Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Перспективы генной терапии и доставка генного материала при патологии органа зрения 16
1.2 Применение постоянного магнитного поля в офтальмологии ... 27
1.3 Перспективы применения магнитных технологий с целью фиксации клеточного материала 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293
магнитными частицами, и оценка их взаимодействия с магнитным имплантатом в эксперименте in vitro 36
2.1.1. Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами 37
2.1.2. Оценка прочностных, токсикологических, цитотоксических и ростстимулирующих свойств магнитного имплантата 38
2.1.3. Исследование локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза 44
2.1.4. Оценка эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата 46
2.2. Исследование эффективности метода субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293,
меченных магнитными частицами в эксперименте in vivo 47
2.2.1. Группы исследования и методы послеоперационного контроля 47
2.2.2. Методы морфологического исследования глазного яблока экспериментальных животных 49
ГЛАВА 3. Результаты экспериментальных исследований 52
3.1. Результаты разработки технологии введения магнитных частиц в эмбриональные стволовые клетки почки человека линии НЕК-293 53
3.1.1. Метод культивирования клеток и насыщения магнитными частицами 53
3.1.2. Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами 54
3.2. Результаты разработки оригинального магнитного имплантата для эписклеральной фиксации 56
3.2.1. Общая характеристика разработанного магнитного имплантата 57
3.2.2. Результаты оценки прочностных, токсикологических, цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов на культурах клеток 59
3.2.3. Результаты исследования локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза 66
3.2.4. Результаты оценки эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата 72
3.3. Результаты разработки хирургического способа и устройства для локального субретинального введения клеток линии НЕК-293, содержащих магнитные частицы 74
3.3.1. Разработанное устройство для субреинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами 75
3.3.2. Техника операции на глазах животных 78
3.4. Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами 81
3.4.1. Результаты клинических наблюдений за экспериментальными животными 82
3.4.2. Результаты морфологического исследования 91
Заключение 97
Выводы 107
Практические рекомендации 108
Список литературы
- Применение постоянного магнитного поля в офтальмологии
- Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами
- Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами
- Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами
Применение постоянного магнитного поля в офтальмологии
Существует множество различных терапевтических подходов для лечения фоторецепторной патологии и/или патологии ПЭС, таких как медикаментозные, лазерные, электро- и магнитостимуляции. В то же время интенсивно проходят исследования генной терапии и трансплантации клеток и тканей на моделях животных [67, 88, 161].
Направленная доставка генных конструкций и клеток в сетчатку глаза имеет ряд неоспоримых преимуществ, в сравнении с другими органами и нервными тканями, поскольку глаз изолирован от других систем, имеет более ограниченный иммунный ответ, и необходимый объем для интравитреальных инъекций незначительный, что сводит к минимуму потенциальные осложнения, связанные с системными побочными эффектами [67, 82, 84].
Дегенерация фоторецепторов может быть замедлена внутриглазным введением факторов роста или антиапоптотических факторов [56, 107, 108, 173]. Были обнаружены положительные влияния факторов роста в защите фоторецепторов, включая кислотный и основной факторы роста фибробластов (AFGF и bFGF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF), мерцательный нейротрофический фактор (CNTF), фактор ингибирующий лейкоз (LIF), интерлейкин-lb и фактор роста пигментного эпителия (PEDF). Существует мнение, что влияние этих факторов может проявляться опосредовано через другие клетки сетчатки [171]. Но, к сожалению, эти белки имеют относительно короткий период полураспада и их действие, как правило, преходящее, даже после повторного применения.
Для решения вопроса более длительного высвобождения ростовых и нейротрофических факторов предложены различные их генетические модифицикации, а также способы их введения. Преимущественным считается субретинальный способ введения этих факторов в виде суспензии, так как он обеспечивает максимальное приближение терапевтических агентов к месту дефекта [87, 109, 119]. Однако существует также интравитреальный способ введения факторов, инкапсулированных в полупроницаемые капсулы [50, 153, 169]. Инкапсуляция обеспечивает постепенную диффузию нейротрофических факторов, предотвращает миграцию и неконтролируемую пролиферацию имплантата, но может вызывать местную воспалительную реакцию и нарушать прозрачность оптических сред глаза [50, 153, 169].
С развитием технологий в настоящее время особую популярность приобретает использование вирусных векторов для введения генов в клетки, обеспечивая устойчивость конструкции и открывая долгосрочные перспективы для влияния генетических конструкций в области повреждения. Однако локальные инъекции таких конструкций могут оказывать и негативное влияние на пост-митотические нейроны сетчатки, глию и/или на клетки, не относящиеся к нервной ткани [42, 46, 85, 93, 122, 161]. В большинстве случаев, в эксперименте при дегенеративных заболеваниях сетчатки у животных используют аденовирусный вектор (ADV) или более распространенный рекомбинантный адено-ассоциированный вирусный вектор (AAV). Лентивирусный и герпесвирусные векторы используются реже и, в основном, для доставки генной информации в сетчатку грызунов в экспериментах [38, 58, 73, 130, 156, 168, 170]. Аденовирусные векторы представляют собой линейные двухцепочечные ДНК-конструкции, вмещающие в себя до 8 кб ДНК. Большинство типов клеток восприимчивы к инфекциям и аденовирусные векторы могут обеспечить доставку трансгенов как в пролиферирующие клетки, так и не в пролиферирующие. Однако прямая инъекция вирусных конструкций в ткань глаза может вызывать активацию клеточного звена иммунитета, местную воспалительную реакцию, инактивацию генной конструкции, что приведет к резкому сокращению времени продукции трофических факторов [53, 85, 86, 92, 93, 144, 148].
Новое поколение аденовирусных векторов считается более перспективным. Так, например, аденовирусный вектор-носитель PEDF, используемый для лечения ВМД не вызывал никаких серьезных воспалительных реакций или побочных эффектов в течение нескольких месяцев [51]. Рекомбинантные адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) представляют собой одноцепочечную ДНК, являются производными от парвовирусов, и относятся к непатогенным и нетоксичным вирусам. Эти векторы могут эффективно встраиваться в клетки любого типа, и в настоящее время известно более чем 100 известных серотипов, из которых широко используются 11 [75]. Наиболее часто используемыми серотипами являются нейротрофические [47, 49]. Векторы AAV-2 и AAV-5, наиболее часто применяются для интраокулярного введения [67, 161]. Недостатком AAV в настоящее время является их незначительная емкость, в них могут разместиться только около 4,5 кб ДНК, хотя большинству основных генов, которые используются при лечении заболеваний глаз, достаточно этого объема для расположения в AAV.
В целях доставки векторов к фоторецепторам, их, как правило, вводят в субретинальное пространство, то есть между внешними слоями сетчатки и пигментным эпителием сетчатки. Стоит отметить, что интравитреальные инъекции AAV у взрослых крыс преимущественно ведут к преобразованию в ганглионарные клетки сетчатки (ГКС), а подобные инъекции у новорожденных крыс приводят к преобразованию преимущественно в фоторецепторы [83]. Известно, что после субретинального введения AAV существует системный гуморальный ответ, но это не мешает дополнительной трансдукции клеток после повторного введения фактора [33].
Проведены множественные исследования генетической составляющей пигментного ретинита. Пигментный ретинит (ПР) относится к группе первичных, хронических наследственных нарушений, при которых фоторецепторы и/или клеточные аномалии ПЭС приводят к прогрессирующей дегенерации фоторецепторов [59, 127]. Примерно в 50% случаев ПР возникает у пациентов, у которых в семье случаи ПР не фиксировались, в 20% случаев наследуется как аутосомно-доминантный, у 20% пациентов как аутосомно-рецессивный и у 10% пациентов этот ген сцеплен с Х-хромосомой.
Клинические проявления ПР могут наблюдаться отдельно или в сочетании с другими системными заболеваниями. За исключением дефекта гена родопсина, который составляет примерно 25% от аутосомно-доминантной формы ПР, генетические основы для ПР разнообразны, вызваны рядом мутаций в более чем 100 идентифицированных генов, при этом каждая мутация влияет на одну или несколько функций фоторецепторов, что делает практически невозможным исправление первичного генетического дефекта при этой патологии без проведения генной терапии [81, 83].
Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами
В работе в качестве магнитных имплантатов, которые размещали эписклерально и фиксировали узловыми швами, использовались полимерные эластичные магнитные имплантаты (ПЭМИ) оригинальной конструкции с лазерным зондом, разработанные нами совместно с ООО НЭП «Микрохирургия глаза» (Москва). Общая характеристика разработанного нами магнитного имплантата представлена подробно в разделе 3.2.1.
В ходе исследования оценивали: - механические свойства магнитного имплантата, - прочностные свойства магнитного имплантата, - токсикологические свойства магнитного имплантата.
Для оценки механических и прочностных свойств магнитного имплантата осуществляли его гидротермообработку по методике ускоренного старения, принятой для испытания полимерных магнитов. Имплантаты выдерживали при температуре 90С в течение 2 недель, что соответствует 5 годам эксплуатации при нормальных условиях. Затем проводили контроль внешнего вида под микроскопом на наличие механических повреждений.
Для оценки токсикологических свойств проводили исследование, разработанное в ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России» для офтальмологических изделий в соответствии с требованиями Международного стандарта ISO 10993-1. Выполняли РН-метрию, ультрафиолетовую спектроскопию, иммунотоксический тест, оценивали выживаемость клеток на тест-объекте, наличие аутоиммунных молекулярных комплексов и мутагенности по микроядерному тесту. Измерения проводили относительно контроля (воды). Результаты сравнивали с пороговыми значениями.
Было проведено исследование цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов путем со-культивирования культурой мультипотентных мезенхимальных стромальных стволовых клеток. На базе ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» в лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий под руководством д.м.н. А.А. Темнова.
Для тестирования было взято 2 объекта. Материал представляет собой полимерный эластичный магнитный материал круглой формы, диаметром 4 мм, толщиной 0,35 мм. Объекты тестирования поступили на исследование нестерильными, были отмыты путем пятикратного погружения в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (Sigma, США), перемешаны на шейкере в течение 60 минут, высушены, закрыты в пакеты для автоклавирования, простерилизованы в автоклаве при температуре 121С и 2.1 атм. в течение 20 минут (рис. 1). Рис. 2. Инкубатор Sanyo (Япония)
В опытах использовали культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), полученных из пуповины путем двух пассажей в условиях in vitro. Клетки выращивали в стандартных условиях в инкубаторе SANYO MCO-20AV в режиме 37С в культуральных флаконах (NUNC), площадью 175 см2 (рис. 2, 3).
Оба образца ПЭМИ помещали в разные чашки Петри с культуральной средой, куда через 10 минут переносили клетки (рис. 4). Плотность клеток и анализ их жизнеспособности проводили на автоматизированном анализаторе Vi-Cell XR (США) (рис. 5). Морфологию клеток оценивали при помощи инвертированного микроскопа проходящего света с системой видеонаблюдения «Carl ZEISS Observer. А1» (Германия) (рис. 6). Рис. 5. Анализатор концентрации и жизнеспособности Vi-Cell XR (США)
Для подтверждения наличия клеток на материале использовали флуоресцентные красители DAPI к ядру, Phalloidin - к цитоскелету и Wheat germ agglutinin - к мембране клеток, все красители фирмы Life technologies (США). Для этого исследуемые материалы после 8-дневного со-культивирования с ММСК окрашивали вышеуказанными красителями и осматривали под флуоресцентным микроскопом.
Для подтверждения жизнеспособности клеток на поверхности материалов проводили «эксплант-тест», заключающийся в перенесении материала на новую лунку с культуральной средой и отслеживании миграции клеток с материала на поверхность пластика. В качестве контроля использовали ММСК без материала.
Общее время культивирования составило 8 суток. Ежедневно проводили визуальные наблюдения во всех исследуемых группах. Визуально оценивали морфологию, характер роста клеточной культуры, наличие слущенных клеток в культуральной среде, их форму и размер, оценивали цитотоксический эффект, адгезию к материалу.
Контролем служила культура мезенхимальных клеток, где клетки имеют вытянутую веретенообразную форму, 2-4 отростка, гомогенную цитоплазму, чёткие границы, ядро расположено эксцентрично (рис. 7).
Исследование локального инеазиеного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза
Для оценки инвазивного локального воздействия полимерных эластичных магнитных имплантатов на структуры глаза нами было проведено клиническое и морфологическое исследование в эксперименте in vivo.
Исследования проводили на 24 глазах (12 кроликов) породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. Перед операцией всем кроликам промывали конъюнктивальную полость раствором фурацилина 1:5000. Всем кроликам в качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли 3-кратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Под контролем операционного микроскопа «Opton» CFC-6 (Германия) в области проекции верхней прямой мышцы, отступя 3 мм от лимба, проводили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 3-4 мм, выделяли верхнюю прямую мышцу. Далее, отступив от лимба 7 мм к склере, в верхнем сегменте нитью 5-0 Dacron (Alcon, США) подшивали полимерный эластичный магнитный имплантат толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм с лазерным зондом, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл. После чего лазерный зонд отрезали конъюнктивальными ножницами на уровне магнитного материала. ПЭМИ подшивали таким образом, чтобы 1А часть имплантата находилась под мышцей (12 глаз). В контрольной группе (12 глаз) аналогично имплантировали силиконовый материал (марки СЛ-150) без магнитного наполнителя. На конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon, Германия).
Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде проводили биомикроскопию на щелевой лампе фирмы «Carl Zeiss» (Германия), офтальмоскопию при помощи электрического офтальмоскопа фирмы «Heine» (Германия) через 1 сутки, 1 неделю, 1 и 3 месяца.
Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами
Всем кроликам в оба глаза за 30 мин до операции в конъюнктивальную полость инстиллировали 1-2 капли 1% раствора атропина и 1% тропикамида для достижения медикаментозного мидриаза. В качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли 3-кратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Перед операцией промывали конъюнктивальную полость раствором фурациллина 1:5000. Иммобилизацию животных производили путем тугого бинтования.
Хирургический инструментарий стерилизовали кипячением в течение 40 минут в дистиллированной воде. Режущие инструменты заливали 70 спиртом на 40 минут, после чего их переносили в физиологический раствор. Для проведения хирургического вмешательства использовали микроскоп Opton (CFC-6).
После установки блефаростата, отступя 3 мм от лимба, с помощью конъюнктивальных ножниц в нижнем сегменте проводили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 10 мм. Далее выделяли нижнюю прямую мышцу, брали ее на шов-держалку. Затем приступали к имплантации комплекса полимерного эластичного магнитного имплантата толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом, выполненным в виде тонкого оптоволокна с короткофокусной рассеивающей линзой на конце, подключающийся к источнику лазерного излучения (рис. 39). Конструкция данного комплекса позволяет имплантировать его эписклерально без подшивания, но так как задачей эксперимента было определить точку фиксации, данный комплекс подшивали. В нижнем сегменте на 7 ч, отступив от лимба 7 мм, комплекс ПЭМИ и лазерного зонда подшивали к склере, нитью 5-0 Dacron (Alcon).
В 3 мм от лимба в верхнем и верхне-наружном сегменте на 12 и 11 часах устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела для входа эндовитреального инструментария и инфузионной системы (рис. 40). Фиксировали инфузионную систему, вводили световод, витреотом и выполняли срединную витрэктомию. Суспензию объемом 0,02 мл, содержащую стволовые клетки (n 6000), меченные магнитными частицами, вводили субретинально в область лазерного пятна, полученного в результате диафаноскопии. Клетки вводили при помощи разработанного устройства для дозирования с иглой 25G, на конце которой расположена изогнутая канюля 41G с заточенным нижнем краем. Устройство для дозирования подробно описано в разделе 3.1.3. Для предотвращения выхождения клеток через ретинотомическое отверстие сразу после их введения в витреальную полость вводили газо-воздушную смесь, в количестве 1,0-1,2 мл.
По завершении эксперимента, лазерный зонд обрезали на уровне полимерного эластичного магнитного имплантата. На склеротомические отверстия и конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon). В послеоперационном периоде всем животным проводили инстилляции капель витабакт по схеме в течение 10 дней. Рис. 39. Эписклеральная фиксация ПЭМИ с лазерным зондом
Таким образом, разработанное устройство для субретинального введения стволовых клеток позволяет осуществлять точное дозирование объема клеточной суспензии, а разработанный хирургический способ -трансплантировать клетки в субретинальное пространство с наименьшей травматизациеи сетчатки и окружающих тканей, а также снизить риск выхода клеток в полость стекловидного тела. 3.4. Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами
На основании результатов эксперимента in vitro была получена клеточная культура НЕК-293, трансфецированная GFP-плазмидой и меченная магнитными частицами Dynabeads для субретинального введения, которая отвечала требованиям безопасности и сохранения жизнеспособности культуры. Также были созданы полимерные эластичные магнитные имплантаты с лазерным зондом для эписклеральной фиксации с различной индукцией магнитного поля и в эксперименте in vitro была определена оптимальная напряженность магнитного поля, равная 5 мТл и достаточная для удержания стволовых клеток, меченных магнитными частицами, в предполагаемой области введения в эксперименте in vivo. Для эксперимента in vivo и локального контролируемого введения стволовых клеток субретинально было разработано устройство для точного дозирования объема суспензии, вводимой в субретинальное пространство.
После выполнения хирургического вмешательства на 96 глазах 48 кроликов породы шиншилла, которые были разделены на опытную и контрольную группы по 48 глаз каждая (см. раздел 2.2.1), проведена оценка эффективности методики по данным результатов биомикроскопии, офтальмоскопии, ультразвукового исследования, оптической когерентной томографии, компьютерной томографии и морфологического исследования. 3.4.1. Результаты клинических наблюдений за экспериментальными животными Биомикроскопия
На первые сутки на всех прооперированных глазах в опытной и контрольной группах клиническая картина была схожей: отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, швы конъюнктивы и на склеральных отверстиях были адаптированы, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, влага передней камеры прозрачная, радужка структурная, зрачок округлый в центре. Хрусталик бы прозрачный на 39 глазах опытной группы и на 40 контрольной группы, помутнения выявлены на 3 глазах опытной группы и на 2 глазах контрольной группы, связанные с повреждением во время проведения хирургических вмешательств (рис. 41). Стекловидное тело прозрачно, рефлекс с глазного дна розовый.
К 3-м суткам инъекция глазного яблока на глазах и опытной, и контрольной групп была значительно уменьшена, но сохранялась, швы конъюнктивы и на склеральных отверстиях адаптированы, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, влага передней камеры прозрачная, радужка структурная, зрачок округлый в центре. Хрусталик сохранил свою прозрачность в 39 случаях опытной группы и в 40 -контрольной группы. Количество глаз с помутнениями хрусталика, связанными с повреждением во время проведения хирургических вмешательств, не изменилось. Стекловидное тело прозрачно, рефлекс с глазного дна розовый.
К 5-м суткам глаза в опытной и контрольной группах были практически спокойными. Швы конъюнктивы оставались адаптированными. Роговица была прозрачной, передняя камера средней глубины, влага передней камеры прозрачная, радужка структурная, зрачок округлый в центре, хрусталик прозрачный на 39 глазах опытной группы и на 40 контрольной группы. Помутнения сохранялись в 3 случаях опытной группы и в 2 случаях контрольной группы, связанные с повреждением во время проведения хирургических вмешательств. Во всех остальных случаях стекловидное тело было прозрачно, рефлекс с глазного дна розовый.
К 7-м суткам все прооперированные глаза выглядели спокойными. Швы конъюнктивы оставались адаптированными. Оптические среды оставались прозрачными, за исключением 3 глаз опытной группы и 2 глаз контрольной группы, где визуализировалось помутнение хрусталика, связанное с повреждением во время проведения хирургических вмешательств, рефлекс с глазного дна розовый.
На 10-е сутки и в последующие сроки наблюдения (14-е, 21-е сутки и 1 месяц) все прооперированные глаза оставались спокойными, ни в одном случае воспалительного процесса отмечено не было. Шовный материал практически не визуализировался в зоне разреза конъюнктивы и склеротомических отверстий. Оптические среды оставались прозрачными, за исключением 3 глаз опытной группы и 2 глаз контрольной группы, где визуализировалось помутнение хрусталика, связанное с повреждением во время проведения хирургических вмешательств (рис. 42), радужка структурная, зрачок округлый в центре, рефлекс с глазного дна розовый.
Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами
Таким образом, разработанная технология культивирования клеток НЕК-293 GFP с магнитными частицами является безопасной, эффективной и может использоваться в экспериментальной практике с целью маркировки или фиксации материала.
Проведенные исследования показали, что предложенный полимерный эластичный магнитный имплантат оригинальной конструкции является прочным и нетоксичным материалом. Эписклеральное расположение имплантатов вызывало у всех экспериментальных животных развитие умеренно выраженной воспалительной реакции. По данным морфологического исследования вокруг эписклерального ПЭМИ постепенно отмечено развитие фиброзной капсулы, с начальными признаками на 7-е сутки и окончательным формированием к сроку 1 месяц. Далее (до 3 мес.) пролиферативные явления сменялись склерозированием, что вызвало уплотнение капсулы, и к окончанию эксперимента она была представлена зрелой фиброзной тканью.
Таким образом, можно сделать заключение, что разработанный полимерный эластичный магнитный имплантат может применяться для экспериментальной офтальмологии.
По результатам клинических исследований в эксперименте in vivo при биомикроскопии в сроки наблюдения 1-3 суток в обеих группах отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, которая проходила к 5-м суткам. На всех сроках наблюдения швы конъюнктивы и склеротомических отверстий были адаптированы. Оптические среды были прозрачны, кроме 3 глаз в опытной группе и 2 - в контрольной, где визуализировалось помутнение в хрусталике, связанное с повреждением во время проведения хирургического вмешательства. Воспалительных явлений ни в одном случае не наблюдалось.
В 3 случаях опытной группы и в 2 - контрольной выполнение офтальмоскопии было затруднительно в связи с помутнением хрусталика. В остальных случаях по результатам офтальмоскопии на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки в зоне введения клеток, дефект сетчатки и сосудистой оболочки. К 3-м суткам отслойка сетчатки не визуализировалась, но дефект сетчатки и сосудистой оболочки сохранялся. В дальнейшие сроки наблюдения было сложно визуализировать место локального введения клеток.
По данным ультразвукового исследования на всех глазах опытной и контрольной групп на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки высотой 1,0-1,4 мм, которая к 3-м суткам уменьшилась до 0,4-0,7 мм, а к 5-м суткам полностью регрессирвала. Во все сроки наблюдения в обеих группах визуализировалась мелкодисперсная взвесь в стекловидном теле, в опытной группе - эхо-тень от магнита.
Данные КТ во всех случаях подтверждали расположение ПЭМИ в правом ретробульбарном пространстве в нижнє-латеральном квадранте. Левые орбиты были интактны, патологических очагов выявлено не было.
По проведенным клиническим исследованиям можно сделать заключение, что предложенная хирургическая методика локального субретинального введения клеточного материала, обладающего потенциальным терапевтическим эффектом, является контролируемой и малоинвазивной, риск травматизации тканей минимален в связи с возможностью визуализации места расположения ПЭМИ за счет диафаноскопии и разработанного устройства дозирования, осуществляющего деликатный доступ в субретинальное пространство.
По данным флюоресцентной микроскопии криосрезов энуклеированных глазных яблок, в первые сутки на всех 6 глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой, в стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были. На всех глазах контрольной группы были выявлены единичные клетки или группы клеток НЕК-293 GFP в полости стекловидного тела, не связанные с другими структурами глаза.
На 3-й сутки на всех глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались также в месте введения под сетчаткой. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что группа клеток, находящихся под сетчаткой, являются живыми. В группе контроля в 3 случаях из 6 в полости стекловидного тела были обнаружены скопления клеток НЕК-293 GFP, не связанные с другими структурами глаза, в остальных 3 случаях клетки НЕК-293 GFP обнаружены не были.
В сроки наблюдения 5, 7, 10, 14, 21 сутки в опытной группе клетки НЕК-293 GFP также располагались в месте их введения, но количество клеток снижалось на каждом последующем сроке наблюдения. К сроку 1 месяц клетки обнаружить не удалось ни в одном случае, но на всех 6 глазах наблюдалась присклеральная флюоресценция в зоне подшивания ПЭМИ. В контрольной группе в сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток и 1 месяц клетки не визуализировались.
В ходе проведенного морфологического исследования было выявлено, что предложенный способ субретинального введения клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, и эписклеральной фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата, является эффективным способом фиксации клеточного материала в месте его локальной имплантации сроком до 21 суток.
В результате анализа литературных данных, была найдена лишь одна работа по использованию стволовых клеток, меченных суперпарамагнитными частицами для направленной доставки клеточного материала в область сетчатки. Для этого авторы со-культивировали мезенхимальные стволовые клетки с суперпарамагнитными наночастицами и метили клетки маркером Qracker 655. В результате проведенных криогистологических срезов авторы получили достоверные данные о нахождении клеток во внутренних слоях сетчатки в области фиксации магнита только на сроке 1 неделя [175].
Таким образом, можно сделать заключение, что впервые разработан комбинированный хирургический способ локального субретинального введения клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, который является эффективным способом фиксации клеточного материала в зоне трансплантации на длительный срок, открывает возможности для пролонгирования действия клеток, обладающих терапевтическим потенциалом, в зоне локального повреждения и позволяет избежать в будущем осложнений, вызванных клеточной трансплантацией, таких как homing-эффект и туморогенный эффект.
