Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 15
Раздел 1.1. Современные методы лечения глубоких ожоговых дефектов роговицы 15
Раздел 1.2. Современные представления о процессе репаративной регенерации в роговице 38
Раздел 1.3. Научные аспекты и результаты клинического применения культивированных клеток в лечении дефектов тканей различной этиологии 44
Раздел 1.4. Механизм действия трансплантата культивированных клеток в процессе репаративной регенерации тканевых дефектов 49
ГЛАВА II. Общая характеристика экспериментального материала и методов исследования 53
Раздел 2.1. Трансплантационный материал 53
Раздел 2.2. Характеристика экспериментального материала 60
Раздел 23. Разработка методики трансплантации 62
Раздел 2.4. Характеристика методов исследования 65
ГЛАВА III Собственные исследования 71
Раздел 3.1. Сравнительные результаты динамики заживления ожогового дефекта роговицы при трансплантации стромального эквивалента в ранние
сроки после травмы , 71
Раздел 3.2. Сравнительные результаты клинической оценки процессов репарации ожогового дефекта роговицы, при трансплан тации стромального эквивалента на формировавшемся десцеметоцеле и язве роговицы 84
Раздел 33. Морфологическое изучение динамики репаративного процесса ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента 95
Раздел 3.4. Иммуногистохимическое изучение динамики репаративной регенерации ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента 105
Заключение 122
Выводы 139
Список литературы 141
- Научные аспекты и результаты клинического применения культивированных клеток в лечении дефектов тканей различной этиологии
- Механизм действия трансплантата культивированных клеток в процессе репаративной регенерации тканевых дефектов
- Разработка методики трансплантации
- Морфологическое изучение динамики репаративного процесса ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента
Научные аспекты и результаты клинического применения культивированных клеток в лечении дефектов тканей различной этиологии
Ожоговая травма органа зрения до настоящего времени является одним из наиболее тяжелых видов поражения. По исходам лечения и связанной с ними инвалидностью она занимает особое место в ряду важнейших по актуальности направлений современной офтальмологии. Частота ожоговой травмы, по данным разных авторов, составляет от 6,1% до 38,4% среди всех травм глаз [11,32,71,95,145], а более 40% пострадавших становятся инвалидами 1-2 групп по зрению [71,95,145].
Ожоги глаз, как результат одномоментной травмы, представляют собой длительный процесс. В патогенетическом отношении, это сложный комплекс обменных, биохимических, иммунологических и морфологических нарушений [7,11,95]. Возникающие сдвиги на клеточном и субклеточном уровне приводят к вовлечению в патологический процесс ряда систем организма, в том числе систем, обеспечивающих физиологический гомеостаз [145] . В результате к этой сложной патогенетической цепи присоединяются вторичные изменения, утяжеляющие начальные проявления полученной травмы. Патологические сдвиги распространяются далеко за пределы первично травмированной ткани [30,32,35]. В результате биохимических преобразований ткань роговицы приобретает аутоантигенные свойства, что приводит к иммунологической перестройке всего организма. Таким образом, процесс, развивающийся при ожоге глаз, рассматривается как проявление общей ожоговой болезни организма [11,30,101].
В наиболее уязвимом положении при ожоговой травме оказывается роговица.
Гибель эпителиальных клеток после ожога щелочью наступает почти мгновенно: за первые три минуты происходит лизис мембран клеток, десквамация всех слоев эпителия [11]. Так как обмен веществ в роговице осуществляется через эпителий и эндотелий, повреждение эпителия приводит к резкому нарушению обменных процессов во всех слоях роговицы, что становится причиной угнетения функции дыхания, окисления, восстановления, потери гликогена и витаминов. Возникает отек стромы, исчезновение клеток, нарушается синтез полисахаридов. В условиях высокой РН катионы соединяются с коллагеном и гликозаминогликанами, вступая во взаимодействие с карбоксильными группами. Происходит расщепление пептидных фрагментов коллагена [95] . Токсические продукты распада коллагена вызывают глубокие трофические расстройства за счет расширения сосудов, гипергидратации стромы, фибриноидного набухания и глубокой дезорганизации коллагена [82,145,313]. Некротически измененная ткань роговицы является мощным хемоаттрактантом для миграции лейкоцитов из кровяного русла. Фагоцитарная функция неитрофилов сопровождается выбросом во внешнюю среду протеолитических ферментов. Установлено, что измененный коллаген больше подвержен действию протеолитических ферментов [137,138]. Нарушается послойное расположение коллагеновых фибрилл, отмечается деструкция кератоцитов [145,313]. Отсутствие фибробластов ведет к нарушению продукции нормального коллагена [313], что в свою очередь стимулирует инфильтрацию лейкоцитами строму роговицы. Взаимодействие физиологических и биохимических преобразований приводит к нарушению репаративно-регенераторных процессов в роговице, результатом которых является развитие рецидивирующих эрозий, язвы роговицы, десцеметоцеле, перфорации и гибели глаза [36,37,73,74,75,313].
Таким образом, наиболее острой проблемой в современной офтальмотравматологии остается восстановление целостности роговичной ткани.
В основе современных методов лечения ожоговых дефектов роговицы лежит сбалансированная физиологическая коррекция патологических сдвигов в каком-то одном или в нескольких звеньях патогенеза ожоговой болезни.
Механизм действия трансплантата культивированных клеток в процессе репаративной регенерации тканевых дефектов
В доступной литературе не описано ни одного случая фиксации гелеобразного трансплантата на роговицу, каковым является стромальный эквивалент. Методика трансплантации разрабатывалась нами перед проведением основных экспериментальных исследований по изучению ее эффективности в лечении ожоговых дефектов роговицы в разные сроки после травмы. Учитывая анатомическое строение роговицы и глазного яблока в целом, а также наличие изменений, происходящих в ткани роговицы после щелочного ожога, нам представлялось, что методика трансплантации должна: а) обеспечить надежную фиксацию трансплантата; б) исключить вероятность повреждения трансплантата от механического воздействия век; в) охватить условия подготовки раневой поверхности для достижения максимальной эффективности.
Принимая во внимание вышеизложенное, мы исходили из предположения, что достижение этих целей возможно: - при проведении предварительной некрэктомии и формирования глубокого ложа в пределах здоровых тканей роговицы, - при фиксации трансплантата МКЛ большого диаметра, - при проведении некровавой блефарорафии (что не только исключит повреждение трансплантата от механического воздействия век, но и обеспечит дополнительную фиксацию трансплантата).
Решение о проведении хирургической некрэктомии основывалось на данных литературы, свидетельствующих об оправданности данной процедуры для достижения максимально положительного эффекта трансплантации.
Известно, что некротически измененная ткань роговицы, преимущественно поверхностных слоев, является мощным хемоаттрактантом для миграции неитрофилов из кровяного русла и развития воспалительного очага в обожженной ткани роговицы. Нейтрофилы, в свою очередь, индуцируют приток новых неитрофилов, путем продукции воспалительных медиаторов. Установлено также, что активная фагоцитарная функция неитрофилов сопровождается выбросом во внешнюю среду протеолитических ферментов, что имеет большое значение в процессах перфорации и изъязвления роговицы.
Кроме вышеизложенного, проведение некрэктомии и помещение трансплантата в пределах здоровых тканей, механически сближает культивированные фибробласты к интактной, богатой клеточными элементами, зоне стромы роговицы и, тем самым, создает оптимальные условия для осуществления межклеточных взаимодействий, результатом которых, предположительно, является ускорение регенераторных процессов в обожженной роговице.
Применение МКЛ для фиксации трансплантата, на наш взгляд, является оправданным. В настоящее время МКЛ широко применяются как в терапевтических целях для пролонгированного действия лекарств, снятия болевого синдрома, так и в качестве биологической повязки, защищающей обожженную роговицу от внешних раздражителей и от проникновения микробной флоры, что снижает риск инфекционных осложнений. Проведение некровавой блефарорафии имеет основание по двум причинам: а) дополнительная фиксация МКЛ и, следовательно, трансплантата тоже; б) исключение повреждения трансплантата от механического воздействия век.
Таким образом, на всех глазах непосредственно перед проведением трансплантации проводили хирургическую некрэктомию. С помощью лезвия и скарификатора удаляли некротически измененную ткань. При проведении трансплантации спустя 24 часа после нанесения ожоговой травмы (в I серии эксперимента) с центра роговицы удаляли некротически измененную ткань до прозрачных слоев. При трансплантации в поздние сроки после нанесения ожога (спустя 2 недели - во II серии) проводили некрэктомию на 1-2 мм по окружности образовавшейся язвы или десцеметоцеле.
В дефект роговицы помещали трансплантат, который фиксировали на роговице мягкой контактной линзой (МКЛ), диаметром 16мм. В ходе проведения эксперимента диаметр МКЛ был увеличен до 18мм, для лучшей фиксации трансплантата. Завершали трансплантацию некровавой блефарорафией.
На всех контрольных глазах, в качестве которых служили парные глаза в I серии (45 глаз) и контрольная группа - во II серии экспериментальных исследований (18 глаз с десцеметоцеле и 10 глаз с язвой роговицы), также проводили хирургическую некрэктомию по описанной методике, использовали МКЛ и накладывали непостоянный блефарорафический шов. Наличие последнего позволяло проведение клинических исследований для оценки состояния глаз животных.
С целью профилактики развития вторичной инфекции на всех глазах проводили местную противоинфекционную терапию в виде инстилляции 0,25% раствора левомицетина 3 раза в день.
Характеристика методов исследования Клтмжчтсжжт методы всследовамяя Наблюдение за состоянием глаз животных осуществляли с помощью фокального и бокового освещения для общего осмотра переднего отрезка глаз и биомикроскопии щелевой лампой "Karl Zeiss-Iena" и "Opton SL-30" (Германия) с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией.
Клиническую оценку состояния глаз животных проводили по следующим признакам: степень воспалительной реакции, площадь дефекта эпителия и стромы, интенсивность помутнения роговицы и степень васкуляризации роговицы.
Разработка методики трансплантации
Анализ полученных данных морфологического изучения ожоговой раны роговицы позволяет заключить, что трансплантация культивированных ФБ в коллагеновом геле (стромальный эквивалент) вызывает короткую по времени, но более выраженную, чем в контроле воспалительную реакцию. Связанный с обострением начальной фазы воспаления запуск ряда клеточных событий в конечном итоге приводит к ускорению процессов репаративной регенерации ожоговой раны роговицы. Кроме того, входящий в состав СЭ коллаген I типа является хемоаттрактантом для макрофагов, но не для нейтрофилов [93] . Как известно, макрофаги играют одну из ключевых ролей в регенерации ран: путем фагоцитоза очищают рану от некротически измененных тканей, а также способствуют миграции клеток различных типов в очаг поражения, их пролиферации и дифференциации, в том числе фибробластов [112]. Происходит восстановление нормального спектра цитокинов и факторов роста в области раны, восстановление баланса между процессами синтеза и утилизации компонентов ВКМ, результатом которого является ускорение эпителизации, формирование базальной мембраны. С другой стороны, культивированные ФБ, входящий в состав СЭ, в свою очередь стимулируют миграцию и пролиферацию как эпителиальных клеток, так и собственных ФБ роговицы путем экспрессии ФР и цитокинов, секреции компонентов ВКМ. Этим объясняется активация эпителизации по поверхности коллагенового геля, формирование базальной мембраны, адгезия новообразованного эпителия в опытной группе глаз. Быстрое купирование воспалительной реакции и ускорение восстановления структуры роговичнои ткани приводит к уменьшению образования сосудов и способствует формированию более нежного, по сравнению с контролем, рубца. В контроле же, длительное сохранение воспалительной реакции, обусловленное притоком нейтрофилов, способствует дальнейшей деструкции роговичнои ткани, замедлению процессов эпителизации, активному врастанию новообразованных сосудов, что заканчивается формированием грубого васкуляризованного рубца.
При иммуногистохимическом исследовании на 7 сутки после трансплантации в опыте в большинстве случаев выявлялось позитивное окрашивание иммуногистохимических маркеров, свидетельствующих в пользу формирования неостромы в областях, прилегающих к трансплантату: при сохраняющемся воспалительном инфильтрате, отмечалось увеличение количества фибробластов, в том числе активно пролиферирующих - Кі-67+ (Рис.40). При этом aSMA+ формы фибробластов практически не выявлялись. Во всех слоях ВКМ отмечалось умеренное диффузное накопление плазменной формы фибронектина. В эндотелии сосудов и в периваскулярной зоне на данном этапе заживления наблюдалось усиленное накопление мерозина (рис.41). Экспрессия тенасцина оставалась достаточно слабой, а в большинстве случаев вовсе не выявлялась. Практически во всех наблюдениях к 7 суткам отмечалось появление иммунопероксидазного окрашивания с антителами к фиброгенному фактору роста TGF-p (Рис.42). Выраженная позитивная реакция выявлялась в фибробластах и мононуклеарных лейкоцитах инфильтрата. Экспрессия матриксной металлопротеиназы ММР-9 была крайне низкой. Реакция с антителами к ингибиторам металлопротеиназ TIMP-1 и TIMP-2 к этому сроку манифестировалась крайне слабым внутриклеточным окрашиванием клеток инфильтрата и отдельных фибробластов.
В воспалительном инфильтрате наблюдалось преобладание CD68+ клеток (моноцитов/макрофагов). Выявление маркеров CD4 и CD8, характеризующих другие элементы мононуклеарного инфильтрата давало отрицательный результат.
В контроле на 7 сутки в области ожогового дефекта фибробласты немногочисленны. Положительная иммунопероксидазная реакция с антителами к Ki-67, характеризующими пролиферативную активность, отмечалась лишь в единичных клетках. Количество SMA+ миофибробластов несколько выше, чем в опыте. В строме дефекта отмечалось слабое накопление фибронектина, присутствие мерозина характеризовалось преимущественно слабым диффузным распределением. Экспрессия тенасцина не обнаружена.
Морфологическое изучение динамики репаративного процесса ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента
Отмечалось формирование базальной мембраны, что сопровождалось активной пролиферацией эпителия, во всех слоях которого была отмечена положительная реакция с антителами к с-МЕТ , а в базальном слое определялись Ki-67+ клетки.
Контрольная группа к этому сроку характеризовалась более низкими темпами формирования базальной мембраны, меньшим количеством Кі-67-положительных клеток, отсутствием экспрессии с-МЕТ и гораздо менее выраженной интенсивностью иммунопероксидазного окрашивания с антителами к ТІМР-2 и высоким уровнем экспрессии металлопротеиназы ММР-9.
Трансплантация СЭ приводила к полной реэпителизации раны на 22 сутки наблюдения, проявляющейся сильно позитивным окрашиванием с анителами к цитокератинам 10/13 и 5/18. Это сопровождалось синтезом и накоплением фибронектина и коллагена IV типа с преимущественной локализацией в области базальной мембраны, что способствовало адгезии эпителия. На фоне уменьшения инфильтрации выявлялось снижение количества CD68+ клеток в инфильтрате, Ki-67-положительных клеток в базальном слое эпителия и экспрессии TGF-p, ТІМР-1, ТІМР-2 и фибронектина в подлежащей строме. Реакция на выявление металлопротеиназы ММР-9 а и SMA-положительных фибробластов была отрицательной. Между тем в контроле, на фоне выраженной инфильтрации, обнаруживались единичные aSMA-положительные миофибробласты.
К 30 суткам после трансплантации выявлялась положительная иммуногистохимическая реакция с СК 5/18 во всех слоях новообразованного эпителия, что говорит о его функциональной зрелости, и отрицательное окрашивание к коллагену VII типа, что свидетельствует о физиологическом характере эпителизации - за счет собственных клеток эпителия роговицы. Контрольная группа отличалась относительно высоким уровнем воспалительной инфильтрации и положительной реакцией на ММР-9.
Таким образом, результаты проведенных клинических, морфологических и иммуногистохимических исследований показали эффективность трансплантации СЭ как в ранние сроки после нанесения ожоговой травмы, так и в поздние сроки. СЭ активизировал процессы ремоделирования ВКМ в ране путем изменения характера воспалительной реакции -преобладания моноцитарно/макрофагальной инфильтрации. Это способствовало продукции цитокинов и TGFP. Изменение структуры ВКМ в ходе репарации проявлялось продукцией TGF-p и фибронек тина, что приводило к нормализации баланса между протеазами (ММР-9) и их ингибиторами (ТІМР-1 ТІМР-2) и активации миграции и пролиферации фибробластов, процессов восстановления базальной мембраны, реэпителизации раны собственными эпителиоцитами, имеющими нормальный фенотип и адгезии новообразованного эпителия к базальной мембране. Описанные изменения в ходе ремоделирования ВКМ, в особенности усиленное накопление фибронектина, было связано с изначальным присутствием культивированных фибробластов в области раневого дефекта, в составе СЭ.
Опережение сроков эпителиэации в опытной группе также индуцировалось активностью фибробластов, входящих в СЭ. Ускорение восстановления структуры роговичнои ткани без контракции раневого дефекта (отсутствие миофибробластов), в итоге приводило к уменьшению образования сосудов и способствовало формированию более нежного, по сравнению с контролем, рубца.
В контроле длительное сохранение воспалительной реакции, обусловленное притоком ПЯЛ, и замедление репаративных процессов, связанных неполноценностью формируемого в области раны ВКМ, было опосредовано повышенной концентрацией металлопротеинаэ и снижением синтеза их ингибиторов. Это способствовало повышенной утилизации цитокинов и факторов роста, и развитию длительно протекающего патологического процесса по принципу "порочного круга". В результате происходило нарушение синтетических процессов, ответственных за восстановление структур ВКМ, что служило причиной дальнейшей деструкции роговичнои ткани, замедлению процессов эпителиэации, нарушения формирования базальной мембраны, активному врастанию новообразованных сосудов, и заканчивалось формированием грубого васкуляризованного рубца.
