Введение к работе
Актуальность проблемы
Постоянный прирост заболеваемости раком легкого (РЛ) и смертности от него во всем мире делает чрезвычайно актуальным исследования по изучению факторов, способствующих формированию этого заболевания. Эпидемиологические и фундаментальные молекулярно-генетические исследования четко показали этиологическую роль ряда канцерогенных факторов среды, ведущее значение среди которых имеют связанные с курением метаболиты, а также вовлечение генетических факторов, в первую очередь ответственных за взаимодействие с экзогенными и эндогенными агентами, способствующими злокачественной трансформации, и обеспечивающих целостность генома, в патогенез РЛ. Однако существует еще один аспект, на который мало обращается внимания, а именно, предполагаемая возможность снижения риска РЛ при определенных патологических состояниях, в частности, при аллергических заболеваниях. Свидетельством такой возможности являются довольно многочисленные сведения в литературе на протяжении нескольких десятилетий, указывающие на оппозитные взаимоотношения аллергических и раковых заболеваний (Бережная Н.М., Ялкут С.И., 1983; Адо В.А., Васильев Н.В., Горячкина Л.А., 1986; Васильев Н.В. и соавт., 1994; Бережная Н.М., Чехун В.Ф., Сепиашвили Р.И., 2005; Sanchez-Borges et al., 1986; K.E. Osann, 1991;Mills et al., 1992; Negri et al., 1999; Talbot-Smith et al., 2003; Bosetti et al., 2004; Lightfoot et al., 2004; Wiemels et al., 2004).
Однако немало и противоположных сведений о положительной взаимосвязи этих заболеваний ( McWhorter, 1988; Mills et al., 1992; Eriksson et al., 1995). Вопрос о взаимоотношении аллергических и злокачественных патологий был поставлен еще в первой половине 20 века А.А.Богомольцем, когда были сформированы представления о различных наследственно конституционных типах, один из которых был определен как аллергический. В настоящее время на основании накопленных экспериментальных данных и результатов клинико-эпидемиологических наблюдений сформулированы 2 оппозитные теории взаимоотношения аллергии и рака, однако ни одна из них не объясняет, почему в одних случаях аллергия препятствует развитию рака, а в других – способствует. Между тем, данные, полученные в процессе исследований в рамках этой проблемы, могут способствовать разработке подходов по вторичной профилактике злокачественных новообразований и новых методов иммунотерапии рака.
Для повышения эффективности исследований в плане прояснения вопроса о векторе взаимоотношений аллергии и рака, представляется целесообразным исследование различий или сходства патогенетических признаков бронхиальной астмы (БА) и РЛ как заболеваний, развивающихся на основе общей ткани-мишени. РЛ и БА являются заболеваниями мультифакториальной природы, риск формирования которых обусловлен взаимодействием большого количества генов с этиологически значимыми средовыми факторами. Общим атрибутом и пусковым моментом канцерогенеза является нарушение регуляции клеточного цикла. Мутация гена опухолевого супрессора р53 – одно из наиболее часто встречающихся генетических изменений в клетках различных опухолей, в частности, при РЛ они отмечаются в 50-90%, случаев. Инактивация генов в результате соматических мутаций зависит от регуляторного влияния внешних факторов и генетических механизмов, определяющих ответ на канцерогенные воздействия (Zhao et al.,1999; Rom et al., 2000; Yokota & Kohno, 2004). Нормальный бронхиальный эпителий подвергается риску повреждения вдыхаемыми или эндогенными окислительными метаболитами, а индивидуальная чувствительность к повреждению существенно зависит от различий в экспрессии ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) 2 фазы, а именно глутатион-S-трансфераз (GST), катализирующих реакцию инактивации высокоактивных генотоксических агентов путем их коньюгации с глутатионом (Crаwford, 2000). Показано, что нулевые генотипы GSTM1 и GSTТ1, которые характеризуются частичной или полной делецией гена и, следовательно, потерей функции фермента, ассоциируются с повышенной чувствительностью к генотоксическому действию продуктов табачного дыма. Это выражается в повышении частоты хромосомных аберраций и хроматидных обменов в клетках эпителия, а также частоты мутаций гена р53 в связи со снижением детоксикационного потенциала (Norrpa, 2004; Alexandrov et al., 2002).
Существуют многочисленные данные, свидетельствующие о важном значении хронического воспаления в патогенезе рака, в качестве подтверждения могут служить результаты когортных исследований по длительному применению нестероидных противовоспалительных агентов, которое приводило к значимому снижению риска РЛ, кишечника, желудка и пищевода (Baron & Sandler, 2000; Garcia-Rodriguez & Huerta-Alvarez, 2001; Martins–Green et al, 1994; Ness & Cottreau, 1999). Механизмы пролиферации, злокачественной трансформации тканей и хроническое воспаление тесно сопряжены с дисбалансом иммунитета и реализуются через нарушения кооперации иммунокомпетентных клеток и межклеточных взаимодействий на других уровнях с формированием соответствующего микроокружения (Пальцев М.А., Иванов А.А., 2003; Шварцбурд П.М, 2006; Makarthur et al., 2004, Philip et al, 2004).
Анализ экспрессии онкомаркеров при различных дисрегенераторных изменениях легочного эпителия на фоне хронических воспалительных заболеваний легких позволяет говорить об их предполагаемом злокачественном потенциале. Следует отметить, что практически при всех вариантах дисрегенераторных и предраковых изменений обнаруживаются мутации р53 (Коган Е.А., 2001, 2003; Rom et al., 2000). К предопухолевым изменениям бронхиального эпителия, повышающим риск малигнизации, относят плоскоклеточную метаплазию, дисплазию и гиперплазию эпителия, эти состояния могут считаться предраком легкого (Франк Г. А., 2000, Коган Е. А., 2003). Часто рак легкого возникает на фоне хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), для которой характерны диспластические изменения и метаплазия бронхиального эпителия.
ХОБЛ характеризуется наличием хронического воспаления в бронхолегочном тракте с преимущественным вовлечением CD8+ лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов. Принципиальным различием патогенеза БА и ХОБЛ являются эпизодические и реверсируемые нарушения функции бронхолегочного тракта в первом случае и прогрессирующая легочная обструкция во втором на фоне ремоделирования дыхательных путей. При исследовании биоптатов бронхиального эпителия у больных ХОБЛ в 70% случаев были обнаружены различные изменения клеточной архитектоники: гиперплазия базальных клеток, плоскоклеточная метаплазия и дисплазия бронхиального эпителия (Jeffery, 2001; Cappello et al., 2006). В настоящее время в литературе имеются лишь отдельные указания, позволяющие сделать вывод об ассоциации ХОБЛ с повышенным риском рака легкого (Mannino et al., 2004; Pap et al., 2004; Mayne et al., 1999; Kishi et al., 2002).
Таким образом, ХОБЛ является хроническим воспалительным заболеванием легких, которое протекает с участием иммунологических механизмов без формирования гиперчувствительности немедленного типа и сопровождается диспластическими изменениями бронхоальвеолярного эпителия, ассоциированными с повышенным онкогенным потенциалом.
Механизмы патогенеза БА включают в себя взаимодействие иммунологической и воспалительной компонент, особенности которых наряду с системой ФБК определяют реакцию на ксеногенные раздражители и выход в патологическое состояние. Механизм воспаления при классической атопической БА вовлекает Т хелперы 2 типа и эозинофилы как основные эффекторные клетки. В патогенезе инфекционно-аллергической формы БА наряду с IgE-опосредуемым механизмом играют роль клеточно-опосредуемые реакции по типу реакций гиперчувствительности замедленного типа к аллергенам микробного происхождения (Хаитов Р.М., 2002). Хроническое воспаление в респираторном тракте у больных астмой ассоциировано с ремоделированием дыхательных путей, основными проявлениями которого являются эрозии дыхательного эпителия, гиперплазия и гипертрофия слизистых желез, гиперплазия клеток дыхательного эпителия и гладкомышечных волокон, субэпителиальный фиброз и ангиогенез (Reader et al., 2003; Wang et al., 2003; et al., 2005). Нами не выявлено в литературе сведений об обнаружении диспластических изменений бронхиального эпителия при атопической астме. Интересен тот факт, что несмотря на полярные различия иммунопатогенеза БА и ХОБЛ, около 10% больных манифестируют признаки обоих заболеваний, что, скорее всего, следует рассматривать как их сочетание (Barnes , 2003).
Таким образом, РЛ, ХОБЛ и БА ассоциированы с хроническим воспалением, в формирование и поддержание которого вовлекаются участники воспалительного каскада, включая цитокины, хемокины, ростовые факторы, ферменты, рецепторы и адгезионные молекулы. Принимая во внимание общность ткани-мишени, а также вовлекаемых в патогенез этих заболеваний систем, представляется актуальным исследование различий или сходства их патогенетических признаков для выявления предпосылок, свидетельствующих о повышении или снижении риска РЛ у больных БА.
При этом следует особо отметить, что выявление объективных клинических и лабораторных признаков аллергических состояний у больных со злокачественными новообразованиями не может рассматриваться как непреложное доказательство связи аллергии и рака, так как в данном случае может сказываться влияние роста опухоли либо противоопухолевого лечения (Schwartzbaum et al, 2005). Литературные сведения также не принимают во внимание широкий клинический полиморфизм БА, который предполагает высокую генетическую гетерогенность, а, следовательно, и различия механизмов патогенеза.
При эпидемиологических исследованиях влияния астмы на риск развития РЛ необходимо проводить стандартизацию групп больных по фактору курения, что также представляет определенные сложности, поскольку 85-90% больных РЛ являются курильщиками, а больные астмой курят значительно реже в связи с гиперреактивностью бронхов. Перечисленные обстоятельства свидетельствуют о необходимости поиска новых подходов к оценке возможного влияния БА на риск развития РЛ.
Для получения более объективных данных о взаимосвязи БА и РЛ мы сочли целесообразным изучение генетических полиморфизмов, для которых есть сведения о значимой ассоциации с РЛ, у больных ХОБЛ и БА. Сравнение частоты встречаемости отдельных аллелей, генотипов и их сочетаний у больных БА с соответствующими показателями у больных РЛ дает возможность составить представление о сходстве или различии изучаемых генетических особенностей при этих заболеваниях. В качестве промежуточной группы сравнения между РЛ и БА была выбрана группа больных ХОБЛ - хроническим воспалительным заболеванием легких, которое протекает с участием иммунологических механизмов без формирования гиперчувствительности немедленного типа и сопровождается метаплазией и диспластическими изменениями бронхоальвеолярного эпителия, предрасполагающими к малигнизации.
Выбор полиморфизмов осуществляли на основе литературных данных об их ассоциации со злокачественными новообразованиями, в частности, с РЛ, не менее, чем в 2 разных популяциях, а также вовлечении функционирования этих генов в патогенез аллергических заболеваний или физиологию бронхиального тракта (Schwartzbaum et al, 2005). В литературе представлены данные о связи РЛ с полиморфизмом генов ФБК 2 фазы GSTT1 и GSTM1 (Spitz et al, 2000; Yang et al., 2004; Wenzlaff et al., 2005; Stucker et al., 2002, Belogubova et al, 2004), гена онкосупрессора р53 в различных популяциях (Ляхович В.В. и соавт., 1997; Papadakis et al., 2002; Miller et al, 2004; Wu et al, 2002). Это свидетельствует, что указанные полиморфные гены являются маркерами предрасположенности к онкопатологии легкого. Изучение связи гена рецептора хемокинового рецептора CCR5 с онкологическими заболеваниями началось недавно, в литературе есть сведения о его способности регулировать транскрипционную активность р53 и об ассоциации делеционного аллеля CCR5del32, кодирующего функционально неактивный белок-рецептор, с прогрессией рака молочной железы (Manes et al, 2003). В НИИ онкологии г.Томска были получены данные об ассоциации полиморфизма гена CCR5 с прогрессией РЛ (Севостьянова Н.В., 2004).
Исследование связи различных генотипов изучаемых генов с патогенетически важными для астмы и ХОБЛ качественными и количественными признаками, характеризующими состояние факторов местного и системного иммунитета, позволит выявить их роль в развитии предрасположенности к РЛ и может быть полезным при формировании групп повышенного онкологического риска.
Для уменьшения гетерогенности выборок, на наш взгляд, целесообразно было бы отдельно рассматривать разные формы БА. Для повышения эффективности выявления ассоциаций полиморфизмов изучаемых генов с РЛ, ХОБЛ и БА необходима также стратификация контрольных выборок в соответствии с группами больных по полу, возрасту, географическому региону.
Цель исследования:
Оценить в сравнительном аспекте частоту распределения генотипов патогенетически значимых для рака легкого генов (ферментов биотрансформации ксенобиотиков 2 фазы, апоптоза и рецептора хемокинов) и особенности местного иммунитета бронхиального эпителия у больных хронической обструктивной болезнью легких, бронхиальной астмой и раком легкого.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительную оценку распределения функциональных и «нулевых» генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков второй фазы GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой.
-
Сравнить распределение генотипов и частот аллелей (BstU1- полиморфизм 72 кодона 4 экзона) гена р53 у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой.
-
Исследовать распределение генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора CCR5 (CCR5del32 полиморфизм) у больных бронхиальной астмой и ХОБЛ в сравнении с контрольной группой и больными раком легкого.
-
Оценить особенности воспаления и цитокинового профиля в слизистой бронхиального дерева у больных раком легкого, ХОБЛ и больных бронхиальной астмой.
-
Исследовать иммунологические показатели на системном и местном уровне у больных раком легкого, ХОБЛ и бронхиальной астмой в зависимости от полиморфизма изучаемых генов.
Научная новизна
Получены новые данные о повышенной частоте «нулевого» генотипа гена GSTM1, сравнимой с таковой у больных РЛ, у курящих больных ХОБЛ по сравнению с популяционным контролем для лиц европеоидного происхождения Западно-Сибирского региона.
Показано, что частота «нулевых» генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков второй фазы GSTT1 и GSTM1 и их сочетаний у больных БА смешанного генеза существенно превышает уровень популяционного контроля и сравнима с таковой у больных РЛ. У больных с астмой атопического генеза не отмечено повышения частоты генотипа GSTM1”0/0” по сравнению с контролем.
Получены новые данные о повышенной частоте Arg аллеля гена р53 (BstU1- полиморфизм 72 кодона 4 экзона) у больных ХОБЛ, которая не отличалась от таковой у больных РЛ. Напротив, частота генотипа Pro/Pro у больных ХОБЛ, как и у больных РЛ, была более низкой по сравнению с популяционным контролем. Одинаковое распределение генотипов гена р53 у больных ХОБЛ и РЛ можно рассматривать с одной стороны, как свидетельство сходства механизмов вовлечения р53 в патогенез ХОБЛ и РЛ, а с другой – как указание на повышенный риск формирования РЛ у больных ХОБЛ.
Выявлена связь Pro аллеля гена р53 с повышенным уровнем лимфоцитов в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ и БА.
Получены приоритетные данные о более низкой частоте встречаемости делеционного аллеля гена хемокинового рецептора ССR5 у больных БА по сравнению с популяционным контролем в Западно-Сибирском регионе.
Впервые в пределах одной популяции проведен сравнительный анализ полиморфизма патогенетически значимых для формирования РЛ генов у больных БА различного генеза, результаты которого свидетельствуют о различной степени предрасположенности к формированию РЛ у больных астмой с атопическим и смешанным генезом заболевания.
У 50% обследованных больных РЛ выявлены признаки вторичной иммунной недостаточности, которые предшествовали развитию злокачественного процесса, сходные со структурой инфекционного синдрома вторичного иммунодефицита у больных ХОБЛ и БА.
Теоретическая и практическая значимость
В работе выявлены существенные различия в распределении генотипов и частоте встречаемости вариантных аллелей между группами больных с атопической астмой и больных старше 40 лет, в которой превалируют больные с астмой смешанного генеза. Во-первых, это свидетельствует о различной роли изучаемых генов в патогенезе разных форм БА, во-вторых, указывает на неоднородность группы БА в плане возможной предрасположенности к РЛ. Это позволяет объяснить хотя бы частично неоднозначность результатов проводившихся ранее клинико-эпидемиологических исследований о взаимосвязи БА и РЛ.
В результате анализа полиморфизма гена онкосупрессорного белка р53 у больных БА получены данные об ассоциации Pro аллеля и Pro/Pro генотипа гена р53, а также сочетания генотипов ССR5/CCR5-Pro/Pro с тяжелым течением БА смешанного генеза, что свидетельствует о целесообразности исследования роли полиморфизма гена р53 в формировании резистентности к кортикостероидной терапии.
Сведения о наличии «нулевых» генотипов ФБК 2 фазы и Arg аллеля гена р53 (BstU1-полиморфизм) у больных ХОБЛ могут быть использованы в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска по РЛ.
Полученные данные об ассоциации CCR5del32 с низким риском формирования БА атопического генеза указывают на актуальность дальнейшего исследования связи полиморфизма CCR5 с предрасположенностью к БА у лиц с отягощенным семейным анамнезом.
Апробация диссертации
Основные положения и результаты научных исследований были доложены на бъединенном иммунологическом форуме с международным участием, г. Екатеринбург (2004); IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», г. Санкт-Петербург (2005); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, «Дни иммунологии в Сибири», г. Красноярск (2005); научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Иммунология на рубеже веков: к 75-летию со дня рождения академика РАМН Н.В. Васильева», г. Томск (2005); 15 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Копенгаген (2005); III ежегодном национальном конгрессе молодых исследователей в области сердечно-сосудистых и респираторных заболеваний, г. Виннипег (2006); VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск (2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, г. Москва (2006); 16 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Мюнхин (2006).
Публикации
