген тамоксифен (Nolvadex, ICI 46474) успешно применяется для лечения больных гормонозависимым РМЖ [4, 13, 20, 54, 61, 83]. Тамоксифен выбран в качестве основного препарата, применяемого в эндокринной терапии первой линии больных РМЖ в постменопаузе, благодаря относительно слабым побочным эффектам и низкой общей стоимости лечения [20]. Данные ретроспективных клинических исследований свидетельствуют о том, что использование тамоксифепа на ранних стадиях РМЖ значительно увеличивает общую выживаемость и способствует торможению опухолевого роста [20, 88]. Однако применение тамоксифепа осложнено существованием форм РМЖ, резистентных к антиэстрогенам de novo или приобретающих гормональную резистентность в процессе терапии [2, 83].
В настоящее время в клинической практике используется только два молекулярно-биологических маркера чувствительности опухоли к эндокринной терапии - рецепторы эстрогенов (РЭ) и рецепторы прогестерона
(РП). По некоторым данным, существует достоверная прямая корреляция между уровнем рецепторов стероидных гормонов в опухолевой ткани и чувствительностью больного к терапии тамоксифеном [20]. К сожалению, данные исследования РЭ и РП не всегда точно отражают чувствительность РМЖ к гормонотерапии. Известно, что только 75% опухолей положительных по рецепторам эстрогенов и прогестерона (РЭ+/РП+) чувствительны к тамоксифену [88].
В связи с этим особую актуальность в клинической практике
приобретают исследования дополнительных клеточных маркеров,
характеризующих чувствительность опухолевых клеток к гормонотерапии.
Среди возможных маркеров эффективности гормональной терапии особое
место занимает фактор роста эндотелия сосудов (VEGF/VEGF-A). Уже не
вызывает сомнения тот факт, что уровень VEGF - важная характеристика
опухолевого ангиогенеза - процесса развития новых сосудов в опухоли [70].
Кроме того, данные исследований последних лет свидетельствуют о
возможной взаимосвязи уровня VEGF как с содержанием рецепторов
стероидных гормонов в опухоли [32], так и с эффективностью адъювантной
гормонотерапии больных РМЖ [121]. В литературе, тем не менее, не
существует единого мнения о роли VEGF и его рецепторов (VEGFR-1 и
VEGFR-2) в оценке прогноза гормональной чувствительности РМЖ [25, 120,
121]; также недостаточно изучен вопрос о взаимосвязи VEGF и его
нижележащих эффекторов с классическими показателями
гормонозависимости опухоли (РЭ и РП).
Разработка экспериментальных моделей развития гормональной резистентности РМЖ является перспективным направлением экспериментальной онкологии, расширяющим представления об устойчивости опухоли к антиэстрогенам. За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих
гормононезависимый рост опухолевых клеток: активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др. [8, 54, 89, 148]. Известно, что одним из возможных механизмов гормональной резистентности РМЖ является активация сигнальных путей факторов роста. В частности, экспериментальные данные последних лет свидетельствуют о возможном участии в поддержании роста опухолевых клеток сигнальных путей ключевого ангиогенного белка - VEGF [56, 84, 113, 186]. Интерес к этой проблеме обострился в последнее время в связи с данными некоторых исследовательских групп об экспрессии в опухолевых клетках рецепторов VEGF [30, 84, 188]. Коэкспрессия VEGF и его рецепторов в опухолевых клетках может свидетельствовать об участии этих белков в аутокринной регуляции роста опухоли, однако механизм подобной регуляции и его роль в поддержании гормононезависимого роста опухоли в настоящее время изучены недостаточно. Все это и определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы: изучение роли VEGF-зависимых сигнальных путей в развитии гормональной резистентности рака молочной железы.
Задачи исследования:
Получение и характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы человека в условиях in vitro.
Анализ экспрессии Bcl-2, VEGF, VEGFR-2 в гормононезависимых и родительских клетках MCF-7.
Оценка возможной роли VEGF в регуляции роста гормононезависимых клеток рака молочной железы.
Анализ экспрессии и активности Akt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в гормононезависимых и родительских клетках MCF-7.
5. Иммуноферментное исследование содержания VEGF, VEGFR-1,
VEGFR-2, pAkt, Bcl-2 в первичных опухолях больных раком
молочной железы и изучение взаимосвязи этих показателей с
основными клинико-морфологическими особенностями
заболевания (в том числе показателями гормоночувствительности опухоли). Научная новизна: впервые параллельно исследовано изменение экспрессии ключевого фактора неоваскуляризации рака молочной железы VEGF, его рецепторов и антиапоптотических факторов Akt и Вс1-2 в процессе развития гормональной резистентности клеток рака молочной железы в культуре, а также оценена взаимосвязь этих показателей с клинико-морфологическими особенностями рака молочной железы на клиническом материале. Впервые показано, что развитие гормональной резистентности сопровождается увеличением экспрессии VEGF и его рецептора второго типа. Продемонстрировано, что пролиферация как родительских клеток РМЖ, так и гормононезависимой сублинии, находится под частичным аутокринным контролем со стороны сигнального пути VEGF. При исследовании первичных опухолей молочной железы показано, что уровень VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и антиапоптотического белка Вс1-2 достоверно выше в опухоли по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями. Впервые установлено, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивается в РП-отрицательных опухолях. В 48% опухолей обнаружено повышение активности Akt, которая имеет тенденцию к увеличению в РЭ-положительных и РП-отрицательных опухолях. В целом, впервые продемонстрировано участие сигнального пути VEGF в аутокринной регуляции и поддержании гормононезависимого роста опухолей молочной железы.
Практическая значимость работы: результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что развитие гормональной
резистентности РМЖ сопровождается активацией VEGF-зависимых сигнальных путей. Некоторые из нижележащих эффекторов VEGF являются новыми перспективными маркерами гормонорезистентности рака молочной железы и возможными мишенями для ее преодоления.
Основные положения, выносимые на защиту: активация сигнальных путей VEGF как механизм, поддерживающий гормононезависимый рост клеток рака молочной железы.
Современные представления о гормональной регуляции роста опухолей молочной железы и возникновении гормонорезистентности
Гормонорезистентность рака молочной железы. Сигнальные пути рецепторов стероидных гормонов. Эстрогены - стероидные гормоны, играющие исключительно важную роль в регуляции роста, дифференцировки и метаболизма клеток молочной железы [2, 13, 20, 88]. Кроме того, благодаря способности эстрогенов значительно стимулировать рост клеток молочной железы, эти гормоны играют ключевую роль в развитии рака молочной железы (РМЖ). Уже более 30 лет основным препаратом для проведения эндокринной терапии гормонозависимого РМЖ является антиэстроген тамоксифеп (ICI 46474) [14, 15, 20]. Тамоксифеп относят к классу SERM (selective estrogen receptor modulators) [57, 88], соединений, в определенных условиях выполняющих роль агонистов эстрогенов и модулирующих действие гормона в клетках-мишенях (иначе группу SERM также называют «агонисты/антагонисты эстрогенов»). Этот препарат можно считать «золотым стандартом» в лечении больных РМЖ [17,18, 88].
К сожалению, далеко не во всех случаях опухоль молочной железы обладает высокой чувствительностью к терапии антиэстрогенами (в частности, тамоксифеном), что определяет низкий терапевтический эффект лечения. Основной причиной такой неэффективности эндокринной терапии является гормональная резистентность опухоли - устойчивость опухоли к действию гормональных цитостатических препаратов. Гормонорезистентные опухоли возможно разделить на две группы: опухоли с первичной гормонорезистентностью (гормонорезистентностью de novo) и опухоли с приобретенной гормонорезистентностыо [54, 148]. К первой группе относят опухоли, у которых биологический механизм гормональной резистентности сформировался до проведения терапии, то есть de novo. Во вторую группу входят опухоли, утратившие чувствительность к цитостатическому действию антиэстрогенов во время проведения эндокринной терапии [54, 148]. Возникновение у больных РМЖ первичной и приобретенной гормонорезистентности связано с различными молекулярными механизмами, поддерживающими рост злокачественных клеток [54, 148].
Значительные успехи в понимании механизмов гормонорезистентности РМЖ стали возможны благодаря активным исследованиями в конце XX века стероидных гормонов и их роли в поддержании роста опухолевых клеток [3, 54]. Известно, что действие стероидного гормона на клетку опосредовано рецепторами [54, 89]. В настоящее время описано два вида рецепторов эстрогенов (РЭ): РЭ типа а (РЭа) (продукт гена ESR1) и РЭ типа Р (РЭр) (продукт гена ESR2); клетки рака молочной железы синтезируют обе формы рецепторов [54, 128, 184]. Между РЭа и РЭр выявлена достаточно высокая гомология [128], однако роли РЭа и РЭр в регуляции роста клеток РМЖ противоположны: через РЭа поступает пролиферативный сигнал в клетку, а функции РЭр, по-видимому, связаны с торможением роста опухоли [54, 171]. Функциональные особенности РЭр в настоящее время исследованы недостаточно. В дальнейшем в тексте главным образом рассматриваются свойства и функции РЭа (далее рецепторы эстрогенов или РЭ), либо, где это существенно, указаны сведения о наличии в клетках рецепторов эстрогенов типа р (РЭР).
Рецепторы эстрогенов являются ядерными транскрипционными факторами, участвующими как в геномных, так и негеномных взаимодействиях. Во-первых, РЭ способны связываться с эстроген-чувствительными элементами (ERE) на промоторах генов-мишеней (это так называемый «классический» геномный сигнальный путь РЭ); во-вторых, РЭ регулируют активность таких транскрипционных факторов, как АР-1, SP-1, Fos и др. [8, 20, 54, 64] - это взаимодействие называют «неклассическим» геномным сигнальным путем РЭ. Кроме того, РЭ способны участвовать в негеномных взаимодействиях: образовывать комплексы с другими сигнальными белками (PI3K, Akt, p90rsk, ERK1, ERK2, р38, IGF1-R, src и др.) [148]. Эти аспекты регуляции РЭ особенно активно исследуются в последние годы. Геномные и негеномные сигнальные пути РЭ - это сложная многоступенчатая система реакций.
Оказалось, что неэффективность тамоксифена во многих случаях не связана с отсутствием или утратой во время терапии основной мишени этого препарата - рецепторов эстрогенов. Этот факт подтверждается результатами клинических исследований: только небольшая (от 17 до 28%) группа больных с приобретенной гормонорезистентностью к тамоксифену утрачивает РЭ [85, 96]; по данным Bachleitner-Hofmann Т. и соавторов около 80% гормонорезистентных опухолей молочной железы (контралатеральный РМЖ) сохраняют РЭ после проведения курса адъювантной терапии тамоксифеном [31]. In vitro исследования Brunner N. и др. показали, что резистентные к действию тамоксифена клетки РМЖ в некоторых случаях не утрачивают рецепторы эстрогенов [45]. Таким образом, рецепторположительный (РЭ+) фенотип опухолевых клеток достаточно распространен среди форм гормонорезистентного РМЖ.
Культивирование клеток. Получение гормононезависимой линии клеток рака молочной железы человека
Клетки рака молочной железы человека линии MCF-7, описанной впервые в 1973 году [44], были получены из коллекции клеточных культур ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 5%-ную эмбриональную сыворотку телят («Gibco») и гентамицин (50 ед/мл) («Рапесо», Россия) при 37С в атмосфере с 5% С02. Гормононезависимая сублиния была получена в результате длительного, в течение 2 мес, культивирования клеток родительской линии MCF-7 в стандартной среде в присутствии 10"6М тамоксифена. Полученную сублинию клеток назвали MCF-7/T. В дальнейшем рост клеток MCF-7/T поддерживали в среде без тамоксифена в течение 20-50 пассажей.
В работе использовали краткосрочное (в течение 3 суток) культивирование клеток в среде DMEM без фенолового красного («Рапесо», Россия), содержавшей 5%-ную бесстероидную эмбриональную сыворотку. Бесстероидную сыворотку получали в результате обработки эмбриональной сыворотки активированным углем, покрытым декстраном Т-60 (Serva), по модифицированной методике Provost P.R. [146]. Для этого 100 мл эмбриональной сыворотки («Gibco») инкубировали с 1 г активированного угля и 2 мл 5 % водного раствора декстрана Т-60 в течение 16 ч. при +4С (во время инкубации сыворотку интенсивно помешивали). Затем смесь центрифугировали 20 мин, 10000 об/мин при +4С (центрифуга «К-24», Германия) и удаляли осажденный уголь. Повторную инкубацию сыворотки с активированным углем, покрытым декстраном, проводили при 20-25С в течение 2,5 ч (во время инкубации сыворотку интенсивно помешивали). Затем сыворотку дважды центрифугировали (20 мин, 10000 об/мин при +4С) и многократно (5-7 фильтраций) фильтровали на стерильных мембранах с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм до полного удаления остатков угля.
МТТ-тест. При определении скорости роста клеток был использован стандартный МТТ-тест [106, 124], основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется на спектрофотометре.
Изучение влияния ингибитора VEGF на рост клеток РМЖ. В экспериментах по исследованию влияния ингибитора VEGF на рост клеток использовали растворимый фрагмент VEGFR-1/Flt-l (химера sFlt-1/Fc) (R&D, США), снижающий биологическую доступность VEGF в культуралыюй среде. Клеточные линии MCF-7/T и MCF-7 культивировали в присутствии sFIt-1/Fc (100 нг/мл среды) в течение 2 суток и оценивали количество клеток с помощью МТТ-теста.
Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором (10 мМ Tris-HCl рН7,5; 0,14 М NaCl), снимали с чашек и ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. Затем полученную суспензию центрифугировали 5 мин. при 3 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость сливали и к осадкам добавляли 50 мМ лизирующий Tris-HCl-буфер (рН=7,5) содержавший 1%-ный нонилфеноксиполиэтоксиэтанол (NP-40), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол (DTT), 1мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0,1 мМ Na ортованадат и 1%-ный апротинин. Осадки суспендировали в лизирующем буфере и оставляли на 30 минут на льду при +4С. Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 14 тыс. об/мин. и +4С (центрифуга Eppendorf 5417R). После центрифугирования в полученных клеточных экстрактах измеряли концентрацию белка с помощью метода Брэттфорда [41]. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре фирмы «Beckmann» (при длине волны 595 нм). Клеточные экстракты хранили при -70С до проведения дальнейшего анализа.
Иммуноблоттинг. Электрофорез образцов, содержавших по 60-80 мкг белка, проводили в 10%-ном SDS-полиакриламидном (Sigma) геле в течение 5 часов [187]. Стабилизация по напряжению 90 В. Затем белки переносили на нитроцеллюлозпые фильтры (Amersham BS) методом электропереноса, как описано ранее [187].
Для иммуноблоттинга использовали антитела к РЭ (Е-1396; Sigma-Aldrich), VEGFR-2 (goat AF357; R&D Systems), ERK1, ERK2 и phospho-ERKl, ERK2 (New England Biolabs), Akt (Upstate, #05-591) и phospho-Aktl/PKBa (Ser473) (Upstate, #07-310). Для оценки эффективности нанесения экстрактов на нитроцеллюлозпые фильтры использовали метод окрашивания раствором Понсо [41] и иммуноблоттинг с антителами к Р-актину (АС-15; Sigma-Aldrich). Для предотвращения неспецифической сорбции фильтры обрабатывали 5% раствором обезжиренного молока (Nestle), затем инкубировали с первичными антителами в течение 3 ч при комнатной температуре. Фильтры отмывали, инкубировали 1,5 ч с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Amersham BS), и образовавшиеся комплексы проявляли хемилюминесцентным реагентом (Amersham BS).
Характеристика гормононезависимой сублинии клеток рака молочной железы
Эксперименты проводили на гормонозависимых клетках рака молочной железы человека линии MCF-7 и сублинии клеток MCF-7/T, полученной как описано в главе «Материалы и методы». Как показано на рис.3, сублиния клеток MCF-7/T в стандартных условиях культивирования проявляла тенденцию к более активному росту по сравнению с родительской клеточной линией MCF-7.
Для оценки влияния 17Р-эстрадиола (Е2) и тамоксифена на скорость роста клеток родительской и резистентной линии клетки пересевали и инкубировали в течение 3 суток с 10"9 М Е2, 10"6М тамоксифена или в чистой среде (контроль) и определяли количество клеток с помощью стандартного МТТ-теста (рис.4).
Количество клеток определяли с помощью МТТ-теста на 3 сутки роста и выражали в процентах (за 100% принято количество клеток, культивированных в отсутствие гормона). Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов.
Установлено, что по сравнению с родительской линией MCF-7 клетки MCF-7/T характеризуются снижением чувствительности как к рост-стимул ирующему действию Е2 (10"9 М), так и к цитостатическому действию тамоксифена (10"6М).
Как уже отмечалось, некоторые формы гормонорезистентности РМЖ характеризуются нарушениями в экспрессии и связывающей способности РЭ [54, 148]. Определение уровня экспрессии РЭ проводили методом иммуноблоттинга как описано в главе «Материалы и методы». Было обнаружено незначительное снижение уровня РЭ в сублинии MCF-7/T по сравнению с родительскими клетками (рис.5). Для оценки эффективности нанесения экстрактов на нитроцеллюлозные фильтры использовали иммуноблоттинг с антителами к актину.
Аналогичные изменения были обнаружены при анализе связывающей способности РЭ в клетках MCF-7 и MCF-7/T. Связывающую способность РЭ оценивали с помощыо стандартного радиолигандпого метода. Расчет количества мест связывания гормона с клетками проводили по формуле, приведенной в главе «Материалы и методы». Выявлено достоверное снижение (на 39%) связывания Е2 с клетками MCF-7/T по сравнению с клетками MCF-7: (3,7±0,4) 105 и (6,1±0,5) 105 мест связывания на клетку, соответственно (Р 0,05).
Сохранение экспрессии РЭ в некоторых гормононезависимых сублиниях РМЖ отмечают и другие авторы [45]. По данным Brunner N. и соавторов в фулвестрант-резистентной линии РМЖ определяется экспрессия РЭ. Интересно, что в описанной Brunner N. сублинии при резистентности к чистому антиэстрогену фулвестранту (препарат группы SERD) наблюдалась перекрестная резистентность к тамоксифену (препарат группы SERM).
Учитывая, что рост сублинии клеток MCF-7/T характеризовался снижением чувствительности к гормонам и антигормонам, в дальнейших экспериментах оценивали в этой клеточной линии экспрессию двух белков (VEGF и Вс1-2), регулируемых эстрогенами. С помощью стандартного иммуноферментного анализа (ELISA) были определены уровни VEGF и Вс1-2 в клетках MCF-7 и MCF-7/T, а также проанализирована регуляция их экспрессии Е2 и тамоксифеном. Родительские и гормононезависимыс клетки культивировали с Е2 (10"9 М) или тамоксифеном (10"6М) в течение 2 суток. Затем клетки снимали с чашек в физиологическом растворе и использовали для приготовления клеточных экстрактов, как описано в главе «Материалы и методы».
Влияние 17Р-эстрадиола и тамоксифена на уровень экспрессии ВсІ-2 в клетках линий MCF-7 и MCF-7/T. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов.
Аналогичные тенденции были обнаружены для уровня Вс1-2 (рис.7). В родительских клетках экспрессия Вс1-2 возрастала на 67% в присутствии 17р-эстрадиола и снижалась на 57% в присутствии тамоксифена. Напротив, в сублинии MCF-7/T эти изменения составили 3% и 17%, соответственно (рис.7).
Роль гормонов в регуляции VEGF и Вс1-2 в РМЖ активно исследуется в последние годы. Полученные результаты согласуются с данными ряда исследований in vitro и in vivo об индуцирующем воздействии эстрогенов и ингибирующем действии антиэстрогенов на экспрессию этих генов в РМЖ [56, 99, 101, ПО, 141, 175]. С другой стороны, наши наблюдения не согласуются с данными Mirkin S. и соавторов об отсутствии гормональной регуляции VEGF в РМЖ [126]. По их данным, 17Р-эстрадиол не влияет на уровень мРНК VEGF в клетках MCF-7. К сожалению, анализ уровня белка VEGF в клетках MCF-7 этими авторами не производился [126]. В целом, продемонстрированное в настоящей работе отсутствие изменений в экспрессии VEGF и Вс1-2 при действии 173-эстрадиола или тамоксифепа на клетки MCF-7/T свидетельствует о значительном снижении ответа этих клеток на эстрогены/антиэстрогены по сравнению с родительской линией MCF-7.
Как отмечалось выше, в полученной гормононезависимой сублинии клеток РМЖ сохраняется экспрессия и лиганд-связывающая способность РЭ, но при этом значительно снижен ответ на эстрогены/антиэстрогены (как по скорости роста, так и по экспрессии генов, регулируемых эстрогенами). В настоящее время описано несколько возможных изменений в сигнальных путях опухолевых клеток, приводящих к снижению чувствительности к гормонам. Некоторые авторы рассматривают в качестве возможной причины снижения ответа опухоли на эстрогены/антиэстрогены активацию в опухолевых клетках сигнальных путей факторов роста. За последние годы на клеточных моделях in vitro и in vivo показано, что активация EGF/EGFR [79, 102, 134, 135], IGF-I/IGFR [86, 167], HER-2/neu [37, 54, 115] в опухолевых клетках может приводить к снижению чувствительности к гормонам. Кроме того, ряд авторов описывают лиганд-независимую активацию рецепторов эстрогенов [49, 54, 168, 172]: этот механизм основан на взаимодействии РЭ с PI3K, Akt, HER-2/neu и другими сигнальными молекулами, что может способствовать значительному снижению чувствительности клеток к эстрогенам/антиэстрогенам. Целью следующего этапа работы явилось исследование роли VEGF - ангиогенного и митогенного фактора, конститутивно экспрессируемого клетками MCF-7/T, в развитии и поддержании гормональной резистентности клеток РМЖ.
Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы в первичных опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы
У 39 больных было проведено определение VEGF, его рецепторов первого и второго типа (VEGFR-1, VEGFR-2) в опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы. Определение уровня исследуемых показателей производили с помощью стандартных наборов реактивов для иммуноферментного анализа. Соответствующие названия коммерческих наборов реактивов приведены в главе «Материалы и методы».
Среднее и медианное содержание VEGF в опухолях молочной железы было достоверно выше, чем в гистологически неизмененных тканях (р 0,01). Мы обнаружили также достоверное увеличение уровня VEGFR-1 (р 0,05) и VEGFR-2 (р 0,01) в опухолевой ткани. Содержание VEGFR-1 в опухолях молочной железы было повышено у 28 из 39 обследованных больных (72%) по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой. Сравнивая уровни VEGFR-2 в опухолевой и нормальной тканях, мы обнаружили увеличение его содержания в опухоли у 82% больных.
Отмечена слабая, но достоверная прямая корреляция между уровнями VEGFR-1 и VEGF в опухолевой ткани (рис.14) (г=0,33; р 0,05). Уровни VEGFR-2 и VEGF в опухоли также коррелировали между собой (рис.15) (г=0,47; р 0,05), однако взаимосвязи между содержанием двух типов рецепторов в опухолевой ткани не наблюдалось.
Дальнейший анализ включал оценку содержания VEGF, VEGFR-1 и VEGFR-2 в ткани рака молочной железы в зависимости от основных клинико-морфологических характеристик. Учитывая асимметричность распределения значений изучаемых показателей в группах, полученные данные представлены в виде медиан и диапазонов нижнего (25%) и верхнего (75%) квартилей, а оценка достоверности различий между группами проведена с помощью непараметрического статистического анализа [16].
Как видно в таблице, прослеживается тенденция к увеличению содержания VEGF и VEGFR-l в старших возрастных группах, однако взаимосвязь этих показателей не достигает статистической значимости. Уровень VEGFR-2 не взаимосвязан с возрастом больных. Также содержание VEGF и его рецепторов в опухолевой ткани достоверно не зависит от менопаузного статуса обследованных больных (табл.6).
Известно, что клиническая стадия является наиболее значимым прогностическим фактором при раке молочной железы. К сожалению, пока не набран репрезентативный материал по всем стадиям заболевания, поэтому больных I и Па стадии без метастазов в лимфатических узлах мы объединили в одну группу (15 больных). Другие группы составили, соответственно, 12 больных - ПЬ, 7 больных - Ша стадия, 5 больных - ШЬ стадия. Результаты определения содержания VEGF, VEGFR-1 и VEGFR-2 в ткани рака молочной железы в зависимости от клинической стадии заболевания, размера первичной опухоли и статуса лимфатических узлов представлены в таблице 7.
Как следует из таблицы 7, на ранних стадиях заболевания наблюдается достоверное увеличение уровіи VEGF в опухоли по сравнению со значениями этого показателя у больных с поздними клиническими стадиями, при этом были обнаружены слабые, но достоверные корреляционные взаимосвязи содержания VEGF с размером опухоли и степенью поражения лимфатических узлов (тест Спирмена, R=-0,39 и R=-0,43, соответственно; р 0,05). Уровень VEGF достоверно возрастал в небольших опухолях (менее 5 см) по сравнению с опухолями больших размеров (более 5 см). Уровень VEGF в опухолевой ткани был достоверно увеличен в группе больных без поражений лимфатических узлов по сравнению с группой с поражениями.
Обнаружена тенденция к увеличению содержания VEGFR-1 в ткани рака молочной железы 1-Па стадии по сравнению с его уровнем в опухолях больных поздними стадиями, однако достоверность этого наблюдения нуждается в дополнительной проверке. Взаимосвязи уровня VEGFR-2 с клинической стадией рака молочной железы не выявлено.
Как видно в таблице 7, наблюдается тенденция к увеличению содержания VEGFR-1 в небольших опухолях по сравнению с опухолями больших размеров, однако статистической значимости это наблюдение не достигает. Содержание VEGFR-2 в опухолевой ткани не зависело от размера опухоли. Уровень VEGFR-1 в опухолевой ткани был достоверно увеличен в группе больных без поражений лимфатических узлов (индекс N) по сравнению с группой с поражениями. Как видно в таблице 7, содержание VEGFR-2 в опухоли не зависело от вовлеченности лимфатических узлов. Дальнейший анализ включал оценку возможной взаимосвязи исследованных показателей со степенью дифференцировки и гистологическим типом опухоли.
![Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс]](/i/i/4431/177751.png "Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс] Козлов Андрей Александрович")